牛國敏，張復(fù)華，楊國雷，凌奕文，潘煥玉，于嗣儉，徐嘉愉，麥秀渠

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院血液科，廣東 佛山 528200)

槲皮素(Quercetin)是自然界中分布最廣泛的植物黃酮類化合物，具有抗氧化、抗過敏、抗血栓、抗血小板聚集和神經(jīng)保護(hù)等作用[1]。近年來發(fā)現(xiàn)槲皮素對包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞有生長抑制作用，是有希望的新型天然低毒抗腫瘤藥物。研究表明槲皮素可以通過激活磷酸腺苷活性激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygense-2，Cox-2)途徑抑制胰腺癌、乳腺癌、及急性白血病細(xì)胞增殖[2]，在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562是否有類似的作用仍是未知。本實驗擬通過研究槲皮素對K562細(xì)胞增殖的影響明確槲皮素抗慢性粒細(xì)胞白血病能力，并初步探討AMPK/Cox-2途徑在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

槲皮素(來自Sigma Chemical Company USA)；兔抗人p-AMPK IgG單克隆抗體(來自Cell Signaling Technology USA)；鼠抗人Cox-2 IgG單克隆抗體(來自Cayman Chemical Company USA)；兔抗人β-actin IgG單克隆抗體(來自Cell Signaling Technology USA)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

K562細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所。K562細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、3%谷氨酰胺的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代換液一次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞毒性作用

收集對數(shù)生長期的細(xì)胞 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，槲皮素終濃度設(shè)為0 μm、50 μm、100 μm、150 μm，與K562細(xì)胞共同孵育48 h后加入37 ℃預(yù)熱的CCK-8，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后在酶標(biāo)儀上檢測，以空白組調(diào)零，檢測波長為450 nm，參照波長為630 nm，測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果，取三個復(fù)孔的平均吸光度值作為該濃度條件下的OD值。試驗重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞存活率(%)=(處理組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 Western-blot方法檢測細(xì)胞中p-AMPK、Cox-2、β-actin蛋白的表達(dá)

K562細(xì)胞分別用0 μm、50 μm、100 μm、150 μm濃度槲皮素處理48 h，用磷酸鹽緩沖劑(PBS)洗3次，超聲裂解細(xì)胞并離心，取上清蛋白液定量后加入5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液，轉(zhuǎn)膜封閉洗膜后結(jié)合一抗：二抗后行發(fā)光鑒定，跑膠后用凝膠分析軟件對圖像進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測槲皮素對K562細(xì)胞的毒性作用

槲皮素與K562細(xì)胞共同孵育48h后檢測細(xì)胞存活率。當(dāng)槲皮素作用濃度分別為50 μm、100 μm和150 μm時，細(xì)胞存活率分別為(70.13±1.34)%，(34.61±1.55)%和(13.29±2.58)%。與對照組(100±2.17)%比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。槲皮素孵育48h的細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentraumtion，IC50)值為83.11 μm。

2.2 槲皮素對K562細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)的影響

K562細(xì)胞分別與0 μm、50 μm、100 μm、150 μm濃度槲皮素共同孵育48h提取細(xì)胞，用Western-blot法檢測蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：經(jīng)槲皮素孵育后p-AMPK蛋白表達(dá)水平上升，槲皮素作用濃度愈高，p-AMP上升越明顯。當(dāng)槲皮素作用濃度為50 μm時，p-AMPK的表達(dá)水平是對照組的1.25倍(P<0.05)；作用濃度為100 μm時， p-AMPK的表達(dá)是對照組的1.54倍(P<0.05)；作用濃度為150 μm時， p-AMPK的表達(dá)是對照組的1.62倍(P<0.05)，見圖1。

圖1 槲皮素影響p-AMPK蛋白水平的表達(dá)

2.3 槲皮素對K562細(xì)胞p-AMPK

K562細(xì)胞分別與0 μm、50 μm、100 μm、150 μm濃度槲皮素共同孵育48 h提取細(xì)胞后檢測Cox-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：經(jīng)槲皮素孵育后Cox-2蛋白表達(dá)水平明顯下降，槲皮素作用濃度愈高，Cox-2下降越明顯。當(dāng)槲皮素作用濃度為50 μm時，Cox-2較對照組下降33.3%；(P<0.05)；作用濃度為100 μm時，Cox-2較對照組下降60.7%(P<0.05)；作用濃度為150 μm時，Cox-2較對照組下降70.4%(P<0.05)，見圖2。

圖2 槲皮素影響Cox-2蛋白水平的表達(dá)

3 討論

目前抗腫瘤藥物的研究重點已經(jīng)由細(xì)胞毒藥物轉(zhuǎn)向?qū)ふ裔槍π掳悬c，提高選擇性，增加安全性和克服耐藥性的新型藥物。植物來源的藥物以其作用機(jī)制廣泛和低毒性成為目前的研究熱點。槲皮素是自然界中分布最廣泛的植物黃酮類化合物，以糖苷的形式廣泛存在于植物的花、葉和果實中。研究證明槲皮素包括急性白血病在內(nèi)的多種腫瘤均有抑制作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過誘導(dǎo)凋亡的方式抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞的增殖[3]。本實驗結(jié)果也顯示槲皮素亦可以抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562的增殖，其抑制程度具有濃度依賴性。相較于HL-60細(xì)胞，槲皮素作用于K562的IC50值更高，提示HL-60細(xì)胞對槲皮素更加敏感，但考慮到槲皮素的低毒性，槲皮素仍可有效抑制K562的增殖。

AMPK可以通過感受AMP/ATP比率變化而調(diào)節(jié)能量代謝，在細(xì)胞能量調(diào)節(jié)中處于中樞地位。在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，能量調(diào)節(jié)能力失衡是其中的關(guān)鍵因素之一，因此AMPK是新的腫瘤預(yù)防及治療的新靶點。近年來關(guān)于圍繞著腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中AMPK上下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究日益增多[4]，包括AMPK激活劑的研發(fā)也有進(jìn)步[5]。本課題組針對槲皮素抑制HL-60細(xì)胞增殖的作用機(jī)制做了深入的研究，發(fā)現(xiàn)槲皮素是有效的AMPK激活劑，槲皮素通過激活A(yù)MPK抑制Cox-2的表達(dá)進(jìn)而抑制HL-60細(xì)胞增殖[6]。Cox-2是前列腺素合成過程中的重要限速酶，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，增加腫瘤細(xì)胞侵襲的能力，Cox-2抑制劑可用于癌癥的輔助治療[7]。Lee等[8]亦發(fā)現(xiàn)槲皮素通過AMPK/Cox-2通路抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系。慢性粒細(xì)胞白血病相對于急性白血病，疾病自然病程長，可能發(fā)生的腫瘤代謝紊亂亦會增加，推測槲皮素作為植物類低毒性藥物在慢粒白血病的治療有可能一定的優(yōu)勢。本實驗針對K562細(xì)胞株亦得到了與HL-60細(xì)胞株相似的結(jié)果，隨著槲皮素濃度的升高，K562細(xì)胞存活率逐漸下降，p-AMPK表達(dá)上調(diào)，Cox-2表達(dá)下降，提示槲皮素通過AMPK/Cox-2途徑抑制K562細(xì)胞增殖。

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