韓金霞，梁兆光

(1.大慶油田總院心內科，黑龍江 大慶 163000；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內七科，黑龍江 哈爾濱 150001)

肝細胞生長因子 (Hepatocyte growth factor，HGF)，是一種分泌型肝素親和糖蛋白，是心肌營養(yǎng)因子和特異的促內皮細胞生長因子，能夠促進新生血管的形成。HGF明顯促進VEGF(血管內皮生長因子)的mRNA表達，兩者在促血管生成方面具有協同作用[1]。文獻報道，在兔、小鼠缺血模型中，HGF能刺激新生血管生成，在體內和體外試驗中，HGF的血管生成活性被證實比血管內皮生長因子及堿性成纖維細胞生長因子更為強大[2-3]。有報道稱[4]，在大鼠心肌梗死模型中，HGF過度表達能刺激血管新生和側支血管形成。兔肝細胞生長因子(rabbit hepatocyte growth factor，RABHGF) 是首次擴增出的兔HGF基因序列，已在genbank中發(fā)表。本實驗獲得了兩種全長的兔HGF cDNA序列，利用軟件和生物信息學站點進行分析，為今后利用兔HGF進行基因研究提供更多的信息。

1 材料與方法

2007年本課題組通過5′-Race和3′-Race法和重組PCR法成功獲得了未知的兔肝細胞生長因子的基因序列，獲得了兩種全長的兔HGF cDNA序列，命名為兔HGF-1和兔HGF-2，已被Genbank收錄，編號分別為EU128740和FJ237417。利用計算機軟件Gene Runner和DNAStar及生物學信息站點，對兔HGF cDNA序列進行分析和比較，并對編碼的蛋白質氨基酸序列進行分析和預測。

2 結果

2.1 兔HGF的cDNA序列及其分析

兔HGF-1由2299個堿基對組成，編碼了762個氨基酸；兔HGF-2由2320堿個基對組成，編碼了769個氨基酸。人HGF基因cDNA序列為2184bp，編碼1條含728個氨基酸，具有4個糖基化位點、4個kringle環(huán)，分子量為83KD的多肽鏈。通過比較不同的HGF的cDNA克隆后發(fā)現，存在多種HGF的mRNA的轉錄本，經過不同的拼接，導致了不同的HGF變種[5]。例如：人HGF是由1條含有728個氨基酸的單鏈前體蛋白裂解而來的異質二聚體，單鏈HGF和異質二聚體形式具有相等的生物活性[6]。兔HGF-2的cDNA在第854位堿基處較兔HGF-1的cDNA有1個21堿基片段(GAAGCCGTTATTTTGCAAGAG)的插入，使推導的兔HGF-2氨基酸序列在285位殘基處較兔HGF-1多7個氨基酸(GSRYFAR)。通過Gene Runner分析表明，在兔HGF-2氨基酸序列的285～292位置附近并不存在特殊的蛋白質功能基序。將兔HGF-1的cDNA與兔HGF-1的cDNA核酸序列用DNAStar的Clustal V方法進行比較發(fā)現二者相似性為99.8%；而用Jotun Hein和Clustal W方法比較二者相似性為100%。兔HGF-1與兔HGF-2的氨基酸序列進行比較發(fā)現二者相似性為；用Jotun Hein方法比較為100%，用Clustal V方法比較為99.1%，用Clustal W方法比較為99.9%。因此，推斷兔HGF-1和兔HGF-2二者編碼蛋白質的活性是相似或者相同的，或者推斷出兔HGF-1和兔HGF-2基因序列是兩種極為相似的變種。

兔HGF-1蛋白和兔HGF-2蛋白都缺失了FLPSS分子。FLPSS分子是pro-HGF的自然變種，因在其編碼區(qū)缺失15bp，故在Kringle 1區(qū)缺失了5個氨基酸。但這一缺失不影響其分泌后的加工，仍可被酶切為少于5個氨基酸的雙鏈HGF形式。與全長的pro-HGF分子比較，FLPSS分子存在數量少，與肝素的親和力略有降低，其他性質基本一致[6]。通過DNAStar軟件對genbank中公布的鼠HGF mRNA序列(GI:170172521，GI:220766，GI:220437)的比較發(fā)現，鼠HGF mRNA(GI:170172521，GI:220766)兩個序列里含有FLPSS分子，鼠HGF mRNA (GI:220437)的序列也存在了FLPSS分子的缺失。

2.2 兔HGF蛋白質序列的同源性分析及比較

利用核酸分析軟件DNAStar，將兔HGF的測序結果與已知的人HGF(2187bp)[GI:2171032]和鼠HGF(2189bp)[GI:220437]序列進行了同源性分析。將兔HGF-1和人HGF的核酸序列進行比較后發(fā)現，二者同源性為89.3%，其推導的氨基酸序列同源性為91.4%。此外，兔HGF-1和鼠HGF核酸序列同源性為86.8%，推導的氨基酸序列同源性為92.0%。將兔HGF-2和人HGF的核酸序列進行比較后發(fā)現，二者同源性為89.1%，其推導的氨基酸序列同源性為90.9%。此外，兔HGF-2和鼠HGF核酸序列同源性為86.6%，推導的氨基酸序列同源性為91.6%。

2.3 蛋白質各組成及疏水性分析

兔HGF-2序列片段全長2320個堿基對，含有2202個堿基對組成的最大開放閱讀框架及118bp組成的3'非翻譯區(qū)。為了更加全面地統計各參數，用expasy中的工具ProtParam，結果如下：氨基酸數目：769個； 分子量：87483.1；等電點：8.76；pH值:2.5；負電荷殘基總數(Asp+Glu)：82；正電荷殘基總數(Arg+Lys)：103；分子式：C3859H5993N1091O1122S58；原子總數：12123；半衰期：30h；不穩(wěn)定系數：31.73，該蛋白分類為穩(wěn)定蛋白；脂肪系數：67.15；Grand average of hydropathicity (GRAVY)親水性評估：-0.606，該蛋白為親水蛋白。

2.4 蛋白質功能基序分析

應用Gene Runner對兔HGF-2蛋白進行分析，分析提示：其分子內部含有一特殊結構RGD。RGD是促進細胞粘附的蛋白質中的特有結構，圍繞RGD的序列都是可變的，但RGD序列本身卻是高度保守的。識別RGD序列的整合素有α3β1、α5β1、IIb/β3等。1個cAMP-/cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點；2個酪氨酸激酶(Tyr)磷酸化位點；3個N-糖基化位點；4個kringle環(huán)；9個酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化位點；10個N-豆蔻?；稽c；含12個蛋白質激酶C(PKC)磷酸化位點。

2.5 蛋白質亞細胞定位預測

通過工具PSORT進行預測，結果如下：細胞外質，包括細胞壁：13.0%；線粒體：21.7%；液泡結構：4.3%；胞核：47.8%。細胞質：8.7%；細胞骨架：4.3%。

2.6 蛋白質信號肽及酶切位點預測

通過采用基于神經網絡(NN)的算法和隱藏的馬爾可夫模型(HMM)預測兔HGF-2蛋白質的信號肽及其切割位點，結果表明，兔HGF-2蛋白具有一段由32個氨基酸組成的信號肽。信號肽概率：0.990；信號錨定概率：0.008。最大可能切割位點：0.763 其切割位點可能位于32-33AA(AEG-QK)之間。見圖1。

2.7 蛋白酶切位點預測

通過工具Peptide Cutter進行預測，結果發(fā)現，共有如下蛋白酶對兔HGF 2蛋白有酶切作用：精氨酸-C蛋白水解酶、Asp-N內切酶、Asp-N內切酶+N端亮氨酸、BNPS-Skatole、細胞凋亡蛋白酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、高特異性糜蛋白酶、低特異性糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、CNBr、腸激酶、顆粒酶B、凝血因子Xa、甲酸、谷氨酰基肽鏈內切酶、鹽酸羥胺、氧代苯甲酸、LysC、LysN、NTCB、胃蛋白酶(pH1.3)、胃蛋白酶(pH>2)、脯氨酸肽鏈內切酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、煙草蝕紋病毒酶、嗜熱菌蛋白酶和凝血酶，及胰蛋白酶等。

圖1 兔HGF1蛋白質信號肽預測 注：A:NN(神經網絡)算法；B:HMM(馬爾可夫模型)算法

2.8 蛋白質跨膜區(qū)預測

為了更直觀的顯示兔HGF-2蛋白是否具有跨膜區(qū)，借助網站預測結果：ExpAA=19.92，該數值大于18；First 60 AAs=19.88，該數值大于10；PredHel=1；Topology=i7-29o，拓撲結構(跨膜螺旋)位于膜內側，氨基酸位置是7-29。見圖2。

圖2 兔HGF-2蛋白質跨膜區(qū)預測

3 討論

通過Gene Runner分析和DNAStar的Clustal V方法推斷兔HGF-2和兔HGF-1二者編碼蛋白質的活性是相似或者相同的。因此，以兔HGF-2蛋白為例進行比較全面的蛋白序列分析。兔HGF-2通過generuner分析表明，其具有3個糖基化位點、4個kringle環(huán)，分子量為87KD的多肽鏈，兔HGF蛋白半衰期為30h，屬于穩(wěn)定的親水蛋白。預測兔HGF-2蛋白是否具有跨膜區(qū)，ExpAA=19.92，該數值大于18，說明這個蛋白結構中更可能存在跨膜蛋白，或者說有一個信號肽；First 60 AAs=19.88，該數值大于10，說明這個蛋白結構中在N-端可能存在信號肽；PredHel=1預測這個蛋白結構中可能存在1個跨膜蛋白。總結比較已報道的不同的哺乳動物的HGF，雖然它們均有促進肝細胞生長和增殖的功能，但在來源、分子量和性質等方面有較大差異[7]。

HGF 是一種具有多種生物學功能的細胞因子，如促細胞分裂劑、促細胞運動劑和促形態(tài)形成劑等作用[8]。HGF通過結合到c-Met受體而作用于多種類型靶細胞，包括內皮細胞，并能誘導非內皮細胞釋放其他的內皮細胞分裂原，是強有力的血管新生的刺激因子[9]。蔣逸風等[10]實驗研究提示，HGF可能主要通過促進血管內皮細胞增殖，加速內皮系愈合而間接抑制血管平滑肌細胞的增殖，從而起到預防再狹窄的作用。

本研究表明，兔HGF基因可轉染至COS-7細胞并分泌表達兔HGF蛋白，對細胞具有促進細胞生長的生物學活性，從而利用兔HGF基因和已建立的兔心肌缺血模型進行下一步缺血性心臟病的基因治療實驗研究。

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[5] 俞水亮，楊復華.肝細胞生長因子的分子生物學研究[J].生物工程學報，2002，18(1)：1-4.

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