郭丹丹,成樂(lè)琴,*,李 玲,甘鳳琴,于秀茹

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林吉林 132022;2.通化百奧金森生物科技有限公司,吉林通化 134000)

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響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取人參須根粉中人參皂苷Rg5的工藝研究

郭丹丹1,成樂(lè)琴1,*,李 玲2,甘鳳琴2,于秀茹1

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林吉林 132022;2.通化百奧金森生物科技有限公司,吉林通化 134000)

為直接提取制備人參須根粉中的人參皂苷Rg5,實(shí)現(xiàn)一步法直接制備人參皂苷Rg5,以解決提取時(shí)間長(zhǎng)、得率低的問(wèn)題。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取制備人參皂苷Rg5的工藝。研究了提取功率、提取液酸濃度、固液比和提取時(shí)間4個(gè)因素及其相互作用對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響。利用高效液相色譜法對(duì)人參皂苷Rg5進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響次序?yàn)樘崛∫核釢舛?提取功率>固液比>提取時(shí)間;人參皂苷Rg5的最佳提取工藝條件為:提取功率500 W,提取液酸濃度0.12 mol·L-1,固液比1∶42 (g·mL-1),提取時(shí)間9 min,人參皂苷Rg5得率可達(dá)到3.14%,表明該方法可有效提取人參須根粉中人參皂苷Rg5。

人參皂苷Rg5,微波,提取,響應(yīng)曲面法,人參須根粉

人參是五加科人參屬(PanaxginsengC.A,Mey)草本植物,在我國(guó)作為名貴的中草藥,已有上千年的藥用歷史。人參具有補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智等功效[1]。人參中含有多種有效成分,如人參皂苷、多糖、氨基酸、黃酮等,而人參皂苷被認(rèn)為是人參的主要活性成分[2],具有提高免疫力[3]、抗腫瘤[4]和保護(hù)心血管系統(tǒng)[5-6]等藥效。但是人參皂苷通常以大分子形式存在且在人參中的含量較低,直接服用人參的藥效并不顯著,因此需要通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾、提取、富集等手段來(lái)制備次級(jí)稀有人參皂苷,增大稀有皂苷濃度從而提高藥效。

圖1 人參須根粉中人參皂苷Rg5的轉(zhuǎn)化途徑Fig.1 Conversion pathway of ginsenoside Rg5 in GFRP

人參皂苷Rg5是紅參中特有的極其微量的次級(jí)稀有人參皂苷,具有改善記憶、抗癌、抗腫瘤、益智活性等功效[7-9],人參須根粉中人參皂苷Rg5的轉(zhuǎn)化途徑見(jiàn)圖1[10]。目前關(guān)于人參皂苷Rg5的制備方法主要是蒸制法,即將鮮參通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的高溫蒸制成紅參而得到,這種方法不僅時(shí)間長(zhǎng),而且提取效率低[11-13]。關(guān)大鵬等[10]通過(guò)高溫?zé)崃呀馊藚⑶o葉皂苷制備人參皂苷Rg5,其產(chǎn)率為13.17%,Soo Kyung Jo等[14]將白參于98 ℃下蒸75 h后,分離得到人參皂苷Rg5,其得率為1.756%。金銀萍等[15]通過(guò)從紅參的甲醇提取物中分離得到人參皂苷Rg5,其產(chǎn)率僅為0.012%。

微波輔助提取技術(shù)是利用不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對(duì)微波吸收能力的差異,使物質(zhì)中的部分組分被選擇性加熱,溶于提取劑中而被分離[16]。微波輔助提取技術(shù)綜合了傳統(tǒng)的溶劑提取技術(shù)和微波技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),具有反應(yīng)時(shí)間短、提取效率高、溶劑用量少、選擇性高等特點(diǎn),適用于熱穩(wěn)定性的皂苷類化合物的提取[17]。目前該方法被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的提取,然而針對(duì)于人參皂苷Rg5的提取鮮有報(bào)道。

因此,本文以人參須根粉為原料,鹽酸為催化劑,通過(guò)微波輔助提取的方式直接從人參須根粉中提取人參皂苷Rg5,以達(dá)到縮短提取時(shí)間,提高提取效率的目的;并通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)微波輔助提取人參皂苷Rg5的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到微波輔助提取人參皂苷Rg5最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參須根粉 吉林省通化彩森仁生物有限公司提供;乙腈 瑞典歐普森公司提供;甲醇 天津大茂化學(xué)試劑有限公司提供,為色譜純?cè)噭?正丁醇等試劑均為分析純?cè)噭?天津大茂化學(xué)試劑有限公司提供;對(duì)照品Rg5批號(hào) MUST-15051917 成都曼斯特公司,純度≥98%。

高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司;ODS色譜柱 月旭材料科技(上海)有限公司；P230P高壓恒流泵;UV230+紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器;AT-350 Column Heater;EC-2000 LU工作站);XH-300UL電腦微波超聲波紫外光組合催化合成儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;H2050R型高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC分析 參考文獻(xiàn)[18]的方法,條件如下:ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm,進(jìn)樣量20 μL,柱溫35 ℃,流速1 mL·min-1,流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)。梯度洗脫程序?yàn)?0～10 min,22% A;10～20 min,22%～27% A;20～25 min,27%～31% A;25～45 min,31%～38% A;45～60 min,38%～52% A;60～65 min,52% A;65～75 min,52%～55% A;75～82 min,55%～60% A;82～82.10 min,60%～90% A;82.10～100 min,90% A;100～100.10 min,90%～22% A;100.10～115 min,22% A。

1.2.2 人參皂苷Rg5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取人參皂苷Rg5標(biāo)準(zhǔn)品5.244 mg于10 mL容量瓶中,加色譜純甲醇定容到10 mL。分別移取0.05、0.5、1、2.5 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液并用色譜純甲醇定容至10 mL,配制成不同已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液,搖勻后靜置,進(jìn)行HPLC定量分析。

1.2.3 人參皂苷Rg5供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取0.5 g人參須根粉(100目)于100 mL三口燒瓶中,按照預(yù)設(shè)的提取條件進(jìn)行人參皂苷Rg5的提取。提取結(jié)束后提取液冷卻,調(diào)pH6～7,離心8000 r/min,5 min,上清液轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶,固體加入10 mL水飽和正丁醇萃取一次,合并有機(jī)相。有機(jī)相濃縮至干,加80 mL色譜純甲醇溶解,用0.45 μm濾膜過(guò)濾后,在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析。

1.2.4 人參皂苷Rg5得率的計(jì)算方法 取適量供試品溶液,在“1.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)行HPLC定量分析,并帶入人參皂苷Rg5標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人參皂苷Rg5濃度(X μg/mL)。帶入下面方程計(jì)算人參皂苷Rg5得率:

式(1)

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 采用“1.2.3”項(xiàng)方法提取人參須根粉中的人參皂苷Rg5。提取條件為:準(zhǔn)確稱取人參須根粉0.5 g,固定提取功率400 W,固液比1∶35 (g·mL-1),提取液酸濃度0.07 mol·L-1,提取時(shí)間10 min,考察乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響;準(zhǔn)確稱取人參須根粉0.5 g,固定乙醇濃度70%,固液比1∶35 (g·mL-1),提取液酸濃度0.07 mol·L-1,提取時(shí)間10 min,考察提取功率200、300、400、500、600 W;準(zhǔn)確稱取人參須根粉0.5 g,固定乙醇濃度70%,提取功率400 W,固液比1∶35 (g·mL-1),提取時(shí)間10 min的條件下,考察提取液酸濃度為0.05、0.07、0.09、0.11、0.13 mol·L-1;準(zhǔn)確稱取人參須根粉0.5 g,固定乙醇濃度70%,提取功率400 W,提取液酸濃度0.11 mol·L-1,提取時(shí)間10 min,考察固液比1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65 (g·mL-1);準(zhǔn)確稱取人參須根粉0.5 g,固定乙醇濃度70%,提取功率400 W,提取液酸濃度0.11 mol·L-1,固液比1∶35 (g·mL-1),考察提取時(shí)間7、10、13、16、19 min,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)曲面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以提取功率(A)、提取液酸濃度(B)、固液比(C)和提取時(shí)間(D)為考察因素,以人參皂苷Rg5的得率為考察目標(biāo),運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6軟件,優(yōu)化微波輔助提取人參須根粉中人參皂苷Rg5的提取工藝,響應(yīng)面因素水平表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平 Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析,制作人參皂苷Rg5的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到峰面積Y和人參皂苷Rg5濃度X之間的線性回歸方程及線性范圍為:YRg5=14.185X+40.192(7.925 ～ 264.767 μg·mL-1,r=0.9999)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度考察 人參皂苷Rg5供試品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后,在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下,重復(fù)測(cè)定6次,得人參皂苷Rg5峰面積RSD為1.03%(n=6)。

2.2.2 穩(wěn)定性考察 取同一人參皂苷Rg5對(duì)照品溶液,在48 h內(nèi),每隔6 h,在“1.2.1”色譜條件下進(jìn)樣一次,測(cè)得人參皂苷Rg5峰面積RSD為0.93%,說(shuō)明人參皂苷Rg5樣品溶液在48 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.3 重現(xiàn)性考察 按照“1.2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行5組平行實(shí)驗(yàn)制備人參皂苷Rg5樣品溶液,并在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行定量分析,得到人參皂苷Rg5平均得率為1.78%,RSD為0.91%(n=5),表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.4 加樣回收率考察 準(zhǔn)確稱取已知人參皂苷Rg5含量的樣品9份,按照“1.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行提取并定容。精確加入樣品中人參皂苷Rg5含量的80%、100%、120%的對(duì)照品,在“1.2.1”色譜條件下測(cè)定,結(jié)果人參皂苷Rg5的回收率在99.41%～102.15%,平均回收率為100.58%,RSD為0.64%(n=9)。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 乙醇濃度對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響 由圖2可知,隨著乙醇濃度的增加,人參皂苷Rg5的得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。這是由于適量的水有助于提取原料中的PPD皂苷,而適量的有機(jī)溶劑有利于PPD皂苷轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg5,根據(jù)“相似相溶”原理,當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí),人參皂苷Rg5的得率最高。因此,乙醇濃度以70%為宜?？紤]乙醇濃度對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響相對(duì)較小,因此不選做進(jìn)一步優(yōu)化條件。

圖2 乙醇濃度對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of ginsenoside-Rg5

2.3.2 提取功率對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響 由圖3可知,在選取功率范圍內(nèi),人參皂苷Rg5的得率先增加后減小,功率過(guò)大可能導(dǎo)致人參皂苷Rg5結(jié)構(gòu)的破壞,從而降低其得率。當(dāng)提取功率為400 W時(shí),人參皂苷Rg5的得率最高。因此,最佳提取功率以400 W為宜,并選擇300～500 W做響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 提取功率對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響Fig.3 Effect of extraction power on extraction yield of ginsenoside-Rg5

2.3.3 提取液酸濃度對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響 人參皂苷Rg5的制備需要經(jīng)過(guò)人參須根粉→原人參二醇組皂苷→Rg3→Rg5的轉(zhuǎn)化過(guò)程,而酸在此轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到催化作用。圖4表明,隨著酸濃度的增加,有利于原料中的PPD皂苷向人參皂苷Rg5轉(zhuǎn)化,而酸濃度過(guò)大,會(huì)導(dǎo)致人參皂苷Rg5進(jìn)一步水解。當(dāng)提取液酸濃度為0.11 mol·L-1時(shí),人參皂苷Rg5的得率最高。因此,提取液酸濃度以0.11 mol·L-1為宜,并選擇0.09～0.13 mol·L-1做響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 提取液酸濃度對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響Fig.4 Effect of acid concentration of extraction solvent on extraction yield of ginsenoside-Rg5

2.3.4 固液比對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響 由圖5可知,隨著固液比的增加,人參皂苷Rg5的得率先增加后減少,分析產(chǎn)生這種趨勢(shì)的原因是由于隨著提取劑用量的增加,提取劑中可溶解的皂苷含量一定,酸濃度一定,而提取劑中電離出的H+數(shù)增加,會(huì)導(dǎo)致生成的人參皂苷Rg5在酸性條件下進(jìn)一步發(fā)生水解,使其得率減小。當(dāng)固液比為1∶35 (g·mL-1)時(shí),人參皂苷Rg5的得率最高。因此,固液比以1∶35 (g·mL-1)為宜,并選擇1∶25～1∶45做進(jìn)一步優(yōu)化。

圖5 固液比對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of ginsenoside-Rg5

2.3.5 提取時(shí)間對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響 由圖6可知,提取開(kāi)始階段,由于體系中還不存在或只少量存在人參皂苷Rg5,使得人參皂苷Rg5生成速率大于人參皂苷Rg5的分解速率,因此提取剛開(kāi)始隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),人參皂苷Rg5的得率增加;當(dāng)提取時(shí)間大于10 min后,原料中的二醇組皂苷含量降低,因此提取時(shí)間以10 min為宜,并選擇7～13 min做進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖6 提取時(shí)間對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction yield of ginsenoside-Rg5

2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化人參須根粉中人參皂苷Rg5的提取工藝

2.4.1 人參皂苷Rg5得率回歸模型的建立和顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken design的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,回歸方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken design

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

注:**為極顯著(p<0.001);*為顯著(p<0.05)。

將表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用ANOVA軟件進(jìn)行擬合,得到關(guān)于人參皂苷得率Y與提取功率等各因素之間的二階多項(xiàng)式方程:

Y=0.288+0.26A+0.34B+0.093C+0.025D+0.17AB+0.54AC-0.42AD-0.27BC-0.45BD-0.083CD-0.39A2-0.88B2-0.39C2-0.60D2

式(2)

2.4.2 微波輔助提取人參須根粉中人參皂苷Rg5的響應(yīng)曲面分析 為進(jìn)一步研究提取功率、提取液酸濃度、固液比、提取時(shí)間及各因素之間的相互作用對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響,根據(jù)二階多項(xiàng)式方程做出響應(yīng)面,結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 各因素交互作用對(duì)人參須根粉中人參皂苷Rg5得率的影響Fig.7 The interaction of factors on the extraction yierld of ginsenoside Rg5 from ginseng fibrous root powder

由圖7可直觀看出各因素對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響程度。提取液酸濃度對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響較為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡;提取功率對(duì)人參皂苷Rg5得率有一定的影響,表現(xiàn)為曲線有一定的彎曲程度,而固液比和提取時(shí)間對(duì)人參皂苷Rg5的得率的影響較小,表現(xiàn)為曲線趨于平緩。

2.4.3 最佳提取工藝條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)人參皂苷Rg5的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,預(yù)測(cè)人參皂苷Rg5的最佳提取工藝條件為:提取功率500 W,提取液酸濃度0.12 mol·L-1,固液比1∶42.48 (g·mL-1),提取時(shí)間8.51 min,人參皂苷Rg5的最佳得率為3.16%。

為驗(yàn)證響應(yīng)曲面法預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性,擬用實(shí)驗(yàn)中所得的最佳提取工藝重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？紤]到實(shí)際操作的便利,將最佳提取工藝條件進(jìn)行修正,即提取功率500 W,提取液酸濃度0.12 mol·L-1,固液比1∶42 (g·mL-1),提取時(shí)間9 min。按照修正后的提取條件重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),得到人參皂苷Rg5的得率分別為3.12%、3.08%、3.19%,平均得率為3.14%(見(jiàn)圖8),RSD值為1.53%,與理論值較為接近。本實(shí)驗(yàn)值是Soo Kyung Jo等[14]將白參于98 ℃下蒸75 h后,分離得到人參皂苷Rg5得率的1.80倍。因此,響應(yīng)曲面法預(yù)測(cè)的最佳提取工藝準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

圖8 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品及最佳條件下樣品的HPLC譜圖Fig.8 The HPLC chromatomap of ginsenoside standards and sample under the optimization condition注:A.人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品;B.樣品。

3 結(jié)論

本文通過(guò)采用微波輔助法直接從人參須根粉中提取制備人參皂苷Rg5,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用RSM法優(yōu)化了人參皂苷Rg5的提取工藝,建立回歸模型方程,并通過(guò)響應(yīng)曲面分析各因素及相互作用對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響。各因素對(duì)人參皂苷Rg5得率的影響次序?yàn)樘崛∫核釢舛?提取功率>固液比>提取時(shí)間;確定微波輔助提取人參須根粉中人參皂苷Rg5的最佳提取工藝條件,即提取功率500 W,提取液酸濃度0.12 mon·L-1,固液比1∶42 (g·mL-1),提取時(shí)間9 min,在最佳提取工藝條件下,人參皂苷Rg5的得率為3.14%。與傳統(tǒng)提取方法相比,該方法大大提高了人參皂苷Rg5的提取效率,節(jié)省提取時(shí)間,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法中所存在的高溫、時(shí)間長(zhǎng)且得率低的缺點(diǎn),為人參皂苷Rg5的制備提供了一種新的方法,同時(shí)為人參皂苷Rg5的藥理活性研究提供了理論基礎(chǔ)。

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Optimization of microwave assisted extraction of ginsenoside Rg5 from ginseng fibrous root powder by response surface methodology

GUO Dan-dan1,CHENG Le-qin1,*,LI Ling2,GAN Feng-qin2,YU Xiu-ru1

(1.Department of Pharmacy and Applied Chemistry,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,China;2.Tonghua Bai’aojinsen Biotechnology Co.,Ltd,Tonghua 134000,China)

To direct extraction of ginsenoside Rg5 from ginseng fibrous root powder(GFRP),solve the problem of long extraction time,low extraction rate,the microwave assisted extraction technology of ginsenoside Rg5 was carried out and optimized by response surface method based on single factor experiment,the extraction power,acid concentration of extraction solvent,solid-liquid ratio,extraction time and their interactions effected on the extraction yield of ginsenoside Rg5 were investigated. The results showed that the order of influence on the extraction yield of ginsenoside Rg5 was as follows:acid concentration of extraction solvent>extraction power>solid-liquid ratio>extraction time. The optimal condition obtained from RSM was as follows:extraction power of 500 W,acid concentration of extraction solvent of 0.12 mol·L-1,solid-liquid ratio of 1∶42(g·mL-1),extraction time of 9 min,the extraction yild of ginsenoside Rg5 can reach 3.14% under the optimal condition,which indicated the method could extrat Rg5 from GFRP effectively.

Ginsenoside-Rg5;microwave;extraction;response surface method;ginseng fibrous root powder

2016-12-02

郭丹丹(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)修飾和藥物合成，E-mail：1878216422@qq.com。

*通訊作者:成樂(lè)琴(1969-)，女，博士，教授，研究方向：天然有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)修飾和藥物合成，E-mail：chengleqin@hotmail.com。

吉林省科技廳科技廳公關(guān)項(xiàng)目(20140306003YY);吉林化工學(xué)院項(xiàng)目(吉化院合字[2015]第036號(hào))。

TS255.1

B

1002-0306(2017)11-0229-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.035