王煜偉，胡 娜 , 索有瑞

(1．青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016；2. 中國科學(xué)院 西北高原生物研究所藏藥重點實驗室，青海 西寧 810001；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

研究報告(081～086)

樹莓中花色苷的超聲提取工藝以及抗氧化活性研究

王煜偉1,2,3，胡 娜1,2, 索有瑞1,2

(1．青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016；2. 中國科學(xué)院 西北高原生物研究所藏藥重點實驗室，青海 西寧 810001；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

在單因素試驗的基礎(chǔ)上選擇提取次數(shù)、提取試劑、料液比、超聲時間4個因素為自變量，以樹莓花色苷的提取率為響應(yīng)值，進行Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，采用響應(yīng)面法(RSM)評估了這些因素對花色苷提取率的影響. 并分別采用1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)法對花色苷的抗氧化活性進行研究. 結(jié)果表明，超聲輔助提取樹莓中花色苷的最佳工藝條件為：超聲提取3次，料液比1∶46 g/mL，超聲時間44 min，在此條件下預(yù)測花色苷的得率為6.79%. 花色苷對于DPPH的清除率達到13.68 μmol/g，對于ABTS的清除率達到8.37 μmol/g.

樹莓；花色苷；響應(yīng)面法；抗氧化

樹莓(RubusCorchorifoliusL. f)，也稱覆盆子、馬林、懸鉤子，屬于直立灌木. 廣泛分布于海拔200～2200 m的向陽山坡、溪邊、山谷、荒地和灌木叢中，其果實可供生食、制果醬以及釀酒. 樹莓根、莖、葉、果實均可入藥，有活血、解毒、止血之效[1]. 樹莓果實酸甜可口，柔嫩多汁，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，被譽為“黃金水果”[2]. 樹莓中含有大量的人體所必需的維生素C、維生素E、花色苷以及超氧化物歧化酶(SOD)等營養(yǎng)物質(zhì), 能夠有效改善人體新陳代謝,提高免疫力,具有很高的食用與藥用價值[3-7].

花色苷具有抗氧化、抗變異、抗腫瘤、消除自由基、促進視網(wǎng)膜上視紅素再合成以及降低血清膽固醇等功能，因其具有果香味、安全性高、水溶性好等優(yōu)點，已被廣泛使用[8-10]. 本試驗采用超聲優(yōu)化提取樹莓中的花色苷，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用pH示差法[11-12]，通過響應(yīng)面分析確定最佳提取工藝[13,14]，并對其抗氧化活性進行研究. 以期為樹莓工業(yè)化生產(chǎn)工藝的建立提供科學(xué)依據(jù)和理論參考.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)； KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司; AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司；SHZ-3 型循環(huán)水多用真空泵，上海亞榮生化儀器; 101-1ES 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠.

樹莓樣品，購于青海瑤池生物科技有限公司，商品名為秋英，又名嘉林一號，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所索有瑞研究員鑒定為懸鉤子屬樹莓. 1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)和2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS )試劑購于美國 Sigma 公司，其他試劑均為市售分析純.

1.2 溶液的配制

0.025 mol/L pH 1.0的氯化鉀緩沖溶液:稱取1.86 g KCl至燒杯中，加入蒸餾水980 mL左右，測量pH值并調(diào)節(jié)pH值至1.0 ± 0.05 (加入約6.3 mL HCl). 然后轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻.

0.4 mol/L pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液:稱取54.43 g CH3CO2Na·3H2O至燒杯中，加入蒸餾水960 mL左右，測量pH值并調(diào)節(jié)pH值至4.5 ± 0.05(加入約20 mL HCl). 然后轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻.

1.3 樣品溶液制備

1.3.1 花色苷的提取

稱取樣品1.000 g，精密稱定，置于50 mL棕色容量瓶中，準(zhǔn)確加入提取液 (濃HCl∶80 %甲醇,體積比為4∶96) 200 mL，密塞，稱定重量，40 ℃超聲30 min，冷卻至室溫，再次稱定重量，用提取液補足減失的重量，搖勻，即得樣品溶液.

1.3.2 樣品稀釋溶液制備

按供試品溶液:緩沖溶液(體積比為1∶5)混合，制備2份樣品稀釋溶液，其中一份用氯化鉀緩沖溶液 (0.025 mol/L, pH 1.0)稀釋，另一份用醋酸鈉緩沖溶液 (0.4 mol/L, pH 4.5)稀釋，平衡20 min，待測.

1.4 花色苷的含量測定

用蒸餾水作為空白對照，分別在520和700 nm處測定用pH 1.0緩沖溶液稀釋的樣品溶液. 同理在兩處測定用pH 4.5緩沖溶液稀釋的樣品，注意此處要在20～50 min內(nèi)測定完樣品的吸光度.

1.5 花色苷的計算

以錦葵色素-3,5-二葡萄糖苷，計算花色苷色素的濃度，公式表示如下：

(1)

其中：A=(Aλmax-A700 nm)pH 1.0-(Aλmax-A700 nm) pH 4.5；MW(分子量)=錦葵色素-3,5-二葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量655.2 g/mol；DF為稀釋因子；103是將單位g換算為mg；ε為錦葵色素-3,5-二葡萄糖苷的消光系數(shù)，為 20 500 L/(mol×cm)；l為比色杯厚度，cm.

1.6 超聲輔助法提取樹莓果實花色苷的單因素試驗

1.6.1 超聲次數(shù)對花色苷提取量的影響

稱取新鮮樹莓1.000 g分別加入7支試管，在每支試管中按照1∶20 g/mL的料液比加入酸化甲醇溶液，用保鮮膜封口，放置濕潤，使溶液充分滲入到細(xì)胞組織中，超聲處理30 min，分別重復(fù)1、2、3、4、5、6、7次. 每組做3次平行試驗.

1.6.2 料液比對花色苷提取量的影響

稱取新鮮樹莓0.100 g分別加入7支試管，每支試管各按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL的料液比分別加入酸化甲醇溶液，用保鮮膜封口，放置濕潤，使溶液充分滲入到細(xì)胞組織中，超聲處理30 min，重復(fù)3次. 每組做3次平行試驗.

1.6.3 提取試劑對花色苷提取量的影響

稱取新鮮樹莓1.000 g分別加入5支試管，每支試管分別按1∶20 g/mL的料液比加入水、酸性水、酸化乙醇、酸化甲醇以及丙酮溶液，用保鮮膜封口，放置濕潤，使溶液充分滲入到細(xì)胞組織中，超聲處理30 min，重復(fù)3次. 每組做3次平行試驗.

1.6.4 超聲時間對花色苷提取量的影響

稱取樹莓1.000 g分別加入7支試管，每支試管分別按1∶20 g/mL的料液比加入酸化甲醇，用保鮮膜封口，放置濕潤，使溶液充分滲入到細(xì)胞組織中，分別超聲處理10、20、30、40、50、60、70 min，重復(fù)3次. 每組做3次平行試驗.

1.7 樹莓中花色苷提取條件的優(yōu)化設(shè)計

根據(jù) Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取對花色苷影響較大的因素提取次數(shù)(A)、料液比(B) 和超聲時間(C) ，進行中心組合試驗，并結(jié)合單因素試驗條件選取合理水平. 以花色苷的得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析得出超聲波提取樹莓中花色苷的最佳提取工藝條件和方法. 試驗設(shè)計因素編碼及水平如表1所列.

表1 中心組合設(shè)計因素與水平表Table 1 Factors and levels in central composite design

1.8 DPPH法測定花色苷抗氧化活性

將上述花色苷提取液上大孔樹脂柱，用70%乙醇洗脫，于真空干燥箱內(nèi)至恒重，得樹莓花色苷干粉，用于花色苷抗氧化活性的測定.

使用參考文獻[15]方法并稍作修改. 用無水乙醇配置 0.1 mmol/L 的DPPH溶液，避光保存. 配置 0.5 mg/mL 的Vc溶液(作為對照). 將測試樣品稀釋至不同濃度. 將2 mL測試樣品溶液及 2 mL DPPH 溶液加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置 30 min 后測定其吸光度Asample,同時測定 2 mL DPPH溶液與2 mL溶劑(蒸餾水或者相應(yīng)的緩沖溶液)混合后的吸光度Acontrol,以及2 mL測試樣品溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度Ablank. 自由基清除能力的表示：

DPPH清除率(%)=[1-(Asample-Ablank) /Acontrol]× 100%

(2)

根據(jù)濃度分別為 50、70、90、110、130、150、170 μmol/L trolox的 DPPH·清除率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算花色苷的 trolox 抗氧化能力. 其計算公式為:

K1=C×V×D/M

(3)

其中:C為花色苷的濃度，V為提取溶劑體積，D為稀釋倍數(shù)，M為樣品質(zhì)量.

1.9 ABTS法測定花色苷抗氧化活性

使用參考文獻[16]方法并稍作修改. 使用總抗氧化能力試劑盒，ABTS工作母液配制后，室溫避光存放12～16 h. 將ABTS工作母液用PBS稀釋，使ABTS工作液的吸光度減去相應(yīng)的PBS空白對照后，A734 nm為0.7±0.02. 把 10 mmol/L Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和 1.5 mmol/L，根據(jù)其ABTS+·清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 由此計算花色苷的 Trolox 抗氧化能力. 其公式為:

ABTS清除率(%)=[1-(Asample-Ablank) /Acontrol]× 100%

(4)

其中:Asample為加入樣品的吸光度值，Ablank為樣品的本底吸光度值，Acontrol為不加樣品的吸光度值.

根據(jù)濃度分別為 10、30、50、70、90、100、120 μmol/L trolox 的ABTS+·清除率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算花色苷的 trolox 抗氧化能力. 其計算公式為:

K2=C×V×D/M

(5)

其中:C為花色苷的濃度，V為提取溶劑體積，D為稀釋倍數(shù)，M為樣品質(zhì)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取次數(shù)對樹莓中花色苷提取率的影響

固定料液比1∶20 g/mL，酸化甲醇溶液超聲處理30 min，分別重復(fù)1、2、3、4、5、6、7次. 按照1.6.1進行試驗. 結(jié)果如圖1所示.

圖1 超聲次數(shù)對花色苷得率的影響Fig.1 Effect of extraction times on extraction yield of anthocyanins

由圖1可知，超聲提取3次時花色苷得率最高，隨著提取次數(shù)的增大，花色苷得率變化不大，所以超聲次數(shù)在3次為宜.

2.2 料液比對花色苷提取率的影響

在每支試管中按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL的料液比分別加入酸化甲醇溶液，超聲處理30 min，按照1.6.2 進行試驗. 結(jié)果如圖2所示.

圖2 料液比對花色苷得率的影響Fig.2 Effect of ratio of solid to liquid on extraction yield of anthocyanins

由圖2可知，當(dāng)料液比達到1∶40 g/mL左右時，花色苷基本溶出，再增加提取劑用量，提取率變化不大. 鑒于降低成本，料液比1∶40 g/mL左右為宜. 2.3 提取試劑對花色苷提取率的影響

在每支試管中分別按1∶20 g/mL的料液比加入水、酸性水、酸化乙醇、酸化甲醇以及丙酮溶液，超聲處理30 min，按照1.6.3 進行試驗. 結(jié)果如圖 3所示.

圖3 提取試劑對花色苷得率的影響Fig.3 Effect of extracting agent on extraction yield of anthocyanins

由圖3可知，酸化甲醇對花色苷提取效率最高.

2.4 超聲時間對樹莓中花色苷提取率的影響

在每支試中分別按1∶20 g/mL的料液比加入酸化甲醇，分別超聲處理10、20、30、40、50、60、70 min，按照 1.6.4進行試驗. 結(jié)果如圖4所示.

圖4 超聲時間對花色苷得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of anthocyanins

由圖4可知，超聲時間越長越有利于提高提取率，因此花色苷的提取率隨著時間的提高而提高. 但是30 min以后提取率增加并不明顯，因此選擇超聲提取30 min為宜.

2.5 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

利用 Design Expert8.0.7.1 軟件，通過花色苷得率試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，得出回歸模型方差分析表和響應(yīng)曲面圖，分別如表2所列、圖5所示.

表2 擬合二次多項式模型的方差分析Table 2 Analysis of variance(ANOVA)for fitted quadratic polynomial model

注：P<0.01，差異極顯著；P<0.05，差異顯著.R2=0.993 8

圖5 各兩因素交互作用對花色苷提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of mutual influences of extraction conditions on extraction yields of anthocyanins

通過擬合可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到樹莓中花色苷提取率R1與各因素變量(A提取次數(shù)，B料液比，C超聲時間)的二次方程模型為：R1=7.95+0.41×A+0.14×B+0.92×C+0.28×A×B-0.085×A×C+0.41×B×C-2.28×A2-2.34×B2-1.26×C2.

根據(jù)DesignExpert 8.0.7.1軟件對試驗結(jié)果進行最優(yōu)化分析，確定最佳的提取條件為：超聲提取3次，料液比1∶46 g/mL，超聲時間44 min，在此條件下預(yù)測花色苷的得率為6.79%.

3 結(jié)論

根據(jù)模型預(yù)測結(jié)果進行近似驗證試驗，但考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為超聲提取3次，料液比1∶46 g/mL，超聲時間44 min，在此條件下花色苷提取率為6.76%(n=3).

根據(jù)試驗結(jié)果分析可知，樹莓花色苷對DPPH以及ABTS都有一定的清除作用，其中對于DPPH的清除率達到13.68 μmol/g，對于ABTS的清除率達到8.37 μmol/g. 明顯高于Tulammen、USA 22、U46等其他樹莓品種[17-20]，說明本研究所選取的樹莓品種具有更強的抗氧化活性，更好地開發(fā)前景.

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Ultrasonic-Assisted Extraction of Anthocyanins fromRubusCorchorifoliusL. f and Antioxidant Activity

WANG Yu-wei1,2,3,HU Na1,2, SUO You-rui1,2

(1． State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture, Qinghai University, Xining 810016, China; 2． Key Laboratory of Tibetan Medicine of Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences，Xining 810001, China; 3． University of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049, China)

Based on single factor experiments, extraction times, extraction reagent, solid-liquid ratio, ultrasonic time were selected for the Box-Behnken central composite design. Response surface method was employed to study the effect of these factors on the yield of anthocyanins and the antioxidant activity of anthocyanins. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) and 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)(ABTS)method were used, respectively to study the antioxidant activity of anthocyanins in raspberry. The results indicated that optimal conditions were: ultrasonic extraction for 3 times, 1∶46 g/mL as the ratio of liquid to solid with 44 min extraction. Under these optimized conditions, the extraction yield of anthocyanins was up to 6.79%. The clearance of DPPH was 13.68 μmol/g and the clearance of ABTS was 8.37 μmol/g. The study provides scientific and theoretical basis for the research and utilization ofRubusCorchorifoliusL. f.

RubusCorchorifoliusL. f;anthocyanins;response surface method;antioxidant

2017-02-16;

2017-04-28.

柴達木枸杞干果綠色加工技術(shù)示范推廣(2014-NS-509)

王煜偉，女，博士在讀，研究方向為植物化學(xué)

索有瑞(1960-)，男，研究員，《分析測試技術(shù)與儀器》副主編，主要從事生物有機化學(xué)和天然藥物化學(xué)方面的研究，E-mail: yrsuo@nwipb.cas.cn.

O657.3

A

1006-3757(2017)02-0081-06

10.16495/j.1006-3757.2017.02.003