鄺志斌

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 珠海 519100)

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是由親心肌病毒感染導(dǎo)致的心肌局限性或彌漫性炎癥疾病[1]，最常見(jiàn)的病原是柯薩奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)。VMC感染心臟會(huì)通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生心肌損傷[2-3]，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類(lèi)(特別是兒童和青壯年)健康的心血管系統(tǒng)疾病。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是補(bǔ)氣補(bǔ)血的經(jīng)典名方之一，由黃芪和當(dāng)歸以5∶1組成，臨床上用其治療白細(xì)胞、血小板減少癥，療效顯著[3]。本研究通過(guò)比較不同處理組小鼠血清中血清乳酸脫氫酶(LDH)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清磷酸激酶同工酶(CK-MB)的含量以及小鼠心肌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)量，進(jìn)一步探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)VMC小鼠心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪、當(dāng)歸(均取自本院中藥房)，8周齡雄性BALB/C小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g(動(dòng)物購(gòu)自廣州中山大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心)，CVB3病毒液(購(gòu)于吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所)，LDH試劑盒、AST試劑盒、CK-MB試劑盒(購(gòu)自南京建成)，蘇木素染色液、伊紅染色液、RIPA蛋白裂解液(廣州藝佳生物)，VEGF單克隆抗體、羊抗小鼠IgG二抗(廣州優(yōu)迪生物)，ECL發(fā)光液(南京凱基)，倒置顯微鏡(明美)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥制備 當(dāng)歸補(bǔ)血湯以5∶1比例組成，藥物組成(均系干品)為黃芪30 g，當(dāng)歸6 g，浸泡2 h，先后加400 mL和200 mL自來(lái)水煮沸1 h和30 min，合并兩次藥液，紗布過(guò)濾，蒸發(fā)濃縮至30 mL得50%當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎劑。人體口服推薦量為30 mL/d，成人體重按60 kg計(jì)算，折合劑量0.5 mL/kg·bw，當(dāng)歸補(bǔ)血湯口服液低、中、高劑量分別2.5 mL/kg·bw、5.0 mL/kg·bw、15.0 mL/kg·bw(分別相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10、30倍)。取當(dāng)歸補(bǔ)血湯口服液25.0 mL、50.0 mL、150.0 mL加蒸餾水至200 mL，配成低、中、高劑量所需濃度。每天灌胃1次，灌胃體積為0.2 mL/10 g·bw，對(duì)照組予以等體積的生理鹽水，連續(xù)12 d。

1.2.2 模型制備：健康BALB/C小鼠，18～22g，共60只，隨機(jī)將60只小鼠分為正常組和模型組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯口服液低、中、高劑量組，每組12只。除正常組，各組小鼠均腹腔接種含100TCD50的CVB3病毒液0.1 mL，常規(guī)飼養(yǎng)，存活72 h以上小鼠為VMC模型。正常對(duì)照組小鼠腹腔接種等量不含病毒的Eagle氏液。當(dāng)歸補(bǔ)血湯口服液組以灌胃方式連續(xù)給藥12 d。對(duì)照組小鼠給予相同體積的蒸餾水。自感染病毒日起 ，逐日觀察小鼠發(fā)病和死亡情況。

1.2.3 動(dòng)物取材：每組隨機(jī)取小鼠6只，第13 d以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min，3000 r/min，離心15 min，分離得血清；將小鼠頸椎脫位，處死后取出小鼠心臟橫斷為兩部分，取上半部分心肌，用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色。將下半部分去掉右心室心肌后，取30 mg心尖部心肌放入超低溫冰箱(-80℃)，用于Western印跡法檢測(cè)。

1.2.4 小鼠血清LDH、AST、CK-MB含量測(cè)定：取小鼠血清嚴(yán)格按照LDH、AST、CK-MB試劑盒說(shuō)明用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定其活性。

1.2.5 常規(guī)HE染色：取小鼠上半部分心肌放入4%多聚甲醛固定、流水沖洗，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋等步驟后，制作5 μm 厚度切片，切片經(jīng)脫蠟、水化后，蘇木素染色3 min，在1%鹽酸-乙醇中分化，自來(lái)水中返藍(lán)30min，1%伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色：將組織切片脫蠟、水化，微波修復(fù)，3%的H2O2孵育，小鼠來(lái)源的VEGF 單克隆抗體(1∶500)作為一抗，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)(Elivision法)進(jìn)行染色，DAB顯色，蘇木素核復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。染色中以PBS 代替一抗作空白對(duì)照。

1.2.7 Western 印跡法：取30 mg心尖部心肌于冰浴上(4℃)，將心肌組織剪碎，加RIPA蛋白裂解液599 μL及苯甲基磺酰氟1 μL勻漿，超聲破碎后，在4℃下以離心半徑9.35 cm，12 000 r/min，離心40 min 取上清液，將樣品置于深凍冰箱(-80℃)保存，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提供方法測(cè)定蛋白濃度。將樣品中加入5×上樣緩沖液，上樣總體積為15 μL，上樣總蛋白量為80 μg，變性后，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉，小鼠抗大鼠VEGF單隆抗體 (1∶200)孵育，4℃過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌，多克隆山羊抗小鼠IgG二抗(1∶2000)室溫孵育，TBST緩沖液洗滌，滴加ECL發(fā)光劑進(jìn)行發(fā)光。使用ImageJ軟件分析各個(gè)條帶的灰度值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組小鼠生存情況

模型組小鼠于接種病毒后3 d活動(dòng)量減少，出現(xiàn)對(duì)刺激反應(yīng)淡漠，6～7 d左右出現(xiàn)對(duì)刺激反應(yīng)差或嗜睡，后肢癱瘓及共濟(jì)失調(diào)，11～12 d左右四肢腫脹，對(duì)刺激反應(yīng)極差，甚至死亡，具體統(tǒng)計(jì)情況見(jiàn)表1。模型組及各服用當(dāng)歸補(bǔ)血湯口服液組的小鼠生存率與正常組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 接種VMC病毒12天后各組小鼠生存率

2.2 免疫組化結(jié)果

通過(guò)免疫組化觀察VEGF的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行光密度分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，小鼠感染VMC病毒后，VEGF表達(dá)量顯著低于正常組。在給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯的治療后，低、中、高劑量組小鼠內(nèi)VEGF的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 不同處理組免疫組化圖

圖2 免疫組織病理分析

2.3 小鼠血清LDH、AST、CK-MB表達(dá)量測(cè)定

模型組小鼠在感染VMC病毒后，血清LDH、AST、CK-MB表達(dá)量急劇上升，與正常組存在顯著差異(P<0.05)。在灌胃高劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯后，LDH、AST、CK-MB表達(dá)量均顯著降低，其中CK-MB的表達(dá)量與正常組無(wú)明顯差異。見(jiàn)表2。

表2 血清LDH、AST、CK-MB含量測(cè)定±s)

注：a模型組與正常組比較P<0.05；b不同劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯組與模型組比較P<0.05。

2.4 VEGF表達(dá)量檢測(cè)

利用Western blot：檢測(cè)VEGF表達(dá)量見(jiàn)圖3。由下圖可以看出，正常組小鼠VEGF的表達(dá)量顯著高于模型組小鼠；而在給感病小鼠灌胃低、中、高三份不同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯后，小鼠內(nèi)VEGF的表達(dá)量逐漸上升，高于模型組，低于正常組。見(jiàn)圖3。

圖3 western blot 檢測(cè)VEGF表達(dá)量注：圖A為蛋白條帶圖，1～5分別為模型、正常、低、高、中組。圖B為灰度分析。

3 討論

VEGF也稱(chēng)血管滲透因子，是1989年Ferrara在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)液中析出的一種糖蛋白。其具有多種生理效應(yīng)，包括促進(jìn)血管生成，舒張血管，提高血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及提高細(xì)胞生存力等。大量研究表明VEGF參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，關(guān)于在心血管疾病中的發(fā)病機(jī)制及臨床應(yīng)用的研究也日益受到關(guān)注。VEGF是一種有絲分裂原，能結(jié)合、激活兩個(gè)主要的內(nèi)皮特異性受體：KDR 和FIT-1。KDR和FIT-1可以激活內(nèi)皮細(xì)胞的許多信號(hào)傳導(dǎo)通路，以此來(lái)激活內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移和一氧化氮合酶(NOS)的釋放，調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、遷移、分化和凋亡，影響機(jī)體的心血管系統(tǒng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及側(cè)支循環(huán)的生成及受傷后組織的修復(fù)。

心肌炎(myocarditis)是心肌本身的炎癥病變，可分為感染性和非感染性?xún)纱箢?lèi)。感染性可由細(xì)菌、病毒、螺旋體、立克次體等病原微生物引起。其中VMC的發(fā)病率較高。非感染性由過(guò)敏、化學(xué)、物理或藥物等因素引起。VMC是病毒在心肌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制從而引起心肌細(xì)胞溶解并引發(fā)一系列心肌組織的自身免疫反應(yīng)。何學(xué)華等[4]研究顯示，VMC心肌組織VEGF mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可能是由于發(fā)生心肌炎時(shí)，一方面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、廣泛的血管痙攣引起血管管腔狹窄甚至閉塞；另一方面有病原體對(duì)血管的直接損傷，這些均導(dǎo)致繼發(fā)性心肌缺血缺氧的發(fā)生，從而刺激VEGF生成增加，并且隨著炎癥細(xì)胞增加，其分泌的VEGF亦增多。另外，從骨髓動(dòng)員的干細(xì)胞亦分泌大量VEGF。有研究表明早在CVB3感染后第3 d，即有心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[5]，提示VEGF在早期即促發(fā)了心臟修復(fù)工程。Plttenger等的研究發(fā)現(xiàn)，即在急性VMC的早期階段，細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞會(huì)觸發(fā)損傷的修復(fù)過(guò)程，且提示VEGF可能參與了這一修復(fù)過(guò)程。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯是金元時(shí)代李東垣所創(chuàng)造的益氣補(bǔ)血方劑，由黃芪和當(dāng)歸兩味藥以5∶1比分組成，具有益氣生血功效，多用于治勞倦內(nèi)傷，氣血虛，陽(yáng)浮于外之虛熱證。臨床上關(guān)于當(dāng)歸補(bǔ)血湯的研究很多，岳運(yùn)霞等在研究不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯膜提取物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響中發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯膜提取物能明顯促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管新生。劉清君等[6]在探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療缺血性疾病的作用機(jī)制時(shí)指出這可能與當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物能夠明顯促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管新生有關(guān)。楊麗霞等[7]在對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸、黃芪注射液在1:5 的配伍時(shí)促進(jìn)CAM 血管生成作用最強(qiáng)，其可能的機(jī)制是血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移。王嬪等[8]研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有顯著的促進(jìn)衰老心肌梗死大鼠冠狀動(dòng)脈側(cè)枝血管生成作用，其作用機(jī)制可能與提高VEGF、NO水平有關(guān)。

在心血管領(lǐng)域，對(duì)當(dāng)歸補(bǔ)血湯的研究主要在缺血性心臟病方面，而對(duì)VMC心肌組織VEGF的影響則報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)VMC小鼠模型采用不同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)，觀察記錄VMC小鼠心肌組織VEGF的免疫組織化學(xué)染色及 Western 印跡法檢驗(yàn)結(jié)果，從而評(píng)價(jià)當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)VMC小鼠心肌的保護(hù)作用及對(duì)心肌組織VEGF的影響。

[1] 孫景輝，翟淑波.病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].臨床兒科雜志，2012，30(7)：607-612.

[2] BLAUWET L A,COPPER L T.Myocarditis Progress in cardiovascular diseases[J].2010(52):274-288.

[3] ROSE N R.Myocarditis infection versus autoimmunity[J].Journal of Clinical Immunology.2009(29):730-737.

[4] 何學(xué)華，李文娟，袁勇華，等.黃芪與VitC對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響[C]，中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十七次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編(上冊(cè))，2012.

[5] LIN Y，ZHAI E，LIAO B.Autocrine VEGF signaling proliferation through a PLC-dependent pathway and modulates Apatinib treatment afficacy in gastric cancer[J].Oncotarget,2017.

[6] 劉清君，李應(yīng)東.當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(4)：420-421.

[7] 楊麗霞，豆伍應(yīng)，顏春魯，等.當(dāng)歸、黃芪注射液對(duì)雞胚絨毛尿囊膜模型的毒性研究[J]，中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15(5)：46-48.

[8] 王嬪，李丹，田昕.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)衰老心肌梗死大鼠冠狀動(dòng)脈側(cè)枝血管生成的影響及其機(jī)制[J]，醫(yī)藥衛(wèi)生科技，2016(7)：214-216.