嚴(yán)正強(qiáng) 陳鐵定 陳力 張琴 楊遠(yuǎn)清

●論 著

茶多酚對(duì)人前列腺癌PC-3M細(xì)胞侵襲力的影響

嚴(yán)正強(qiáng) 陳鐵定 陳力 張琴 楊遠(yuǎn)清

目的 探討茶多酚對(duì)人前列腺癌PC-3M細(xì)胞侵襲力的影響。方法 在人前列腺癌PC-3M細(xì)胞培養(yǎng)器皿中分別加入用完全培養(yǎng)液稀釋的40、60、80μg/ml茶多酚溶液，24、48h后通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察PC-3M細(xì)胞的侵襲能力，采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)其MMP-2、TIMP-2 mRNA、蛋白表達(dá)水平，并與只添加完全培養(yǎng)液的0μg/ml組比較。結(jié)果 茶多酚處理后的PC-3M細(xì)胞侵透基質(zhì)膠，遷移至膠中或膠下表面的數(shù)量減少，且呈濃度、時(shí)間依賴性。與0μg/ml組相比，40、60、80μg/ml組MMP-2 mRNA、蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，TIMP-2 mRNA、蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)；茶多酚可在mRNA、蛋白水平下調(diào)MMP-2、上調(diào)TIMP-2基因轉(zhuǎn)錄，大致呈濃度、時(shí)間依賴性（均P＜0.05）。結(jié)論 茶多酚可在體外減弱人前列腺癌PC-3M細(xì)胞的侵襲力，可能與下調(diào)MMP-2、上調(diào)TIMP-2基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)有關(guān)。

茶多酚 前列腺癌 腫瘤侵襲 基質(zhì)金屬蛋白酶-2 金屬蛋白酶組織抑制因子-2

浸潤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞通過一系列生化反應(yīng)脫離原發(fā)灶轉(zhuǎn)移到其他器官組織繼續(xù)惡性增殖，形成與原發(fā)灶性質(zhì)相同的繼發(fā)腫瘤的過程。它是惡性腫瘤的典型特征，是促使腫瘤患者最終衰竭死亡的根本原因。腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移是多階段的精細(xì)復(fù)雜的過程，涉及腫瘤細(xì)胞與宿主之間錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用，受多種基因的調(diào)控。本文就茶多酚是否可以減弱人雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M的浸潤轉(zhuǎn)移能力作一探索。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 茶多酚（98%）購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自依科賽（上海）生物制品有限公司，IMDM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，Transwell板（12上室/24孔板，8.0μm）購自美國的Corning公司?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、金屬蛋白酶組織抑制因子-2（TIMP-2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，MMP-2抗體、TIMP-2抗體、β-Actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。RT-PCR使用美國GeneAmp公司的PCR擴(kuò)增儀9700型，蛋白電泳使用美國Bio-rad公司的蛋白質(zhì)電泳裝置、電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，數(shù)據(jù)拍照記錄使用上海Tanon凝膠成像系統(tǒng)2500R。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件 人前列腺癌PC-3M細(xì)胞株由吉林大學(xué)前列腺防治研究中心饋贈(zèng)，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2濕化的培養(yǎng)箱中；待細(xì)胞融合70%～80%培養(yǎng)孔時(shí)，分組（24、48h）加藥，4孔/組；將培養(yǎng)液更換為完全培養(yǎng)液稀釋的茶多酚溶液，其終濃度為0、40、60、80μg/ml。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用完全培養(yǎng)液稀釋的終濃度為0、40、60、80μg/ml的的茶多酚溶液作用24、48h，收集2個(gè)時(shí)點(diǎn)的PC－3M細(xì)胞并配成細(xì)胞懸液（2.0×105/ml）。分別加入已預(yù)鋪Matrigel的Transwell上室，100μl/上室。下室加入500μl含有20%FBS條件培養(yǎng)基，37℃、5% CO2、濕化培養(yǎng)箱中孵育。24h后取出上室，用棉球擦去上室內(nèi)聚酯膜表面的細(xì)胞。用0.1%結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下取3～5個(gè)視野觀察上室聚酯膜下表面的細(xì)胞，拍照、計(jì)數(shù)。

1.3.2 RT－PCR檢測(cè)MMP－2、TIMP－2 mRNA表達(dá)水平加藥處理24、48h后，提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用半定量RT－PCR擴(kuò)增目的基因MMP－2、TIMP－2和內(nèi)參基因GAPDH，引物序列見表1。使用GIS凝膠分析軟件進(jìn)行光密度掃描分析，MMP－2、TIMP－2 mRNA表達(dá)水平以MMP－2、TIMP－2產(chǎn)物與內(nèi)參GAPDH產(chǎn)物的光密度比值表示。

表1 MMP-2、TIMP-2與GAPDH的引物

1.3.3 Western blot檢測(cè)MMP－2、TIMP－2蛋白表達(dá)水平 加藥處理24、48h后收集、提取細(xì)胞總蛋白并應(yīng)用Bio－rad法進(jìn)行定量；取30μg蛋白進(jìn)行12%聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS－PAGE），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，用5%脫脂奶粉、4℃封閉過夜，含0.05%Tween20的TBS緩沖液（TBST）洗膜3次；室溫加入1∶400兔抗人MMP－2、TIMP－2抗體，孵育2h，TBST洗膜3次；加入1∶2 000稀釋的羊抗兔IgG/AP，室溫孵育2h，TBST洗膜3次；5－溴－4－氯－3－吲哚基－磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)溶液（BCIP/NBT）顯色。運(yùn)用GIS凝膠分析軟件進(jìn)行光密度掃描分析，MMP－2、TIMP－2蛋白表達(dá)水平以MMP－2、TIMP－2蛋白與內(nèi)參β－actin蛋白的電泳條帶亮度比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。上述實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)3次，計(jì)量資料用表示，2個(gè)時(shí)點(diǎn)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；各劑量組間比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett－t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 經(jīng)茶多酚處理后，PC－3M細(xì)胞侵透基質(zhì)膠，遷移至膠中或膠下表面的數(shù)量減少，且大致呈濃度、時(shí)間依賴性，見圖1－2和表2。

2.2 MMP－2、TIMP－2 mRNA表達(dá)水平 與0μg/ml組相比，40、60、80μg/ml組MMP－2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，TIMP－2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，見圖3和表3。茶多酚可在mRNA水平下調(diào)MMP－2、上調(diào)TIMP－2基因轉(zhuǎn)錄，且大致呈濃度、時(shí)間依賴性（均P＜0.05），見圖4－5。

2.3 MMP－2、TIMP－2蛋白表達(dá)水平 與0μg/ml組相比，40、60、80μg/ml組 MMP－2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，TIMP－2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，見圖6和表4。茶多酚可在蛋白水平下調(diào)MMP－2、上調(diào)TIMP－2表達(dá)，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；2個(gè)時(shí)點(diǎn)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖7－8。

3 討論

MMPs因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，在1962年被Jerome Gross、Charles Lapiere在研究蝌蚪向蛙演變過程中的尾巴退行性變時(shí)發(fā)現(xiàn)[1]。MMPs可降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白成分，破壞保護(hù)機(jī)體的組織屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著無可替代的作用，因而被認(rèn)為是腫瘤侵襲過程中主要的蛋白水解酶。MMPs是一個(gè)大家族，按作用底物不同及片斷同源性，可將MMPs分為以下五類[2－4]：膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶、其他。其中明膠酶（Ⅳ型膠原酶）在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用尤為重要，主要有兩種形式：一種非糖化，分子量為72kDa，稱為明膠酶A；另一種被糖化，分子量為92kDa，稱為明膠酶B。在腫瘤細(xì)胞侵襲過程中，活化的MMP－2定位于細(xì)胞膜上突起的侵入足部位發(fā)揮作用，考慮在酶解基底膜及細(xì)胞間基質(zhì)成分中起著“鉆頭”的作用[5]。

圖1 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（結(jié)晶紫染色，×200）

表2 各組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（個(gè)）

圖2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)圖（a：濃度效應(yīng)；b：時(shí)間效應(yīng)）

圖3 MMP-2、TIMP-2 mRNA表達(dá)的電泳圖

TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，它以共價(jià)鍵的形式與MMPs相結(jié)合成1∶1復(fù)合體，可通過自身水平的變化特異性來調(diào)節(jié)體內(nèi)的MMPs活性。TIMP-2是MMP-2的特異性抑制劑，通過MMP-14來實(shí)現(xiàn)對(duì)MMP-2的調(diào)節(jié)[6]：TIMP-2首先與活化的MMP-14的N端結(jié)合，隨之以TIMP-2的C端結(jié)合ProMMP-2的C端區(qū)域，從而形成MMP-14-TIMP-2-ProMMP-2復(fù)合物；然后在另一游離MMP-14的作用下，ProMMP-2裂解成有活性的MMP-2。由此，體內(nèi)TIMP-2水平較高時(shí)，游離MMP-14相對(duì)較少，從而抑制MMP-2的激活；當(dāng)體內(nèi)TIMP-2水平較低時(shí)，則介導(dǎo)MMP-2的激活[7]。此外，TIMP-2對(duì)金屬蛋白酶家族其他酶類亦有一定的抑制作用，通過阻斷被激活的MMP的水解活性，從而抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[8]。

表3 各組MMP-2、TIMP-2 mRNA表達(dá)水平比較

圖4 MMP-2、TIMP-2 mRNA表達(dá)水平的濃度效應(yīng)（a：MMP-2；b：TIMP-2）

圖5 MMP-2、TIMP-2 mRNA表達(dá)水平的時(shí)間效應(yīng)（a：MMP-2；b：TIMP-2）

圖6 MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 各組MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)水平比較

圖7 MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)水平的濃度效應(yīng)（a：MMP-2；b：TIMP-2）

圖8 MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)水平的時(shí)間效應(yīng)（a：MMP-2；b：TIMP-2）

Kanoh等[9]關(guān)于前列腺癌患者血清MMP-2表達(dá)水平的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，對(duì)臨床中判斷前列腺癌病情進(jìn)展具有指導(dǎo)意義。Verheijen等[10]比較正常前列腺組織與前列腺癌組織發(fā)現(xiàn)，正?；蛟缙诘那傲邢侔㎝MP-2/TIMP-2的比值接近1.0，而重度、晚期的腫瘤達(dá)到3.3、2.8。Stearns等[11]研究表明MMP-2在前列腺癌組織中表達(dá)增高，且與Gleason評(píng)分呈正相關(guān)。Kawamata等[12]將TIMP-2 cDNA轉(zhuǎn)染入小鼠膀胱癌細(xì)胞系LMC19，再原位移植入裸鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)TIMP-2較多的腫瘤細(xì)胞發(fā)生癌栓血管外生長的能力隨之下降；此外，還發(fā)現(xiàn)將TIMP-2靜脈輸入轉(zhuǎn)染了ras基因的裸鼠體內(nèi)，可抑制鼠NIK3T3細(xì)胞所引起的肺轉(zhuǎn)移瘤。Demeule等[13]研究證明，兒茶素類成分EGCG通過抑制明膠酶對(duì)人前列腺癌細(xì)胞株DU-145、LNCaP的增殖和轉(zhuǎn)移均有抑制作用。筆者前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了茶多酚對(duì)人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用[14-15]。本研究通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察PC-3M細(xì)胞的侵襲能力，筆者選用了Transwell，預(yù)先在每個(gè)小室內(nèi)鋪上Matrigel（主要成分為層黏連蛋白、Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白），模擬機(jī)體基底膜的屏障作用。Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，與天然基底膜結(jié)構(gòu)極為相似。具有高侵襲性能的腫瘤細(xì)胞在趨化因子的誘導(dǎo)下，通過黏附、降解、變形運(yùn)動(dòng)而穿過基底膜膠，能有效在體外模擬腫瘤細(xì)胞侵襲過程[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0μg/ml組PC-3M細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，茶多酚處理后PC-3M細(xì)胞侵蝕Matrigel的能力明顯降低，且呈時(shí)間、濃度依賴性。RT-PCR、Western blot結(jié)果表明40、60、80μg/ml組較0μg/ml組的MMP-2基因轉(zhuǎn)錄與翻譯明顯減弱，而TIMP-2基因轉(zhuǎn)錄與翻譯明顯增強(qiáng)。因此，筆者認(rèn)為茶多酚能下調(diào)MMP-2表達(dá)、上調(diào)TIMP-2表達(dá)，并且減弱腫瘤細(xì)胞PC-3M的侵襲能力；但RT-PCR、Western blot結(jié)果在時(shí)間依賴性上并不完全一致，考慮MMP-2與TIMP-2基因在轉(zhuǎn)錄后還受到其他因素的進(jìn)一步調(diào)控。

綜上所述，茶多酚可在體外減弱人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3M細(xì)胞的侵襲力，且在一定范圍內(nèi)具有時(shí)間、濃度依賴性；可能與下調(diào)MMP-2、上調(diào)TIMP-2基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)有關(guān)。前列腺癌發(fā)病率的東西方差異可能主要體現(xiàn)在進(jìn)展期前列腺癌階段；因此，這為解釋前列腺癌發(fā)病率的東西方差異、驗(yàn)證茶多酚對(duì)前列腺癌的治療與預(yù)防價(jià)值提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Davidson B,Reich R,Risberg B,et al.The biological role and regulation of matrix metalloproteinases(MMP)in cancer[J].Arkh Patol,2002,64(3):47-53.

[2] Rydlova M,Holubec L Jr,Ludvikova M Jr,et al.Biological activity and clinical implications of the matrix metalloproteinases[J].Anticancer Res,2008,28(2B):1389-1397.

[3] 高東梅.基質(zhì)金屬蛋白酶及抑制劑的研究進(jìn)展[J].實(shí)用腫瘤雜志, 2004(1):83-87.

[4] Visse R,Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases:structure,function,and biochemistry[J]. Circ Res,2003,92(8):827-839.

[5]Nakahara H,Howard L,Thompson E W,et al.Transmembrane/cytoplasmic domain-mediated membrane type 1-matrix metalloprotease docking to invadopodia is required for cell invasion[J]. Proc NatlAcad SciUSA,1997,94(15):7959-7964.

[6] Hernandez-Barrantes S,Toth M,Bernardo M M,et al.Binding of active(57kDa)membrane type 1-matrix metalloproteinase(MT1-MMP)to tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)-2 regulates MT1-MMP processing and proMMP-2 activation[J].J Biol Chem, 2000,275(16):12080-12089.

[7] Caterina J J,Yamada S,Caterina N C,et al.Inactivating mutation of the mouse tissue inhibitor of metalloproteinases-2(Timp-2) gene alters proMMP-2 activation[J].J Biol Chem,2000,275(34): 26416-26422.

[8] Seo D W,Li H,Guedez L,et al.TIMP-2 mediated inhibition of angiogenesis:an MMP-independent mechanism[J].Cell,2003, 114(2):171-180.

[9] Kanoh Y,Akahoshi T,Ohara T,et al.Expression of matrix metalloproteinase-2 and prostate-specific antigen in localized and metastatic prostate cancer[J].Anticancer Res,2002,22(3):1813-1817.

[10] Verheijen J H,Nieuwenbroek N M,Beekman B,et al.Modified proenzymes as artificial substrates for proteolytic enzymes: colorimetric assay of bacterial collagenase and matrix metalloproteinase activity using modified pro-urokinase[J].Biochem J, 1997,323(Pt3):603-609.

[11] Stearns M E,Wang M.Type IVcollagenase(Mr 72,000)expression in human prostate:benign and malignant tissue[J].Cancer Res,1993,53(4):878-883.

[12] Kawamata H,Kawai K,Kameyama S,et al.Over-expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases (TIMP1 and TIMP2) suppresses extravasation of pulmonary metastasis of a rat bladder carcinoma[J].Int J Cancer,1995,63(5):680-687.

[13] Demeule M,Brossard M,Page M,et al.Matrix metalloproteinase inhibition by green tea catechins[J].Biochim Biophys Acta,2000, 1478(1):51-60.

[14] 毛小強(qiáng),那萬里,趙丹,等.茶多酚對(duì)前列腺癌PC-3M細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010(2):170-173.

[15] 嚴(yán)正強(qiáng),楊遠(yuǎn)清,盧啟海.茶多酚對(duì)人前列腺癌PC-3M細(xì)胞中Survivin mRNA和蛋白表達(dá)的影響[J].浙江醫(yī)學(xué),2016,38(21): 1727-1730.

[16]Kleinman H K,Martin G R.Matrigel:basement membrane matrix withbiologicalactivity[J].SeminCancerBiol,2005,15(5):378-386.

Effect of tea polyphenols on invasive ability of prostate cancer PC-3M cells

YAN Zhengqiang,CHEN Tieding,CHEN Li,et al. Department of Urology，Eastern Hospital of Ningbo Medical Center,Ningbo 315103，China

Tea polyphenolProstate cancerNeoplasm invasiveness MMP-2 TIMP-2

2016-12-28）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2016-2210

315103 寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院泌尿外科

嚴(yán)正強(qiáng)，E-mail：mqyz@tom.com

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of tea polyphenols(TPs)on invasive ability of human prostate cancer PC-3M cells. Methods Human prostate cancer PC-3M cells were treated with 40,60,80μg/ml tea polyphenol for 24h or 48h in vitro.The invasive ability of PC-3M cells was determined by Transwell assay,and the expression of MMP-2,TIMP-2 mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot,respectively. Results Transwell assay showed that the invasive ability of PC-3M cells was decreased after treatment with tea polyphenol.The expression of MMP-2 mRNA and protein in PC-3M cells was increased after treated with 60μg/ml and 80μg/ml for 24h or 48h were significantly decreased(P＜0.05),while the expression of TIMP-2 mRNA and protein was increased(P＜0.05)in a dose-dependent and time-dependent manner(P＜0.05). Conclusion Tea polyphenols can reduce the invasive ability of human prostate cancer PC-3M cells in vitro,which may be related to the down-regulation of MMP-2 and up-regulation of TIMP-2 gene expression.