權浩然,龐林江,張宜明,*,孫 瑛,薛超波,路興花

(1. 浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院，浙江臨安 311300; 2.舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江舟山 316021)

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大田軟海綿酸及快速檢測技術應用進展

權浩然1,龐林江1,張宜明1,*,孫 瑛2,薛超波2,路興花1

(1. 浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院，浙江臨安 311300; 2.舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江舟山 316021)

大田軟海綿酸是海洋毒素中腹瀉型毒素的代表。目前的檢測方法存在耗時耗力、設備昂貴、不能快速檢測的缺點。本文就大田軟海綿酸的結構、毒理、藥理進行介紹,并對目前開發(fā)的大田軟海綿酸的快速檢測技術:膠體金免疫層析技術、生物傳感器技術、化學發(fā)光免疫分析技術進行概述,并展望了大田然海綿酸快速檢測方法的未來發(fā)展。

大田軟海綿酸,貝毒,快速檢測

我國是赤潮頻發(fā)的國家,平均每年發(fā)生的頻率和累計面積都有增加的趨勢[1]。由于人類活動范圍的擴大以及社會發(fā)展的需求,導致海洋污染越來越嚴重。海水富營養(yǎng)、近海的氮磷量增加促進了藻類的生長[2]。這不僅對海洋生物造成了極大威脅，也對人類的身體健康構成了較大的危害,同時阻礙了我國海鮮產業(yè)的發(fā)展。

大田軟海綿酸(Okadaic acid簡稱OA)作為常見的一種主要存在于藻類植物中的小分子腹瀉型貝類毒素。其分布較廣,幾乎在每片海域都有存在。如今已被確定的能產生OA毒素的產毒藻主要包括鰭藻屬(Dinophysisspp.)和原甲藻屬(Prorocentrumspp.)的甲藻,如:倒卵形鰭藻(D. fortii)、尖銳鰭藻(D. acuta)、帽狀鰭藻(D.mitra)、三角鰭藻(D. triposs)、具尾鰭藻(D. caudata)、圓形鰭藻(D. rotundata)、漸尖鰭藻(D. acuminata)、微小原甲藻(P. minimum)、利瑪原甲藻(P. lima)等[3]。貝類,魚類攝食后多富集于體內。海鮮類食品被OA污染后食用會引起急性中毒,雖沒有致死報道,但威脅人類的身體健康。本文通過簡要介紹OA結構性質,毒理藥理,國內外限定含量以及快速檢測技術進行闡述,并展望OA的快速檢測。

1 大田軟海綿酸結構以及性質

OA(Okadaic acid)又名軟海綿酸,岡田酸,黑海綿酸。分子式為C44H68O13(如圖1)。其擁有17個手性中心及3個螺環(huán)縮酮前體基團[6],分子量為805.00。OA是一種脂溶性物質,對于一般性的加熱烹調處理較穩(wěn)定[5]。OA是DSP(Diarrhetic Shellfish Poisoning)的主要組成部分,無色晶體，能溶于甲醇、乙醇、氯仿和乙醚等有機溶劑,不溶于水[4],輻射光對組織內的OA影響甚小,但對飲用水中的OA具有顯著效果[7]。OA中毒患者出現的中毒癥狀主要是腸胃失調,如腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐等。潛伏期短,一般在 48 h內基本康復[5]。

圖1 大田軟海綿酸結構圖Fig.1 Structure of okadaic acid

由于其標準品昂貴,難以獲得,且多為國外產品,因此檢測和提取都相當困難。目前針對OA中毒并無有效的藥物治療方法,但有研究表明茶多酚能夠顯著改善OA誘導的大鼠海馬神經元損傷[9],這也為針對OA藥物的研發(fā)奠定了基礎。

2 大田軟海綿酸的毒理與藥理特性

OA是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶抑制劑[8]。OA對不同的蛋白磷酸酶抑制程度不同:PP2A(蛋白磷酸酶2A)抑制最強烈,其次是PP1(蛋白磷酸酶1)和PP2B(蛋白磷酸酶2B)[10]。OA具有促進多種細胞凋亡的作用[11]。張銳[12]發(fā)現,OA對還原性谷胱甘肽(GSH),超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT)均有顯著抑制作用。但也有研究證明OA 具有誘導癌變和促進凋亡雙重效應。OA能夠引起人肝癌細胞,人肺癌細胞凋亡[11,13]。近期發(fā)現calyculin-A(CA)與okadaic acid(OA)聯(lián)合作用能夠抑制類乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231[14]。呂麗麗[15]運用多種方法已初步驗證OA對人肺腺癌A549細胞系具有明顯的殺傷作用?？梢钥闯鯫A對癌細胞具有一定的殺傷力,因此可考慮潛在的藥用價值。

3 各國對海洋產品中OA濃度的限制

隨著腹瀉性貝毒危害發(fā)生頻率的不斷增加,物流行業(yè)的不斷發(fā)展,OA分布區(qū)域從沿海不斷擴大到內陸,對人們的生活造成嚴重影響,也對各國海產品進出口造成嚴重影響。如今已成為國際上高度關注的食品安全問題。在日本,OA的檢測方法是生物法,其最低檢出限是0.05 MU/g。在歐洲,根據(EC)853號/2004法規(guī),已經建立最大允許水平160 μg/kg貝肉[16]。但歐洲食品安全局(EFSA)提出了將OA的最大允許水平從160 μg/kg減少至45 μg/kg(歐洲食品安全局,2008)[17]。我國通過參考各國的標準,并運用小鼠生物檢測的方法確定OA含量大于0.05 MU/g的樣品即被認為是有害的[18]。

4 快速檢測方法

傳統(tǒng)測定OA濃度的方法有很多,包括小鼠生物測定、高效液相色譜(HPLC)技術、蛋白磷酸酶抑制(PPI)檢測等方法[19-22]。由于缺乏特異性、費時、其他物質的干擾產生假陽性以及生物倫理問題,因此其他的方法很受期待。例如高效液相色譜耦合其他各種檢測器,包括質譜,串聯(lián)質譜(MS/MS)都是有效識別和定量OA的方法[23-24],但是其樣品準備費時費力,而且需要昂貴的設備和熟練的操作人員。因此需要發(fā)展快速檢測的方法以及現場檢測。

4.1 膠體金免疫層析技術(Colloidal gold immuno chromatography)

圖2 免疫層析試紙條結構圖Fig.2 Structure of Immune chromatography test strip

膠體金免疫層析技術就是運用免疫學中抗原抗體特異性結合的原理,在層析過程中實現這一反應,從而能夠定量或半定量[29-30]檢測,其準確性高,特異性強,穩(wěn)定性好。與傳統(tǒng)的小鼠生物法和 HPLC方法相比，其成本大大降低,且易于制備,價格低廉,樣品只要簡單的提取即可用于檢測,具有檢測時間短、且易于觀察,也不需要專業(yè)人員操作等優(yōu)點。胡樂琴[31]使用自制的腹瀉性貝毒OA單克隆抗體與BSA偶聯(lián)物為膠體金標記底物研究OA膠體金免疫檢測術。使用粒徑為30 nm的膠體金標記OA抗體依據免疫競爭法原理,建立了快速檢測OA的免疫層析試紙條方法,該方法在3～5 min 即可目測判斷結果,靈敏度為6.25 ng/mL。

膠體金免疫層析技術作為一種新型快速檢測與診斷技術,通過不斷地改進和完善,控制膠體金的穩(wěn)定性與存放時間,提高整體檢驗的靈敏度或將對水產品中OA的檢測得到快速的發(fā)展。

4.2 生物傳感器技術(Biosensor technology)

生物傳感器是一門由生物、化學、物理、醫(yī)學、電子技術等多種學科互相融合發(fā)展起來的高新技術,在生物醫(yī)學、環(huán)境檢測、食品、醫(yī)藥以及軍事醫(yī)學等領域有著重要應用價值。生物傳感器通過固定化的生物活性物質(酶、抗原、抗體等)作為生物敏感單元,對待測物質具有高度選擇性的檢測工具。生物傳感器主要通過兩個單元組成:識別元件與轉換元件。識別元件通常為生物體分子,組織或者個體細胞分子辨認組件作為信號接收或產生部分。轉換元件屬于硬件儀器組件,主要是物理信號轉換組件(電信號或光信號等)。其通過物理、化學型信號轉換器捕獲目標物與酶感基元之間的反應,再用離散或連續(xù)的電信號將反應程度表達出來,從而得出被測物的濃度。當待測物質與識別元件特異性結合后,形成復合物或產生光、電、熱、聲、電位等，通過換能器將轉變?yōu)榕c待測物濃度有關的電信號或光信號輸出,達到分析檢測目的,如圖3[32]。

圖3 生物傳感器的基本原理Fig.3 Basic principles of biosensors

酶電極是最早的生物傳感器原型,是在20世紀60年代由Clark教授最先提出的酶電極設想[33]。但酶電極的壽命一般比較短暫,且高純度的酶也相當昂貴。因此,人們開始對酶電極進行衍生,如微生物電極、細胞器電極以及新型的傳感器。隨后生物傳感器技術作為不斷發(fā)展的對象,生物傳感器也日新月異。如今在OA檢測上也得到了巨大的發(fā)展。Xi Z[34]研制出一種基于Love波的HepG2細胞傳感器,結果表明,該傳感器對OA的檢測具有廣泛的線性檢測范圍(10～100 μg/L),并且能夠實時便捷的檢測OA。Hayat A[35]以超順磁珠納米技術為基礎研制一種間接競爭酶聯(lián)免疫傳感器。其檢測限為0.38 μg/L,檢測時間也只需要60 min,達到快速、高效檢測的效果。Kaiqi Su[36]利用酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA定量檢測的方法,研制了一種定量檢測試劑盒-生物酶傳感器,并研發(fā)出配套的現場快速檢測儀器-仿生電子眼(Bionic e-Eye),研制出擁有我國自主知識產權的 OA 定量檢測試劑盒,其檢測限為0.19 μg/L,檢測范圍為0.2～5.0 μg/L,達到了國外同類試劑盒的技術指標,同時配套研發(fā)的基于移動終端的 Bionic e-Eye用于OA毒素的現場檢測,能夠達到商用酶標儀在實驗室環(huán)境下的檢測水平。填補了OA毒素現場檢測儀器的空白,因此具有良好的研究價值和實際應用前景。

隨著生物傳感器的不斷發(fā)展,多科學相互融合,生物傳感器具備選擇性好,靈敏度高,特異性強,分析速度快,成本低廉,能在復雜的體系中進行連續(xù)監(jiān)測,具有高度的自動化,微型化,集成化,減少對使用環(huán)境和技術的要求,也適合在現場分析,在多科學領域都有相當大的應用價值,也在食品檢測行業(yè)得到顯著的發(fā)展。

4.3 化學發(fā)光免疫分析技術(chemiluminescence immunoassay,CLIA)

化學發(fā)光免疫分析是由免疫分析技術和化學發(fā)光技術融合而成的一種快速檢測技術,是利用儀器分析化學反應產生光的強度來確定待測物的濃度。化學發(fā)光免疫分析技術是化學發(fā)光物質標記抗原抗體物質,在與待測的抗原或抗體結合后,將被標記的結合物提取出來,再與相關物產生化學發(fā)光,從而對抗原或抗體進行定量或定性檢測[37]。目前在食品行業(yè)多檢測生物毒素[38],微生物[39],獸藥殘留[40],農藥殘留[41]等。

化學發(fā)光免疫分析技術根據方法可分為三類:化學發(fā)光標記免疫分析、酶標化學發(fā)光免疫分析以及電化學發(fā)光免疫分析?；瘜W發(fā)光標記免疫分析是在抗原或抗體上直接標記化學發(fā)光物質,再與待測抗原或抗體結合,通過檢測發(fā)光物質的光強度進行定性或定量分析。通常用魯米諾類,吖啶類和銥復合物物質作為發(fā)光物[42]。酶標化學發(fā)光免疫分析是用酶作為標記物,標記在抗原抗體上,在酶與發(fā)光底物的作用下產生光信號。一般使用的酶主要是堿性磷酸酶(ALP)以及辣根過氧化物酶(HRP)。這兩種酶均有相應的化學發(fā)光底物,利用一些胺類,酚類以及他們的衍生物能夠增強發(fā)光的作用[43]。王權[44]等人建立了酶促化學發(fā)光檢測技術并初步研制出試劑盒,樣品檢測限為1.232 ng/kg。劉威等[45]人建立了更加可靠的DSP細胞F-肌動蛋白熒光檢測法,其利用鬼比環(huán)肽標記F-肌動蛋白,通過酶標儀檢測熒光強度檢測樣品樣品中的OA,通過發(fā)光強度定量地檢測毒素的含量。并與ELISA結果進行比較。該方法比ELISA方法的檢出率高出5%。電化學發(fā)光免疫分析技術是由電化學反應引起的化學發(fā)光過程。是在電流或電壓的條件下,在電極上發(fā)生電化學反應而產生激發(fā)態(tài),當激發(fā)態(tài)轉變成基態(tài)時所產生的發(fā)光現象。電化學發(fā)光的底物一般多為釕聯(lián)吡啶[Ru(bpy)3]2+,能與抗原抗體結合成標記抗原抗體。電化學發(fā)光技術具有靈敏度高,準確快速而且可進行重復檢測,自動化等優(yōu)點[46]。

5 展望

隨著科學的發(fā)展,對OA的毒理、藥理研究不斷的深入,對OA檢測發(fā)展有重要的意義。高靈敏,高通量,現場檢測是OA檢測發(fā)展趨勢,如今在OA檢測中多用酶作為顯色媒介,由于酶具有不穩(wěn)定性,研制取代酶的發(fā)光媒介是未來OA檢測的發(fā)展方向。

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Progress in application of okadaic acid and rapid detection technology

QUAN Hao-ran1,PANG Lin-jiang1,ZHANG Yi-ming1,*,SUN Ying2,XUE Chao-bo2,LU Xing-hua1

(1.School of Agricultural and Food Science,Zhejiang A & F University,Lin’an 311300,China; 2.Zhoushan Institute for Food and Drug Control,Zhoushan 316021,China)

The okadaic acid is the representative of the diarrhetic shellfish poisoning in Marine toxin.Currently,detection methods of okadaic acid have drawbacks that consuming time and energy,expensive equipment,being incapable of rapid detection.This paper introduces the structure,toxicity and pharmacology of okadaic acid.The author introduces rapid detection technology of okadaic acid:colloidal gold immuno chromatography,biosensor technology,chemiluminescence immunoassay,and looks forward to the future development of rapid detection method of okadaic acid.

okadaic acid;shellfish toxins;rapid detection

2016-10-19

權浩然(1993-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：食品檢測與安全研究，E-mail：450782713@qq.com。

*通訊作者:張宜明(1973-)，男，博士，副教授，主要從事食品檢測與安全研究，E-mail：40293866@qq.com。

浙江省科技計劃項目(2016C32082)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)11-0391-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.067