孔 靜,易美君,許 昕,姜 麗,郁志芳

(南京農業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

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冷藏期間蘋果果實能量和NADP-蘋果酸酶及基因表達的變化

孔 靜,易美君,許 昕,姜 麗,郁志芳*

(南京農業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

為研究冷藏期間蘋果果實能量水平和NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)及基因表達的變化情況,本研究以‘長富2’蘋果果實為實驗材料,定期測定果實硬度、可溶性固形物等品質指標和能量相關物質三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、磷酸腺苷(AMP)含量和能荷變化及NADP-ME、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性。結果顯示,冷藏期間,‘長富2’果實ATP含量貯藏前60 d下降，而后恢復到貯藏初期水平,ADP和AMP貯藏前60 d稍有降低后,隨時間延長顯著增加;NADP-ME和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性均隨貯藏時間延長逐漸降低;輔酶Ⅱ(NADP+)和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)含量在貯藏前120 d先增加后下降,與能荷變化相似;MdcyME1-MdcyME3基因表達雖在時間上有一定差異，但表現出相似的先增加后下降的趨勢。冷藏期間蘋果果實能量水平和利用效率發(fā)生了改變,且能量水平與NADP-ME活性及其基因表達在統(tǒng)計學上存在相關性。

蘋果,機械冷藏,能量代謝,酶活,基因表達

蘋果(MalusdomesticaBorkh)屬于薔薇科蘋果屬,果實酸甜可口,富含礦物質和維生素,是人們最常食用的水果之一。蘋果較水蜜桃等耐貯藏,但仍受采后迅速成熟、呼吸躍變等因素的制約。冷藏是目前果品保鮮中采用較廣泛且有效的技術手段之一。低溫能抑制果實的各種代謝活動,延緩果實后熟軟化,達到保鮮的目的[1-2]。

蘋果的成熟衰老是個復雜的過程,伴隨著一系列生理生化反應,如乙烯的生成、葉綠素和細胞壁的降解等,從而引起果實在質地、風味等方面的改變,這些反應過程伴隨著能量水平的改變。能量水平與果實成熟衰老密切相關,而國內外對蘋果成熟衰老的諸多研究主要集中在品質、生理生化和調節(jié)控制方面,其中專注于能量水平的研究相對缺乏。能量在細胞生命活動中起樞紐作用,細胞需要足夠的能量來維持正常的代謝進程,保持生長、生物合成等重要的生理功能。研究發(fā)現ATP合成與膜脂降解之間存在相關性,能量代謝對細胞膜完整性起著重要的調節(jié)作用[3];能量虧損會促進活性氧積累,破壞細胞膜完整性,從而導致果實衰老[4],因此維持能量供應便能保證細胞膜完整性,進而可延緩果實衰老。

蘋果酸是蘋果中主要的有機酸,NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)是調控蘋果酸代謝的關鍵酶,可催化蘋果酸進行氧化脫羧反應。Liu等[5]研究了1-MCP處理對蘋果中有機酸代謝及NADP-ME活性的調控作用,證明NADP-ME有降解蘋果酸的作用。目前,NADP-ME活性的變化及基因表達情況是關注的重點。

本研究以‘長富2’果實為試材,分析了冷藏期間果實能量水平和NADP-ME活性及其基因表達的變化情況,探索果實能量水平與果實成熟衰老的關系,從能量變化和分子層面為進一步研究延緩果實衰老技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘長富2’蘋果(MalusdomesticaBorkh.,cv. Changfu 2) 于2015年11月15日采收自江蘇省徐州市豐縣師寨果園,采摘后立即運至大沙河果園冷庫在0～2 ℃預冷,挑選個體大小一致、無機械損傷、病蟲害的果實,套網袋裝入瓦楞紙箱內,于17日運回實驗室進行實驗處理。果實隨機分為四組(每組90個果實),每個蘋果套網袋放于瓦楞紙箱內,紙箱置于冷庫中。貯藏(1～4 ℃)條件下,分別于0、60、120、180 d隨機從各組取平行樣品3個,每個平行30個果實,進行能量水平和NADP-ME基因表達相關指標的測定。果實去皮后取適量果肉,用液氮冷凍后存于-80 ℃待用。2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、高氯酸、磷酸鉀、異抗壞血酸、氫氧化鉀 分析純;甲醇、磷酸 色譜純;ATP、ADP、AMP標品 上海源葉生物科技有限公司。

FHM-5 Fruits Hardness Tester Japan;PAL-1 Pocket Refractometer Japan;Agilent HPLC Series 1200 安捷倫科技有限公司;TGL16M臺式高速冷凍離心機 長沙維爾康湘鷹離心機有限公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;KQ-300DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Alpha-1860A紫外可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司;Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System USA。

1.2 測定方法

1.2.1 硬度和可溶性固形物含量的測定 用Fruits Hardness Tester(FHM-5,Japan)測定去皮果實硬度,下壓距離為5 mm,探頭直徑為5 mm,下壓速度為1 mm/s,重復取果測定10次,記錄數據,取平均值。用Pocket Refractometer PAL-1(Japan)測定果實可溶性固形物含量,重復取果測定10次,取平均值。

1.2.2 丙酮酸和蘋果酸含量的測定 丙酮酸測定采用2,4-二硝基苯肼法。取2 g果肉,研磨后加入25 mL 8%三氯乙酸(TCA),靜置30 min后取10 mL研磨液8000 r/min離心15 min。試管中依次加入1 mL上清液,2 mL 8% TCA,1 mL 0.1%的2,4-二硝基苯肼溶液,5 mL 1.5 mol/L的NaOH,搖勻顯色。在520 nm波長下比色,記錄吸光度。蘋果酸測定參考Zhang等采用HPLC法[6]。取2 g果肉,用8 mL超純水研磨成勻漿后轉入到10 mL離心管中,80 ℃水浴超聲1 h,冷卻后8000 r/min離心15 min,取5 mL上清液過濾到10 mL的容量瓶中,殘渣加入5 mL超純水再提取,再取5 mL上清液過濾,用超純水定容至刻度。用0.22 μm濾膜過濾待測。色譜條件為Kromasil C18反相柱(ODS,250 mm×4.6 mm),檢測波長為214 nm,流動相為甲醇和0.1%磷酸水(v∶v=2∶98),流速為1 mL/min,柱溫30 ℃。蘋果酸含量以mg/g表示。

1.2.3 NADP+和NADPH含量的測定 NADP+和NADPH含量均采用試劑盒(建成生物技術有限公司)測定。

1.2.4 三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、磷酸腺苷(AMP)和能荷(EC)的測定 參考Liu等[7]略作修改。取2 g果肉,研磨后加入6 mL 0.6 mol/L高氯酸冰浴1 min,8000 r/min、4 ℃離心10 min。上清液用1 mol/L KOH中和至pH6.5～6.8。冰浴30 min后8000 r/min、4 ℃離心20 min,取上清液定容至7 mL,用0.22 μm濾膜過濾待測。采用HPLC外標法測定。所用儀器為Hitachi HPLC D-2000。色譜條件為C18柱(250 mm×4.6 mm),檢測波長254 nm,流動相為甲醇(A)和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)(B)。線性梯度洗脫,時間為10 min,流速1 mL/min,柱溫20 ℃,流動相A在第0、7、9、10 min所占比例分別是0、20%、25%、0,進樣量20 μL。用ATP、ADP、AMP標品配制不同濃度ATP、ADP、AMP溶液并作標準曲線,ATP、ADP、AMP保留時間分別為7.11、8.21、9.55 min。

EC=([ATP]+0.5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])。

1.2.5 NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)和琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活性的測定 參考郭潤姿等[8],史娟等[9]的方法測定NADP-ME活性。取2 g研磨好的樣品,加入6 mL 預冷的研磨緩沖液(0.2 mol/L Tris-HCl,pH 8.2,0.6 mol/L蔗糖,10 mmol/L異抗壞血酸),在4 ℃ 4000×g下離心 20 min,取上清液5 mL用提取緩沖液(0.2 mol/L Tris-HCl,pH 8.2,10 mmol/L異抗壞血酸,0.1% Triton X-100)定容到10 mL,取其中6 mL加入等體積的提取緩沖液,混勻待測。反應體系為3 mL(0.8 mol/L Tris-HCl,4 mmol/L MnSO4,3.4 mol/L NADP,4 mmol/L蘋果酸及待測液),加入反應底物(蘋果酸)后立即用紫外可見分光光度計測定吸光度變化,記錄3 min,以每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活單位U。SDH活性用SDH試劑盒(建成生物技術有限公司)測定。

表1 ‘長富2’蘋果果實NADP-ME基因熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of NADP-ME genes for RT-qPCR in ‘Changfu 2’ fruit

1.2.6 蘋果果實總RNA提取及Real-time熒光定量PCR檢測 蘋果果實總RNA用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN,China)提取,用紫外分光光度計檢測RNA濃度、A260/A280,并進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA質量和完整性。RNA質量穩(wěn)定后用PrimeSciptTM RT Master Mix試劑盒(TaKaRa,Japan)去除DNA雜質并合成cDNA。在蘋果基因組數據庫(https://www.rosaceae.org/search/features)中搜索并篩選得到MDP0000132833、MDP0000285941、MDP0000376988三個cDNA序列。參考董慶龍等[10]并結合premier 5.0軟件設計引物(表1),選TUB為內參基因。熒光定量PCR包括95 ℃預變性30 s,95 ℃變性3 s和60 ℃復性延伸1 min組成的40個循環(huán)。所用儀器為Real-Time PCR System(Bio-Rad CFX96,USA),所有PCR反應均設3次平行管重復。PCR反應總體系(20.0 μL)為:cDNA模板1.0 μL,SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10.0 μL,上、下游引物各0.8 μL,水7.4 μL。用2-ΔΔCT法對結果進行數據分析。

1.3 數據統(tǒng)計分析

采用Excel及SPSS軟件進行數據統(tǒng)計分析,結果用平均值±標準差(SE)表示。

2 結果與分析

2.1 硬度和可溶性固形物含量

圖1 冷藏期間‘長富2’蘋果果實硬度和可溶性固形物含量的變化Fig.1 Change of firmness and TSS content in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

硬度和可溶性固形物是果實成熟衰老過程中表現果實品質的重要指標。圖1顯示,‘長富2’果實在整個冷藏期間呈現較高的硬度,并且隨貯藏時間的增加呈下降趨勢,由貯藏初期的7 kg/cm2(0 d)降至4 kg/cm2(180 d)。硬度在冷藏前120 d下降較為緩慢,后期急劇下降,由此推測果實在120 d后進入急劇衰老期。果實可溶性固形物含量則呈先上升后下降的趨勢,由14.6%(0 d)增加至15%(60 d),隨后下降至13.9%(180 d),這可能由于果實成熟初期淀粉降解導致還原糖含量上升,而后期還原糖被消耗有關。

2.2 丙酮酸和蘋果酸含量

圖2顯示,冷藏期間‘長富2’果實丙酮酸含量在前60 d保持基本不變,而后快速增加,貯藏180 d時達到貯藏初期的3.9倍。王翠華等[11]研究證明菌體在能荷下降時丙酮酸大量合成,由此推測貯藏后期丙酮酸含量急劇增加與后期能量代謝加快,能量虧損有關。蘋果酸作為三羧酸循環(huán)產能過程中重要的中間物質,其含量與能量水平的變化密切相關。蘋果酸含量在冷藏期間呈下降趨勢,貯藏前120 d表現尤其顯著,至貯藏結束時蘋果酸含量下降了41.6%。蘋果酸的減少與其作為呼吸底物被消耗有關,進而可影響果實風味變化。

圖2 冷藏期間‘長富2’蘋果果實丙酮酸和蘋果酸含量的變化Fig.2 Change of pyruvate and malate content in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.3 NADP+和NADPH含量

NADP+和NADPH可傳遞電子,參與生物體內的氧化還原反應,對生物體內各種代謝活動起調節(jié)作用[12]。NADPH可參與清除破壞膜結構的自由基[12],保持細胞膜完整性以延緩果實衰老。圖3顯示,機械冷藏期間‘長富2’果實NADP+和NADPH含量均呈先上升后下降趨勢,變化表現出同步和一致性。NADP+和NADPH含量最高值均出現在120 d,最高值分別可達19 nmol/g組織和31 nmol/g組織,比0 d時分別增加了450%和219%。貯藏120 d后果實NADP+和NADPH含量減少,這可能是因為貯藏后期果實代謝減慢,品質下降。

圖3 冷藏期間‘長富2’蘋果果實NADP+和NADPH含量的變化Fig.3 Change of NADP+ and NADPH content in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.4 ATP、ADP、AMP含量和能荷的變化

腺苷酸(ATP、ADP、AMP)是生物體重要的供能系統(tǒng),與許多生物反應相偶聯(lián),能量虧損會造成果實代謝功能紊亂,導致不可逆轉損傷[13-14]。圖4顯示,冷藏期間‘長富2’果實ATP含量在貯藏前60 d下降而后至120 d恢復到貯藏初期水平隨后又有所下降,呈現波動性變化。冷藏前期低溫減弱呼吸作用,降低整個代謝速率,導致ATP生成量少,中后期果實進一步成熟衰老,對ATP的需求促進了其積累,含量上升。與此對比,果實ADP、AMP含量在貯藏前60 d內先有一定幅度的下降而后顯著上升。貯藏前期新陳代謝旺盛,需要ADP、AMP生成ATP,貯藏后期果實進入衰老期,能量虧損,ATP降解形成ADP、AMP。果實能荷在冷藏前120 d一直保持在較高水平,120 d后急劇下降,果實的衰老裂變與能量水平密切相關,且能荷表示細胞中腺苷酸系統(tǒng)的能量狀態(tài)[12],因此能荷的這種變化可能與冷藏后期果實能量虧損,機體衰老有關。

圖4 冷藏期間‘長富2’蘋果果實ATP、ADP、AMP含量和能荷的變化Fig.4 Change of ATP,ADP and AMP content and energy charge in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.5 NADP-ME和SDH活性

圖5顯示,冷藏期間‘長富2’果實NADP-ME和SDH活性均呈顯著下降變化。NADP-ME活性在冷藏前120 d下降較緩慢,120 d后迅速下降,與蘋果酸含量出現相反的變化,表明NADP-ME起著降解蘋果酸的作用,且與能荷在冷藏前120 d保持較高水平,120 d后迅速下降變化相似。線粒體是細胞能量代謝和物質轉化的中樞,是ATP產生的重要場所[4],而SDH是線粒體內呼吸代謝關鍵酶,其活性下降會造成線粒體結構和功能破壞,影響能量生成。貯藏結束時,與0 d相比，NADP-ME酶活下降了3000 U,琥珀酸脫氫酶(SDH)下降了3500 (U/mg prot)之多,如此大的酶活變化提示‘長富2’果實有機酸代謝速率和能量水平發(fā)生了顯著變化。另外,需要注意的是‘長富2’蘋果果實中NADP-ME和SDH兩種酶活性呈同步性快速下降,提示果實成熟期間能量代謝速率發(fā)生了顯著變化。

圖5 冷藏期間‘長富2’蘋果果實NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的變化Fig.5 Changes of activities of NADP-ME and SDH in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.6 MdcyME基因表達

高等植物中編碼NADP-ME的基因不是唯一的,而是由多個基因組成的小基因家族編碼[10]。圖6顯示,冷藏期間MdcyME2和MdcyME3的相對表達量均呈先上升后下降的趨勢,且均在貯藏60 d達到最大表達量,表現出同步性,而MdcyME1表達量呈整體上升趨勢。MdcyME1相對表達量在貯藏60 d時可達0 d的1.8倍,且在貯藏后期也有1.46倍以上的表達量,而MdcyME2相對表達量在貯藏60 d時達到0 d的1.3倍,在貯藏后期降至0.5倍以下,基本不表達。MdcyME3在整個貯藏前4個月內表達量較高,可達0 d的3倍左右,但貯藏后期迅速下降,低至0.28倍,波動性較大。冷藏后期,NADP-ME活性持續(xù)下降,與MdcyME2和MdcyME3變化一致。以上結果表明MdcyME1-MdcyME3對NADP-ME的合成起重要作用,并不是合成NADP-ME的關鍵基因,且其表達具有階段性。

圖6 冷藏期間‘長富2’蘋果果實中MdcyME基因表達的變化Fig.6 Change of gene expression of MdcyME in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.7 蘋果果實能量水平與NADP-ME活性及其基因表達的相關性分析

對能量水平相關指標和NADP-ME活性及基因表達作相關性分析(表2)。ADP、AMP與NADP-ME活性呈顯著負相關,能荷與NADP-ME活性呈極顯著正相關,表明能量水平與NADP-ME相關;而ATP、NADP+、NADPH與NADP-ME活性無明顯相關關系,這可能與NADP-ME并不直接參與能量代謝有關,其具體機理還有待研究。ATP與MdcyME1呈顯著負相關,NADP+、NADPH與MdcyME1則呈顯著正相關關系;ADP、能荷與MdcyME2呈顯著正相關,AMP則與MdcyME2呈顯著負相關;ADP、AMP與MdcyME3呈顯著負相關,而能荷、NADPH與MdcyME3則呈極顯著正相關。以上結果表明能量水平(ATP、ADP和AMP)與NADP-ME活性及基因表達在統(tǒng)計學上存在相關性,其具體代謝相關性還有待深入研究。

表2 蘋果果實能量水平相關指標與NADP-ME活性及其基因表達的相關系數Table 2 Correlation analysis between indexes associated with energy level and activities and gene expression of NADP-ME in apple fruit

注:*表示在0.05水平上顯著相關,**表示在0.01水平上極顯著相關。

3 討論與結論

果實成熟衰老期間能量水平發(fā)生明顯變化。本研究中,蘋果果實冷藏后期能荷急劇下降,果實能量虧損,品質下降,表明果實成熟衰老與能量狀況相關。ATP含量冷藏前期下降后期上升,與冷藏期間荔枝果實ATP含量持續(xù)下降[15]存在差異,這可能與果實種類、貯藏時間長短等不同有關。蘋果整個180 d冷藏期間,ATP、ADP、AMP、蘋果酸和NADP(H)的含量變化表明果實能量水平降低,這可能與果實硬度和可溶性固形物含量下降,果實品質降低有關。研究表明,能量對維持細胞膜完整性具有非常重要的作用,能量虧損會導致細胞膜系統(tǒng)損傷[16],從而導致果實衰老[4],因此維持能量供應便能保證細胞膜完整性,進而可延緩果實衰老。由此可從維持果實能量水平方面研究果實保鮮的方法。

NADP-ME是與能量和碳水化合物代謝相關的蛋白質[17],對保持細胞滲透勢、pH等有重要作用。本研究中,蘋果果實NADP-ME活性在冷藏前期下降緩慢后期迅速下降,而能荷在冷藏前期保持較高水平而后期亦迅速下降,二者存在一定的相關性,表明前期較高的能量水平可能能夠延緩NADP-ME活性的下降,至于其具體代謝相關性和影響機理還有待研究。另外,NADP-ME降解蘋果酸的同時產生NADPH,使得NADPH不斷積累,以清除破壞膜結構的自由基,從而對延緩果實成熟衰老有一定作用。本研究中,蘋果果實NADP-ME和SDH活性呈同步的快速下降,表明蘋果果實成熟期間能量代謝速率發(fā)生了明顯變化,這可能是因為果實貯藏期間線粒體結構遭到了破壞[18],影響了能量生成效率。由此可為從提高NADP-ME和SDH活性方面探索延緩果實成熟衰老的方法提供理論依據。MdcyME1-MdcyME3在合成NADP-ME過程中起著重要作用,低溫可誘導NADP-ME基因表達,產生新NADP-ME維持膜的流動性,以保證細胞各項代謝活動正常進行[19]。MdcyME2和MdcyME3表達量呈先上升后下降趨勢,這可能是由于其貯藏前期受到低溫誘導而后期果實進入衰老期,并且這與蘋果果實能荷變化相似,由此推測蘋果果實較高的能量水平可能有利于NADP-ME的基因表達,其具體影響機理還有待研究。

本研究結果顯示,6個月的冷藏期間,‘長富2’果實蘋果酸持續(xù)減少、丙酮酸后期大量累積,貯藏中后期ADP和AMP增加而后期能荷急劇下降,NADP+和NADPH含量呈先上升后下降趨勢,NADP-ME和SDH兩種酶的活性亦同步快速降低,提示果實貯藏期間能量水平和利用效率發(fā)生變化,且與NADP-ME活性和其基因表達在統(tǒng)計學上存在一定的相關性,推測前期較高的能量水平可延緩NADP-ME活性的下降和保持NADP-ME的基因表達,有利于保持果實品質。

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Change of energy level and gene expression of NADP-dependent malic enzyme in apple fruit during refrigerated storage

KONG Jing,YI Mei-jun,XU Xin,JIANG Li,YU Zhi-fang*

(College of Food & Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In order to investigate the change of energy level and gene expression of NADP-dependent malic enzyme during storage,‘Changfu 2’ apple fruits were taken as experimental material. Fruit firmness,total soluble solid(TSS),the activity of NADP-dependent malic enzyme(NADP-ME)and SDH,contents of ATP,ADP,AMP and energy charge were determined during storage. The results showed that the ATP content in apple fruit during storage period declined for the first 60 days thereafter recovering to storage beginning level,while the ADP and AMP content in fruit declined slightly for the first 60 days thereafter increased significantly. Both activities of NADP-ME and SDH declined gradually during whole storage period. The content of NADP+and NADPH in apple fruit performed similar trend with the energy charge that all increased obviously for the first 120 days then declined in the last 60 days. Although there was some difference on the time course,the gene expression of MdcyME1-MdcyME3 performed similar trend that they all increased during the early storage and then declined. These results demonstrated the energy levels and efficiency in apple fruits changed during storage and energy level has relevance with the activities and gene expression of NADP-ME.

apple;refrigerated storage;energy metabolism;enzyme activity;gene expression

2016-12-02

孔靜(1991-),女,碩士,研究方向:采后生物學,E-mail:kongjingfly@163.com。

*通訊作者:郁志芳(1960-),男,博士,教授,研究方向:采后生物學,E-mail:yuzhifang@njau.edu.cn。

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(15)1022);江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室(2015022)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)11-0329-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.055