黃蘭平,靳麗萍,謝佳妮,張應(yīng)烙

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

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佛手的1H-NMR指紋圖譜研究

黃蘭平,靳麗萍,謝佳妮,張應(yīng)烙*

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

建立佛手的氫核磁共振(1H-NMR)指紋圖譜,為判別不同來源的佛手藥材及其質(zhì)量提供依據(jù)。利用核磁共振儀測定不同產(chǎn)地的佛手,對NMR數(shù)據(jù)分別進(jìn)行相似度法、聚類分析和主成分分析法評價(jià)。結(jié)果表明:金佛手和川佛手的相關(guān)系數(shù)均在0.95以上,而與廣佛手的相似度較低,相關(guān)系數(shù)均在0.86以下;金佛手和川佛手中的檸檬內(nèi)酯相對含量要比廣佛手多;聚類分析結(jié)果也說明廣佛手與金佛手及川佛手能夠明顯分開,而金佛手與川佛手比較相似;主成分分析得到四個(gè)主成分,其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到95.352%。該方法可以快速簡便地區(qū)分不同品種的佛手,可為佛手的質(zhì)量控制及使用提供參考。

1H-NMR指紋圖譜,佛手,聚類分析,主成分分析

佛手(CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle),別名枸櫞、枸櫞子、香泡,屬于蕓香科柑橘屬植物,主要分布于熱帶和亞熱帶,我國浙江、江西、福建、廣東、廣西、四川、云南等地均有栽培[1]。根據(jù)出產(chǎn)地不同,佛手可分為多個(gè)品種:產(chǎn)于廣東、廣西的藥用佛手稱為“廣佛手”,產(chǎn)于浙江金華的稱“金佛手”,產(chǎn)于四川等地稱“川佛手”。佛手具有較高食用和藥用價(jià)值,藥理實(shí)驗(yàn)表明其具有止咳平喘、改善心血管系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[2-3],在臨床上廣佛手、川佛手和金佛手均可入藥,然而大量研究結(jié)果表明,不同產(chǎn)區(qū)、品種的佛手化學(xué)成分差異明顯[4-7],會(huì)影響臨床療效[2]。

隨著氫核磁共振技術(shù)(Proton nuclear magnetic resonance,1H-NMR)發(fā)展,1H-NMR靈敏度逐步提高,核磁技術(shù)也隨之用于藥物分析中,且該法已被收載于2010 年版《中國藥典》附錄中[8]。1H-NMR指紋譜與傳統(tǒng)HPLC指紋譜相比,可以直接提供結(jié)構(gòu)信息,無需標(biāo)準(zhǔn)品,無須復(fù)雜前處理和預(yù)分離[9-10]。本文通過建立佛手的氫核磁共振(1H-NMR)指紋圖譜,為判別不同來源的佛手藥材及其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒸餾水,95%乙醇 分析純,北京化工廠;DMSO-d6Cambridge Isotope公司;不同產(chǎn)地的佛手 廣東肇慶(A)、廣西桂林(B)、金華赤松鎮(zhèn)(C)、金華羅店鎮(zhèn)(D)、四川樂山(E)、四川蘆山(F)、重慶江津(G)。

Bruker AVANCE Ⅲ 600型超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀 瑞士Bruker公司;AS7240B型超聲器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;BSl24S型1/1萬電子天平 德國Sartorius;RZ-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 供試樣品溶液的配制

供試樣品干佛手粉碎后過60目篩,精密稱取佛手樣品粉末8 g,加95%乙醇300 mL進(jìn)行超聲提取2次。每次1 h,合并提取液后過濾得濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑得粗浸膏,45 ℃烘箱烘干粗浸膏減少溶劑乙醇的影響。取20 mg上述粗浸膏,溶解于0.5 mL DMSO-d6中。

1.31H-NMR測試條件

采用zg30脈沖序列采集1.2制備的供試樣品溶液的1H-NMR圖譜。測定溫度298 K,觀測頻率600.13 MHz,譜寬5101.1 Hz,采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536,掃描次數(shù)4次,TMS為內(nèi)標(biāo)。

1.41H-NMR圖譜處理

分段積分法:應(yīng)用MetresNova軟件進(jìn)行分段積分,選擇δ0.70～8.14范圍的1H-NMR圖并以每δ0.04 作為1個(gè)單位進(jìn)行分段積分,得到各化學(xué)位移段與之相對應(yīng)的信號峰面積值,以ASCII格式輸出數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)共獲得180段積分(扣除水峰信號δ3. 26～3. 34、DMSO溶劑峰信號δ2.50～2.54和提取溶劑乙醇?xì)埩舴逍盘枽?.02～1.10及δ3.54～3.58)。將獲得的數(shù)據(jù)矩陣(180個(gè)變量× 7個(gè)樣品),根據(jù)相似度計(jì)算原理,利用Excel 2007軟件進(jìn)行相似度分析,導(dǎo)入SPSS軟件進(jìn)行聚類分析。

共有峰積分法:選取圖1中不重疊的18個(gè)質(zhì)子信號峰作為共有峰,計(jì)算積分面積,獲得共有峰面積值,導(dǎo)入SPSS軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份佛手供試樣品溶液,在上述1H-NMR按1.3項(xiàng)測試條件下連續(xù)6次測定指紋圖譜,用MetresNova軟件處理圖譜,采用1.4項(xiàng)下的積分方法得到一系列相對峰面積積分值。計(jì)算6組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù),分析儀器精密度。

1.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按1.2項(xiàng)方法下配制同一批次佛手供試樣品溶液6份,按1.3項(xiàng)下條件測試1H-NMR指紋圖譜,用1.4項(xiàng)下方法處理圖譜,計(jì)算6組數(shù)據(jù)相對峰面積積分值之間的相關(guān)系數(shù),考察其重復(fù)性情況。

1.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份佛手供試樣品溶液,分別在0、1、2、3、4、5 d按1.3項(xiàng)下條件測試1H-NMR指紋圖譜,用1.4項(xiàng)下計(jì)算6組數(shù)據(jù)相對峰面積積分值之間的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

精密度實(shí)驗(yàn)中分段積分法計(jì)算相差系數(shù)結(jié)果均在0.99以上,表明儀器是精準(zhǔn)的。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果均在0.99以上,表明該方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果均在0.99以上,表明供試樣品溶液在6 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.21H-NMR指紋圖譜

通過MetresNova軟件處理圖譜后得到7批佛手樣品的1H-NMR指紋圖譜(圖1)。通過直觀分析,可以看到廣佛手(廣東肇慶、廣西桂林)、金佛手(金華赤松鎮(zhèn)、金華羅店鎮(zhèn))、川佛手(四川樂山、四川蘆山、重慶江津)3個(gè)不同品種佛手提取物1H-NMR在大部分場區(qū)的輪廓大致相同,均含有黃酮類、糖類、有機(jī)酸類和脂肪酸類成分。但在部分場區(qū)仍有一定差異,例如在高場區(qū)(δ0.5～1.5,扣除δ1.1左右的乙醇?xì)埩羧胤?,廣佛手與川佛手有一定的差別,表明它們的有機(jī)酸及脂肪酸類等成分有差別;在δ3.3～3.6的區(qū)域中,不同基原的一些信號峰的強(qiáng)度存在著一定差異,廣佛手在該區(qū)域中的信號峰強(qiáng)度明顯弱于其他2個(gè)品種,表明3個(gè)基原品種間的化學(xué)成分含量有一定的差異。

圖1 7批不同來源佛手樣品溶液的典型1H-NMR指紋圖譜及其δ7.5～8.5局部放大圖Fig. 1 1H-NMR fingerprint of 7 batches sample solution of C. medica from different origins and partial enlarged detail between δ7.5～8.5注:A. 廣東肇慶;B. 廣西桂林;C. 金華赤松鎮(zhèn);D. 金華羅店鎮(zhèn);E. 四川樂山;F. 四川蘆山;G. 重慶江津;H. 檸檬內(nèi)酯。

已有研究表明檸檬內(nèi)酯(又稱檸檬油素)(分子結(jié)構(gòu)式見圖2)在佛手藥材中含量較高,是金佛手、廣佛手和川佛手中的一個(gè)主要的次級代謝產(chǎn)物,并且現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明檸檬內(nèi)酯為佛手藥材的主要有效成分之一[7],所以可將檸檬內(nèi)酯作為佛手藥材質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)之一,本實(shí)驗(yàn)從金佛手提取物中分離出該化合物,其氫譜圖參見圖1,具體的氫譜數(shù)據(jù)如下:1H-NMR(DMSO-d6,600.13 MHz)δ:8.02(1H,d,J=9.7 Hz,H-4),6.53(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.20(1H,d,J=9.7 Hz,H-3),6.62(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),3.87和3.91(各3H,s,OCH3×2),其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致,可以鑒定該化合物為5,7-二甲基香豆素(檸檬內(nèi)酯)。在1H-NMR中,共振峰面積或峰高與產(chǎn)生該共振峰的質(zhì)子數(shù)成正比,這是定量的依據(jù),可利用特征峰相對含量法對成分的含量進(jìn)行宏觀分析[9]。在檸檬內(nèi)酯氫譜中,化合物H-4(δ8.02)峰達(dá)到基線分離且兩側(cè)基線平坦(參見圖1),不受其它信號干擾,符合定量原則,因此,選定δ8.02峰為檸檬內(nèi)酯相對含量的定量峰,從圖中可直觀看出金佛手和川佛手中的檸檬內(nèi)酯相對含量要比廣佛手多,與崔紅花等[7]報(bào)道的佛手檸檬內(nèi)酯含量結(jié)果稍有出入,可能與我們采用不同的提取溶劑有關(guān)。

表1 7批佛手的來源產(chǎn)地和相似度評價(jià)結(jié)果Table 1 Geographical source and the similarity of 7 batches raw materials of Citrus medica L.var. sarcodactylis Swingle

圖2 檸檬內(nèi)酯的分子結(jié)構(gòu)式.Fig.2 Molecular structure of limettin

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 相似度評價(jià) 7批不同來源的佛手藥材按照1.2項(xiàng)下的方法制備成供試樣品溶液,采用1.3項(xiàng)下的條件測試上面樣品的1H-NMR,采用分段積分法進(jìn)行處理1H-NMR指紋圖譜,對獲得的NMR積分面積數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行相似度計(jì)算。選擇金華赤松鎮(zhèn)佛手的圖譜作為對照指紋圖譜,計(jì)算7批樣品的相關(guān)系數(shù)值,結(jié)果顯示金華赤松鎮(zhèn)佛手與金華羅店鎮(zhèn)佛手及3個(gè)川佛手的相關(guān)系數(shù)均在0.9537～0.9981間(見表1),而金華赤松鎮(zhèn)佛手與2個(gè)廣佛手的相似度較低,相似度為0.7969、0.8580,提示金佛手與川佛手的化學(xué)成分非常相似,而金佛手與廣佛手的化學(xué)成分存在一定差異。

2.3.2 聚類分析 采用分段積分法,以不同產(chǎn)地佛手藥材的1H-NMR峰面積積分值歸一化后為原始數(shù)據(jù),SPSS 19.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法,以夾角余弦為樣品相似度的距離公式,聚類分析結(jié)果見圖3。由圖可知,佛手藥材被分為2大類,一類包括廣佛手A(廣東肇慶)和B(廣西桂林);另外一類包括金佛手C(金華赤松鎮(zhèn))、D(金華羅店鎮(zhèn))和川佛手E(四川樂山)、F(四川蘆山)、G(重慶江津)。因此,通過聚類分析得到的各產(chǎn)地佛手之間的相關(guān)性與相似度分析的結(jié)果一致,它們之間相互驗(yàn)證。

圖3 聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

2.3.31H-NMR共有峰主成分分析 主成分分析法是一種應(yīng)用廣泛的多元統(tǒng)計(jì)方法,用于簡化數(shù)據(jù),快速實(shí)現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識別。SPSS19.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù),對7個(gè)不同產(chǎn)地佛手藥材的18個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析,結(jié)果見表2和表3。

表2 抽取的主成分特征值及貢獻(xiàn)率Table 2 The characteristic value and contribution of principal components

由表2可知,主成分個(gè)數(shù)的提取原則為其對應(yīng)的特征值大于1,故取前4個(gè)作為主成分,其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到95.352%,它代表了所研究譜峰的95.352%的信息量。其中,第一主成分特征值為9.503,貢獻(xiàn)率為52.793%,是佛手藥材最重要的成分群。由表3可以看出,第1主成分因子與3～5、13、16～17號特征峰高度正相關(guān),提示δ2.870～2.910、δ3.000～3.050、δ3.050～3.090、δ4.250～4.290、δ6.200～6.260、δ6.570～6.630這六個(gè)積分段峰對不同樣品的區(qū)分評價(jià)貢獻(xiàn)較大;第2主成分因子與18號特征峰高度正相關(guān),說明第2主成分反映的主要是δ8.000～8.030峰的信息,即第2主成分主要反映檸檬內(nèi)酯H-4峰的信息;第3和第4主成分因子分別與7號和6號特征峰高度正相關(guān),提示它們分別反映δ3.240～3.260和δ3.090～3.140峰的信息。上述高度正相關(guān)的特征峰在佛手藥材的質(zhì)量控制中有相對重要的作用,除了δ8.000～8.030峰已明確為檸檬內(nèi)酯H-4峰外,其它特征峰屬于何種化合物有待于進(jìn)一步的研究分析。

表3 主成分因子載荷矩陣Table 3 Loading matrix of principal component factor

綜上所述,運(yùn)用聚類分析和主成分分析,可實(shí)現(xiàn)快速分析,發(fā)揮各自優(yōu)勢,互相驗(yàn)證和補(bǔ)充,從多角度綜合評判佛手藥材的質(zhì)量。

3 討論

建立全面、系統(tǒng)、特征性的指紋圖譜,是佛手質(zhì)量評價(jià)的有效辦法。關(guān)于佛手藥材的HPLC指紋圖譜已有報(bào)道[12-13],但尚未見1H-NMR指紋圖譜研究。本實(shí)驗(yàn)建立了不同產(chǎn)地佛手藥材1H-NMR指紋圖譜。通過相似度計(jì)算、聚類分析和主成分分析,對藥材進(jìn)行綜合評價(jià),得到較理想的結(jié)果。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了1H-NMR指紋譜方法學(xué)考察,發(fā)現(xiàn)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性都符合指紋圖譜的要求,為佛手藥材的質(zhì)量控制提供了更全面的參考。

本實(shí)驗(yàn)只表征了佛手粗提取氫譜中的一個(gè)主要次級代謝產(chǎn)物檸檬內(nèi)酯,至于粗提取氫譜中的其它化合物表征及質(zhì)量控制的關(guān)鍵成分確定,還有待于進(jìn)一步的研究探討。

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Study on1H-NMR fingerprinting ofCitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle

HUANG Lan-ping,JIN Li-ping,XIE Jia-ni,ZHANG Ying-lao*

(College of Chemistry and Life Science,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China)

To provide the base for distinguishingCitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle from different regions and quality evaluation,the1H-NMR fingerprint analysis ofC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle was established. The samples collected from diverse geographical locations were determined by the1H-NMR method. The NMR data was evaluated by the methods of similarity analysis,cluster analysis and principal component analysis. The experimental results showed that the similarity value was above 0.95 betweenC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua andC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Sichuan. However,the similarity value was with under 0.86 betweenC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua andC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Guangdong. The relative component of limettin inC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua and Sichuan were greater than that ofC.medicaL. Var.sarcodactylisSwingle from Guangdong. The result of cluster analysis also showedC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Guangdong was different from theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua and Sichuan,but theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua was similar to theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Sichuan. According to the principal components analysis,four principal components was obtained,and the contribution rate of accumulative total of variance of the four factors was 95.352%.The established method was a quick,simple and useful for distinguishing different species and assessment of the quality of theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle.

1H-NMR;CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle;cluster analysis;principal component analysis

2016-12-08

黃蘭平(1996-),女,本科,主要從事天然藥物化學(xué)研究,E-mail:1239048674@qq.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21002092);浙江省自然科學(xué)基金(LY17C010002);金華市科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014-2-049)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)11-0291-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.047