張欣怡,王威浩,鄧麗莉,姚世響,曾凱芳,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715)

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水果及其制品中展青霉素的研究進(jìn)展

張欣怡1,王威浩1,鄧麗莉1,姚世響1,曾凱芳1,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715)

展青霉素是一種毒性極強(qiáng)的真菌毒素,廣泛存在于水果及其制品中,嚴(yán)重危害人類健康。本文綜述了近年來(lái)水果及其制品中的展青霉素的研究進(jìn)展,介紹了展青霉素的相關(guān)性質(zhì),分析了展青霉素的生物合成及降解機(jī)制,并論述了展青霉素的檢測(cè)方法及相關(guān)微生物對(duì)展青霉素的脫除效果。

展青霉素,毒性,生物合成,檢測(cè),控制

我國(guó)水果的產(chǎn)量及銷量均居世界前列,各類水果及其加工制品銷往世界各地。展青霉素是一種毒性極強(qiáng)的真菌毒素,廣泛存在于各類水果中,特別是發(fā)生霉變的水果中。因此被展青霉素污染的水果及其制品不僅威脅到我國(guó)加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,更危害人類的生命健康。本文綜合介紹了展青霉素的相關(guān)性質(zhì)、目前展青霉素在水果中的污染現(xiàn)狀、其生物合成途徑以及相關(guān)檢測(cè)及控制方法。

1 展青霉素的介紹

1.1 展青霉素的理化性質(zhì)

展青霉素又稱為棒曲霉毒素(Patulin,簡(jiǎn)稱PAT),易溶于水、氯仿、丙酮、乙醇及乙酸乙酯,微溶于乙醚和苯,不溶于石油醚[1]。由于展青霉素易溶于水并且在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定,在果蔬加工過(guò)程中難以清除,在水果制品中的殘留量很大。此外,展青霉素具有明顯的基因、遺傳、免疫及細(xì)胞毒性。

1.2 產(chǎn)生菌株

展青霉素是一種毒性極強(qiáng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,能產(chǎn)生展青霉素的真菌有青霉菌屬的擴(kuò)展青霉、展青霉、梅林青霉、圓弧青霉、新西蘭青霉、產(chǎn)黃青霉、婁地青霉、石狀青霉、粒狀青霉、棒型青霉,曲霉菌屬的巨大曲霉、土曲霉、土壤青霉、圓弧青霉、棒曲霉,絲衣菌屬的雪白絲衣霉等[2-4]。目前,水果中最常見(jiàn)的產(chǎn)毒菌株是擴(kuò)展青霉。

2 展青霉素在果實(shí)中的污染現(xiàn)狀

圖1 展青霉素生物合成途徑[13]Fig.1 Patulin biosynthetic pathway[13]

蘋果、梨、葡萄是擴(kuò)展青霉常見(jiàn)的宿主[5],當(dāng)腐爛果實(shí)進(jìn)入加工環(huán)節(jié),會(huì)將展青霉素帶入果汁、果酒等制品中。根據(jù)展青霉素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人類各器官組織的危害,且由于展青霉素對(duì)人類的致癌性證據(jù)不足,國(guó)際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)將展青霉素對(duì)人類的致癌性列為第三類。目前,各國(guó)已制定相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn),限定水果及其相關(guān)制品中的展青霉素含量。歐盟(European Union,EU)、美國(guó)食品與藥物管理局(US Food and Drug Administration,USFDA)規(guī)定果汁產(chǎn)品中展青霉素的最大限量為50 μg/kg,WHO規(guī)定蘋果汁中展青霉素的最高限量標(biāo)準(zhǔn)為50 μg/kg;我國(guó)在GB 2761-2011中規(guī)定蘋果、山楂制品中展青霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)為50 μg/kg。

圖4 Penicillium expansum和Aspergillus clavatus中的展青霉素生物合成基因簇[23]Fig.4 Patulin gene cluster of Penicillium expansum and A.clavatus[23]注:箭頭表示基因的轉(zhuǎn)錄方向。

Forouzan[6]等對(duì)來(lái)自伊朗的72份蘋果汁樣品進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)所有樣品的展青霉素含量平均水平為48.64 μg/L,其中29%的樣品展青霉素含量超過(guò)最高限量標(biāo)準(zhǔn)50 μg/L。Zouaoui[7]等對(duì)來(lái)自突尼斯的214個(gè)樣品進(jìn)行展青霉素測(cè)定分析發(fā)現(xiàn),50%的樣品中展青霉素含量在2～889 μg/L之間,且其平均水平為89 μg/L,其中22%的樣品超過(guò)最高限量標(biāo)準(zhǔn)。Funes[8]等人對(duì)阿根廷的45份蘋果醬、蘋果泥及蘋果果凍、6份梨果醬進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)發(fā)現(xiàn),蘋果制品中有10個(gè)檢出展青霉素,而梨果醬中僅有1個(gè),其中蘋果泥污染嚴(yán)重,污染率高達(dá)50%,平均污染濃度為123 μg/kg。魯琳[9]等對(duì)2005年～2007年廣東省市售的83份蘋果汁及山楂制品進(jìn)行了展青霉素含量的測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)6份檢出展青霉素,其中一份超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)50 μg/kg?？傮w而言,展青霉素在各國(guó)的水果及其制品中檢出率較高,對(duì)消費(fèi)者的健康存在嚴(yán)重威脅,需要引起重視。

3 展青霉素的生物合成途徑

3.1 展青霉素的生物合成途徑

展青霉素屬于聚酮途徑代謝物,聚酮類毒素還包括黃曲霉毒素(黃曲霉),伏馬菌素(串珠鐮刀菌)以及赭曲霉毒素(純綠青霉、赭曲霉)等[5]。且目前為止,展青霉素的生物合成途徑中涉及到催化的反應(yīng)過(guò)程及相關(guān)酶見(jiàn)圖1[10-16]。

在上述十步途徑過(guò)程中,一些研究表明在第四步中兩個(gè)途徑都是可能的,但間-羥基苯甲醛途徑較為優(yōu)先發(fā)生[17],另一些研究認(rèn)為間-羥基苯甲醛并不會(huì)轉(zhuǎn)化為龍膽醛而是轉(zhuǎn)化成間羥基苯甲酸(m-hydroxybenzoic acid)[18]。

表1 展青霉素基因簇中各個(gè)基因的功能預(yù)測(cè)[10-11]Table 1 Characteristics of genes identified ai belonging to the patulin gene cluster[10-11]

3.2 展青霉素生物合成基因簇

根據(jù)目前的研究,控制真菌毒素合成的基因在基因組上常以基因簇的形式存在[19-21]。Tannous[22]通過(guò)基因組步移法獲得P.expansum完整的展青霉素合成基因簇,該基因簇全長(zhǎng)40217 bp,包括15個(gè)基因,分別為PePatA～PePatO。

Li[23]通過(guò)在NCBI的核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì),預(yù)測(cè)了這15個(gè)基因的功能。在15個(gè)基因中,PePatL可能編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,PePatA、PePatC和PePatM分別編碼醋酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,基因簇中的3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能與Pat合成過(guò)程中的底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。另外還包括9個(gè)編碼催化酶的基因(PePatB、PePatD、PePatE、PePatG、PePatH、PePatI、PePatK、PePatN、PePatO),以及2個(gè)功能未知基因(PePatF和PePatJ)。此外,通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)證明PePatL和PePatK在展青霉素合成途徑中起到關(guān)鍵作用。

4 水果及其制品中展青霉素的檢測(cè)方法

4.1 薄層色譜法

薄層色譜法(TLC)是最早用來(lái)檢測(cè)展青霉素的方法,我國(guó)將此法定為蘋果和山楂制品中展青霉素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。此方法在樣品預(yù)處理時(shí)需要經(jīng)過(guò)萃取、凈化、濃縮、薄層展開等步驟,TLC法的優(yōu)點(diǎn)在于儀器設(shè)備簡(jiǎn)單,經(jīng)濟(jì),但缺點(diǎn)是樣品前處理操作繁瑣費(fèi)時(shí),雜質(zhì)干擾較嚴(yán)重,有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性,需作進(jìn)一步確證[24]。因此目前已很少使用此方法檢測(cè)果汁中的展青霉素。

4.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)靈敏度高、選擇性好、可操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高已廣泛應(yīng)用于測(cè)定展青霉素含量[25]。孟瑾[26]采用固相萃取技術(shù)對(duì)蘋果汁山楂制品中的展青霉素進(jìn)行提取、純化,再用果膠酶降解樣品中的果膠質(zhì),最后采用反相液相色譜柱分離測(cè)得展青素回收率較高,此方法被農(nóng)業(yè)部采納作為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。Maragos[27]采用UPLC-PDA(超高效液相-發(fā)光二極管技術(shù))對(duì)36個(gè)蘋果皮及果肉樣品中的展青霉素進(jìn)行檢測(cè),并檢出14個(gè)樣品中含有展青霉素含量超過(guò)3.5 μg/kg,有9個(gè)樣品超過(guò)12 μg/kg,僅有1個(gè)樣品超過(guò)歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)(50 μg/kg)。

4.3 色譜聯(lián)用技術(shù)

目前常采用的色譜聯(lián)用技術(shù)是氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)和液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)。GC/MS對(duì)樣品進(jìn)行前處理時(shí)操作繁瑣,且需要衍生劑。大多數(shù)采用三甲基硫烷或七氟基丁酸鹽作衍生劑,并與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用檢測(cè)[28],此方法應(yīng)用于蘋果汁中展青霉素的檢測(cè),其平均回收率高達(dá)80%～90%。Sewram[29]等人采用液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定蘋果汁中的展青霉素,檢出限為4 μg/L。Takino[30]等通過(guò)比較大氣壓化學(xué)電離(APCI)或大氣壓光化電離(APPI)技術(shù)和LC/MS結(jié)合檢測(cè)展青霉素所用時(shí)間,發(fā)現(xiàn)APPI可大大縮短檢測(cè)時(shí)間,同時(shí)回收率在94.5%～103.2%之間,檢出限為1.03～1.50 μg/L。毛艷玲等[31]采用QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)前處理技術(shù)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)對(duì)腐爛蘋果腐爛部位及未腐爛部位中展青霉素進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,腐爛部位及未腐爛部位的展青霉素的含量分別為0.147～40.808 μg/g和0.0016～1.254 μg/g。Seo[32]采用同位素稀釋-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用/質(zhì)譜技術(shù)(Isotope dilution-liquid-chromatography/mass ID-LC-MS/MS)對(duì)新鮮蘋果、蘋果汁及蘋果果醬中的展青霉素進(jìn)行檢測(cè),對(duì)展青霉素含量在3～40 μg/kg之間的樣品檢測(cè)不確定度約為1%。

4.4 微乳電動(dòng)色譜法

微乳電動(dòng)色譜法(Microemulsion electrokinetic chromatography,MEECK)可定量檢測(cè)蘋果汁中的展青霉素。Murillo-Arbizu[33]等人研究發(fā)現(xiàn)采用此方法測(cè)定展青霉素,平均回收率為75.3%,定量限和檢出限分別是8.0、3.2 μg/L。據(jù)報(bào)道,MEECK選擇性更強(qiáng),分離效率更高,但這種方法的靈敏度不高,無(wú)法應(yīng)用于樣品濃度低于3.2 μg/L的展青霉素檢測(cè)[34]。

4.5 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)側(cè)重于快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。檢測(cè)時(shí),展青霉素先與衍生劑進(jìn)行衍生,再與牛血清蛋白結(jié)合構(gòu)成抗原,制備出多克隆抗體,通過(guò)抗體特異性來(lái)檢測(cè)展青霉素[35-36]。但展青霉素?zé)o免疫源性,使得其抗體制備困難,抗體特異性差、親和力小[1]。Wang[37]認(rèn)為由于抗原分子小,受外界影響較大,可能出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。因此開發(fā)快速檢測(cè)試劑盒或者建立靈敏、快速、簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢測(cè)方法十分重要。此外,Pennacchio[38]等在近紅外熒光色譜基礎(chǔ)上,建立了熒光偏振免疫分析技術(shù)檢測(cè)展青霉素含量,其檢出限為0.06 μg/L。

5 水果及其制品中展青霉素的控制方法

在果實(shí)貯藏過(guò)程中,抑制病原微生物的侵染是從根本上控制展青霉素的產(chǎn)生的主要途徑。一旦病原微生物成功侵染果實(shí)并合成了展青霉素,則需要靠相關(guān)控制技術(shù)來(lái)降低成品中展青霉素的殘留量。

5.1 物理降解

目前,常采用的物理法有紫外輻照、電磁輻射、微波處理等。吸附法是目前研究較廣泛的物理方法,利用諸如活性炭[39-41]、樹脂[42]、硅膠[43]及其他多孔物質(zhì)的吸附作用,吸附液態(tài)環(huán)境中的展青霉素。此外,分子印跡技術(shù)也被用于降解果汁中展青霉素[44]。李倩倩等[45]將分子印跡聚合物與固相萃取富集材料結(jié)合,并與高效液相色譜聯(lián)用,對(duì)濃縮蘋果汁、梨汁、山楂汁和山楂片中展青霉素進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),檢測(cè)限為0.50 μg/L,線性范圍為2～40 μg/L,添加回收率在60.13%～97.60%,降解效果較好。但由于此方法生產(chǎn)成本昂貴或工藝流程繁瑣,目前仍停留在實(shí)驗(yàn)階段,生產(chǎn)中尚未見(jiàn)有實(shí)際應(yīng)用。

5.2 化學(xué)降解

化學(xué)法降解展青霉素也有一定效果。據(jù)報(bào)道[46],含硫化合物能夠與展青霉素結(jié)合,但其形式不穩(wěn)定。此外維生素[47]、殺菌劑[48]、臭氧處理[49]均可降解展青霉素。但需要指出的是,殺菌劑的應(yīng)用會(huì)對(duì)人類健康造成危害;添加化學(xué)物質(zhì)雖可破壞展青霉素毒性,但化學(xué)劑對(duì)人類危害嚴(yán)重同時(shí)污染環(huán)境。

5.3 微生物降解

為降低成本、提高降解效率,采用微生物對(duì)侵染果實(shí)的病原菌進(jìn)行控制,進(jìn)一步減少展青霉素的含量或降低展青霉素的毒性。Cao[50]發(fā)現(xiàn)常溫貯藏(20 ℃)時(shí),畢赤酵母(Pichiacaribbica)可顯著降低蘋果青霉病的發(fā)病率,且可有效減少展青霉素的含量。Spadaro[51]等將蘋果置于22 ℃和1 ℃環(huán)境中,通過(guò)接種實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima和Metschnikowiafructicola)均可減少展青霉素在蘋果中的積累,其中1 ℃下貯藏56 d后的蘋果,接種Metschnikowiafructicola的蘋果中的展青霉素含量顯著低于對(duì)照組,并且達(dá)到化學(xué)殺菌劑防治效果。Castoria[52]等用體外實(shí)驗(yàn)的方法發(fā)現(xiàn)粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)和羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)等能夠降解展青霉素。Morales[53]等發(fā)現(xiàn)低溫貯藏(1 ℃)時(shí),將清酒假絲酵母(Candidasake)損傷接種于蘋果上可有效減少展青霉素在蘋果上的積累,且低濃度的酵母孢子懸浮液控制效果更佳。Tolaini[54]等研究發(fā)現(xiàn),羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)本身對(duì)擴(kuò)展青霉在蘋果上的生長(zhǎng)及展青霉素產(chǎn)生有抑制作用,用香菇(Lentinulaedodes)培養(yǎng)液培養(yǎng)羅倫隱球酵母能夠增強(qiáng)這種抑制作用。Guo[55]將吸附效果較好的失活酵母制備成菌粉,發(fā)現(xiàn)菌粉對(duì)蘋果汁中展青霉素的吸附能力強(qiáng)于商業(yè)化失活菌粉。S.Hatab[56]采用10種實(shí)驗(yàn)室制備的失活微生物對(duì)展青霉素進(jìn)行分解,發(fā)現(xiàn)Lactobacillusrhamnosus6224和Enterococcusfaecium21605對(duì)展青霉素的分解率分別達(dá)到80.4%和64.5%;并且還指出,對(duì)展青霉素的吸附作用還受到真菌初始濃度、吸附溫度、失活微生物的菌體數(shù)量的影響。

6 結(jié)論及展望

隨著人類對(duì)水果需求量的增加,人們?cè)絹?lái)越關(guān)注水果中真菌毒素的存在情況。因此我們應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)展青霉素的防治,避免在果實(shí)加工過(guò)程中,被污染的果實(shí)中含有的展青霉素帶入水果制品中。而目前,生物防治技術(shù)作為新型處理污染物的方法被人們密切關(guān)注。但我國(guó)對(duì)微生物降解展青霉素的機(jī)制方面的研究較少,因此接下來(lái)我們應(yīng)尋找一種高效、快速、便捷檢測(cè)果實(shí)中展青霉素的方法,同時(shí)應(yīng)積極研究其生物防治的機(jī)制,為我國(guó)食品行業(yè)提供有效的理論基礎(chǔ)。

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Research progress in patulin of fruits and its products

ZHANG Xin-yi1,WANG Wei-hao1,DENG Li-li1,YAO Shi-xiang1,ZENG Kai-fang1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China; 2.Chongqing Special Food Engineering and Technology Research Center,Chongqing 400715,China)

Patulin is a toxic secondary metabolites,it widely exists in fruits and its products. It is one of the most harmful mycotoxins to human beings. This paper briefly reviewed the research situation of the patulin in the fruits and its products in recent years. This articles introduced its properties and analyzed its biosynthesis mechanism and biological degradation mechanism,particularly focused on the detection methods of patulin and biological control of patulin.

patulin;toxicity;biosynthesis;detection;control

2016-10-28

張欣怡(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:15730096695@163.com。

*通訊作者:曾凱芳(1972-)，女，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏工程，E-mail:zengkaifang@163.com。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題(2015BAD16B07)；重慶市社會(huì)民生科技創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目(cstc2015shmszx80004)；重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目(cstc2016shms-ztzx80005)。

TS

A

1002-0306(2017)11-0379-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.065