張 捷，王 琳，霍江蓮，楊向瑩，暢曉暉，李小林，張 園，陳廣全

(1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,北京 100026；2.出入境食品安全檢測北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100026；3.國際檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)法規(guī)研究中心,北京 100028；4.中國合格評定國家認(rèn)可中心,北京 100162；5.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心,天津 300308)

諾如病毒(norovirus，NVs)又稱諾羅病毒、諾沃克病毒或膿融病毒。近年來，食源性病毒是嚴(yán)重威脅人類健康的危險(xiǎn)因子之一，特別是諾如病毒和輪狀病毒是引起世界范圍內(nèi)流行性胃腸炎暴發(fā)的主要因素[1-3]。諾如病毒感染流行大多源于水或某種食物的污染，特別是牡蠣、蛤等貝類水產(chǎn)品引起的感染。其基因組為單股正鏈RNA，根據(jù)VP1序列的同源性，諾如病毒可分為GI～GV5個(gè)基因群(Genogroup)，其中引起人類感染的主要是GI和GII群，基因群可進(jìn)一步分為不同的基因型(Genotype)[4]。自1995～1996年諾如病毒首次導(dǎo)致世界性大流行以來，GII群中的第四基因型GII.4一直在世界范圍內(nèi)的流行中占據(jù)主導(dǎo)地位。

目前，雖然很多研究建立了諾如病毒的檢測方法，但缺乏諾如病毒監(jiān)測的統(tǒng)一高效的病毒濃縮、檢測、確證等標(biāo)準(zhǔn)檢測方法?；趥鹘y(tǒng)的檢測方法耗時(shí)費(fèi)力，無法快速有效地降低食源性疾病的發(fā)生率，我們急需建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測技術(shù)、研發(fā)高效的快速檢測試劑盒。近紅外免疫層析技術(shù)(near-infrared immunochromatographic techniques)是將近紅外熒光與免疫層析法相結(jié)合的一種新型免疫層析技術(shù)。近年來，近紅外免疫法鑒于其背景干擾小、組織穿透力強(qiáng)等突出的優(yōu)點(diǎn)，在生物、醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注[5-7]。本研究通過研制近紅外免疫層析試紙條及配套標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，針對GⅡ型諾如病毒建立一種近紅外熒光免疫層析快速檢測方法，以期進(jìn)一步提高諾如病毒快速檢測的靈敏度和特異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GⅡ型諾如病毒(由中國疾控中心病毒病研究所提供)；羊抗雞IgY(上?；墼派锟萍加邢薰?；鼠抗諾如病毒衣殼蛋白單克隆抗體(購自Pierce公司)。兔抗諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體(由中國疾控中心病毒病研究所提供)；稀釋液(5%BSA，0.1%Tween 20,PBS)；熒光染料dylight 800由武漢珈源量子點(diǎn)開發(fā)有限公司提供；10×PCR緩沖液：TaqDNA聚合酶；DNA提取試劑盒；PCR擴(kuò)增引物：引物序列為P1：5’-ATACCACTATGATGCAGATTA -3’，P2：5’-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3’；探針序列為5’-FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-TAMRA-3’，用滅菌去離子水配制，濃度為10mmol/L(所有引物均由上海生工合成，其中諾如病毒RNA的檢測采用 Ta Ka Ra 公司的 Premix Ex Taq TM (Probe qPCR),試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司提供)。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫?fù)u床(江蘇太倉實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)、高速低溫離心機(jī)(Sigma，3-18K)、超純水儀(Thermo)、高壓滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、便攜式高靈敏度近紅外點(diǎn)熒光掃描儀(北京博潤福得科技發(fā)展有限公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 近紅外熒光染料標(biāo)記病毒單抗：將兔抗諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體用劃膜液稀釋為1.5 mg/mL作為劃膜抗體。將鼠抗諾如病毒衣殼蛋白單克隆抗體用PBS稀釋為1 mg/mL,,取100 μL，加入7 μL熒光染料 dylight 800,渦旋混勻后于室溫避光靜置1 h，1 h后加入100 μLPBS稀釋混勻，終濃度為0.5 mg/mL做為標(biāo)記抗體,將標(biāo)記抗體放入透析袋，于PBS中4 ℃過夜透析，回收抗體作為最終標(biāo)記抗體。

1.3.2 諾如病毒免疫層析試紙條的制備：試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維質(zhì)膜(NP膜)、吸水紙及試紙板組成，按次序依次搭接，而后以切割機(jī)切成試紙條。以羊抗雞 Ig Y為質(zhì)控抗體(C線)，用劃膜液稀釋為1 mg/mL,將兔抗諾如病毒多克隆抗體(劃膜抗體)1.5 mg/mL作為檢測線(T線)。將羊抗雞Ig Y抗體和兔抗諾如病毒多克隆抗體用劃膜儀劃于NP膜上，C，T線間距為0.5 cm，且C、T線中線于NP膜中線重合。室溫放置3 h，粘貼吸水紙，金標(biāo)墊，樣品墊，進(jìn)行切條。如圖1所示。

圖1 基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的諾如病毒免疫層析試紙條示意圖 注：1.樣品墊；2.結(jié)合墊；3.硝酸纖維素膜；4.檢測線；5.質(zhì)控線；6.吸水墊；7.底板。

1.3.3 定性檢測：標(biāo)記抗體鼠抗諾如病毒單抗用層析緩沖液1∶50稀釋，羊抗雞抗體IgY 1∶2000稀釋(濃度0.5 mg/mL) ，鼠抗諾如病毒單抗與IgY 1∶1(90 μL+90 μL)稀釋得混合液，將諾如病毒稀釋，每100 μL病毒稀釋液+4 μL混合液，渦旋混勻，滴加至試紙條，室溫放置15 min后，用便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。若檢測線區(qū)域和質(zhì)控區(qū)域同時(shí)出現(xiàn)熒光峰為陽性結(jié)果。

1.3.4 特異性實(shí)驗(yàn)：在無菌條件下，分別取實(shí)驗(yàn)室分離的腸道病毒EV71、腺病毒、輪狀病毒原液稀釋，吸取30 μL加70 μL層析液和4 μL混合液滴加到樣品墊上，室溫放置15 min后，用便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。

1.4 評價(jià)方法

1.4.1 RT-PCR檢測方法：(1)按照《SN/T 1635-2005貝類中諾沃克病毒檢測方法,普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法》[6]對來自實(shí)驗(yàn)室的15份貝類樣品(樣品包括貝、螺絲、蟶子等)進(jìn)行樣品前處理。(2)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR，采用諾如病毒試劑盒試劑盒：sureFast Norovirus/Hepatitis A 3plex。見表1。

表1 諾如病毒實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系 μL

1.4.2 染毒實(shí)驗(yàn)組貝類樣品的處理：取未檢出諾如病毒的貝類樣品消化腺0.5 g，研缽研磨，用3.5 mL甘氨酸(pH值為9.6)緩沖液研磨樣品,分別在2 mL研磨液中加入20 μL病毒上清，另取1 mL研磨液不加病毒加至EP管，同時(shí)對照組為1 mg/mLBSA溶液。采用12 500 g，離心30 min(室溫離心)，離心后用0.45 μm過濾膜過濾。各取800 μL，用濃縮管濃縮至于60 μL(12 000 r/min,20 min)。各取30 μL濃縮液加70 μL層析，再加4 μL混合液，用諾如病毒試紙條進(jìn)行免疫層析。

1.4.3 近紅外免疫層析試紙條檢測實(shí)際樣品:按照所建立的近紅外免疫層析法，對來自實(shí)驗(yàn)室的15份樣品(與1.4.1的15份樣品一致)進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果進(jìn)行比較。(1)貝類樣品諾如病毒的富集：按照1.4.2建立的方法，15份樣品分別取貝類消化腺0.5 g，加3.5 mL勻漿液，充分研磨。采用離心機(jī)12 500 g，離心30 min(室溫離心)，離心后用0.45 μm過濾膜過濾。15份樣品各取800 μL，用超濾濃縮管濃縮至于60 μL左右(12 000 r/min,20 min離心)。(2)檢測：15份樣品各取30 μL濃縮液加70 μL層析液，再加4 μL 混合液滴加到樣品墊上，室溫放置15 min后，用便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。分別作兩個(gè)平行試驗(yàn)。

1.4.4 膠體金法：采用RIDA QUICK Norovirus諾如病毒抗原快速檢測試劑卡檢測15份樣品。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 諾如病毒定性檢測結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用近紅外熒光染料標(biāo)記的雙抗體夾心免疫層析試紙條檢測諾如病毒。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檢測中所使用的近紅外熒光染料為發(fā)射波長位于777 nm的有機(jī)分子，優(yōu)選活化的近紅外熒光染料DyLight 800。所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的諾如病毒免疫層析試紙條，低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為650～1000 nm。分別測定檢測線4和質(zhì)控線5區(qū)域的熒光強(qiáng)度，若質(zhì)控線5區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若檢測線4區(qū)域同時(shí)出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。陽性結(jié)果見圖2。

圖2 諾如病毒低噪聲激發(fā)式熒光檢測

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

分別將腸道病毒EV71，腺病毒、輪狀病毒、甲肝病毒原液用層析液稀釋，加入試紙條進(jìn)行檢測。輪狀病毒W(wǎng)A、輪狀病毒SALL、腸道病毒EV71、腺病毒、甲肝病毒與諾如病毒試紙條均無交叉反應(yīng)。檢測結(jié)果見圖3。

圖3 諾如病毒試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果 注：從左到右依次為諾如病毒、輪狀病毒W(wǎng)a、輪狀病毒SALL、腸道病毒EV71、甲肝病毒、腺病毒病毒。

2.3 實(shí)際樣品的近紅外熒光法檢測結(jié)果

15份貝類樣品經(jīng)過樣品前處理和病毒富集后，各取50 μL樣品稀釋液加50 μL層析液，再加4 μL mix滴加到樣品墊上，室溫放置15min后，用便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。(分別作2個(gè)平行試驗(yàn))檢測結(jié)果除B1為陽性外，其余14份樣品均為陰性(圖4、圖5)。圖3顯示樣品B1檢測峰值為2400。

圖4 實(shí)際樣品B1近紅外熒光法檢測結(jié)果

2.4 近紅外免疫層析法與熒光RT-PCR、膠體金法比較

按照《SN/T 1635-2005 貝類中諾沃克病毒檢測方法 普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法》對來自實(shí)驗(yàn)室的15份貝類樣品(樣品包括貽貝、螺絲、蟶子等)進(jìn)行檢測。僅樣品B1近紅外檢測結(jié)果與其他兩種方法不一致，其余結(jié)果均相符。近紅外熒光法與其他兩種方法的符合率達(dá)到93.3%。見表2。

圖5 實(shí)際樣品B2近紅外熒光法檢測結(jié)果

序號熒光RT-PCR近紅外免疫法膠體金法符合性B1陰性陽性 陰性不一致B2陰性陰性陰性一致B3陰性陰性陰性一致B4陰性陰性陰性一致B5陰性陰性陰性一致B6陰性陰性陰性一致B7陰性陰性陰性一致B8陰性陰性陰性 一致B9陰性陰性陰性 一致B10陰性陰性陰性一致B11陰性陰性陰性一致B12陰性陰性陰性一致B13陰性陰性陰性一致B14陰性陰性陰性一致B15陰性陰性陰性 一致

3 討論

諾如病毒是全球范圍內(nèi)引起人類急性腸胃炎的最重要病原之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，不僅因其高度變異，而且具有傳染性和抵抗力的新變異重組株將會導(dǎo)致全球的流行。近年來，每年都有多起因食用貝類而引起諾如病毒胃腸炎暴發(fā)的報(bào)道。2006年年底日本諾如病毒胃腸炎暴發(fā)流行，2個(gè)月內(nèi)感染諾如病毒以兒童為主的患者高達(dá)303.9萬人。 2007-12—2008-01間英國感染諾如病毒患胃腸炎的人數(shù)高達(dá)200萬人。隨著我國對諾如病毒檢測技術(shù)的深入發(fā)展，近年來該病毒引起急性胃腸炎暴發(fā)的報(bào)道逐漸增多，特別是在北京、河北、廣東、廣西、浙江等地相繼爆發(fā)[8-12]。

由于諾如病毒不能進(jìn)行細(xì)胞和組織培養(yǎng)，也沒有合適的動物模型，其檢測方法受很大限制。目前用于該病毒的檢測方法主要有電鏡法、免疫學(xué)法及分子生物學(xué)法。電鏡檢測法具有直接、可靠的優(yōu)點(diǎn)，但檢測靈敏度較低，通常糞便標(biāo)本病毒滴度達(dá)到106/g才能達(dá)到檢測要求。現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)，雖然在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學(xué)方法無可比擬的優(yōu)勢，且無需特殊儀器設(shè)備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應(yīng)用開發(fā)前景。但該法存在標(biāo)記物的穩(wěn)定性較差、顏色單一、靈敏度較低、受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，標(biāo)記靈敏度有限且無法實(shí)現(xiàn)精確定量的缺點(diǎn)。諾如病毒的免疫學(xué)檢測發(fā)展較快，目前至少有3 種免疫學(xué)檢測試劑盒進(jìn)入市場，其中包括德國的 RIDASCREEN試劑盒、英國的 IDEIA 試劑盒與日本的SRSV (Ⅱ) -AD試劑盒。Castriciano 等[13]通過檢測 228 份諾如病毒陽性腹瀉樣本，對三者的靈敏度、特異性等方面進(jìn)行了詳細(xì)的比較，研究表明，RIDASCREEN的檢出率為80.3% ，IDEIA 的檢出率為 60.6% ，SRSV (Ⅱ) -AD的靈敏性和特異性為 36.4% 和96.9% 。

近年來流行病學(xué)資料表明，諾如病毒是美國最普遍的食源性病毒[14-15]。免疫磁珠分離法具有分離樣品快速、特異性強(qiáng)、操作簡單和儀器設(shè)備簡單等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分離、病原體檢測等領(lǐng)域，但限制免疫磁珠分離法在諾如病毒檢測方面應(yīng)用的主要原因是諾如病毒的抗原變異性，很難用一種或少數(shù)幾種抗體富集所有的諾如病毒。吳清平等[16]采用單克隆抗體免疫磁珠結(jié)合RT-PCR法可檢測到 10-7稀釋度的樣本，而多克隆抗體免疫磁珠結(jié)合RT-PCR 法只能檢測到10-5 稀釋度的樣本，前者的靈敏度比后者高 100 倍，表明單克隆抗體包被免疫磁珠進(jìn)行諾如病毒富集檢測具有更好的優(yōu)勢。Gilpatrick等[17]建立了免疫磁性捕獲反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (IMC/RT-PCR)檢測諾如病毒，特異性和靈敏度均較高。Shinichi Kobayashi等[18]用桿狀病毒表達(dá)的諾如病毒重組衣殼蛋白抗體包被磁珠捕獲和濃縮食物中的諾如病毒，進(jìn)行RT-PCR 檢測。免疫磁珠分離法操作簡便、不需要特別的設(shè)備、耗時(shí)短、 減少了 PCR 的干擾物質(zhì),適用于食物樣品中諾如病毒的檢測。

本研究基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的諾如病毒免疫層析試紙條，其發(fā)射光譜位于低噪聲激發(fā)式區(qū)域(波長為650～1100 nm)的低噪聲激發(fā)式熒光探針具有較高的信噪比，并由此保障了其高檢測靈敏度，同時(shí)由于生物基體極少在低噪聲激發(fā)式光譜區(qū)自發(fā)熒光，使得基于此類探針標(biāo)記的分析檢測免受背景熒光干擾；因散射光強(qiáng)度與波長的四次方成反比，發(fā)射光位于長波區(qū)的低噪聲激發(fā)式熒光探針受其干擾小?；诘驮肼暭ぐl(fā)式熒光染料標(biāo)記的免疫層析體系對靶標(biāo)病毒的靈敏度與實(shí)時(shí)熒光PCR法相近，檢測限低于膠體金法。本方法所涉及的免疫層析試紙條及低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀均屬于便攜可移動裝置，且整個(gè)檢測過程可在45 min內(nèi)完成，適用于現(xiàn)場、即時(shí)、快速檢測，相對于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等分子生物學(xué)方法則在儀器的檢測速度、便攜性及現(xiàn)場適用性上呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢。

綜上所述，本研究采用量子點(diǎn)作為標(biāo)記，采用免疫層析技術(shù)制備靶向于諾如病毒的免疫層析試紙條，檢測時(shí)采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測線，以檢測線熒光強(qiáng)度檢測值實(shí)現(xiàn)樣本的定性檢測，該試紙條適用于食品中諾如病毒的即時(shí)檢測，具有快速、高效及便攜的優(yōu)點(diǎn)。

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