李多杰，吳禮高，朱超莽，汪朝歌，李艷，李夢(mèng)茹

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1放療科，2病理科，蚌埠 233003)

Cdc25C在放療敏感的食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)

李多杰1，吳禮高2*，朱超莽1，汪朝歌1，李艷1，李夢(mèng)茹1

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1放療科，2病理科，蚌埠 233003)

目的研究食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Cdc25C的表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系。方法回顧性分析62例根治性放療的局部晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者，根據(jù)放療近期療效分為放療敏感組和放療不敏感組，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)放療前食管癌組織中Cdc25C表達(dá)，分析Cdc25C的表達(dá)與放療敏感性之間的關(guān)系。結(jié)果食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Cdc25C表達(dá)率顯著高于癌旁正常上皮組織，放療敏感組Cdc25C表達(dá)率顯著高于放療不敏感組。結(jié)論食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Cdc25C高表達(dá)與放療敏感性密切相關(guān)，Cdc25C的高表達(dá)可能有助于預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性，對(duì)于指導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌臨床治療具有重要的參考意義。

食管；鱗狀細(xì)胞癌；Cdc25C表達(dá)；放射敏感性

根治性放化療或新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)治療是局部晚期食管鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱鱗癌）患者主要的治療手段，放療敏感性是決定放化療療效的主要因素。輻射條件下腫瘤細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期阻滯而逃避射線“打擊”是造成輻射耐受的主要原因，選擇性地解除G2/M期阻滯是食管癌放療增敏的新途徑[1]。細(xì)胞分裂周期25 (cell division cycle 25, Cdc25) 磷酸酶通過(guò)去磷酸化和激活細(xì)胞周期依賴酶促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行，其家族包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C 3種亞型，Cdc25A 在G1 向S 轉(zhuǎn)換激活CDK2，在G2 向M 期轉(zhuǎn)換激活CDK1，在胚胎發(fā)生和腫瘤發(fā)生中起到重要作用；Cdc25B磷酸酶在G2/M期轉(zhuǎn)換過(guò)程中可使Cdc2 激酶去磷酸化, 起激活M 期促進(jìn)因子的作用， 是早期有絲分裂的啟動(dòng)因子；Cdc25C在真核細(xì)胞有絲分裂中起重要調(diào)節(jié)作用，是輻射條件下調(diào)控G2/M期轉(zhuǎn)換的核心因子[2]。本研究擬采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)62例食管鱗癌中Cdc25C蛋白的表達(dá)水平，并分析其與放療敏感性的關(guān)系，探討Cdc25C表達(dá)在預(yù)測(cè)食管鱗癌放療敏感性中的價(jià)值，為食管鱗癌治療方案的選擇和放療預(yù)后判斷提供新的指標(biāo)。

材料和方法

1 患者資料

回顧性分析2014年6月至2015年6月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放療科行根治性放療的食管鱗癌患者62例，男41例，女21例，年齡45～78歲，中位年齡52歲；組織學(xué)分級(jí)為I+II級(jí)36例，III級(jí)26例；按照放療前食管鋇餐診斷，病變長(zhǎng)度＜5 cm 33例，≥5 cm 29例；根據(jù)增強(qiáng)胸部CT或頸部彩超結(jié)果，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。所有病例均為醫(yī)學(xué)原因不能手術(shù)或患者拒絕手術(shù)，簽署放化療知情同意書(shū)后，采用5野簡(jiǎn)化調(diào)強(qiáng)同步加量放療，PGTV 60-64 Gy/30-32F，PTV 50-54 Gy/30-32F，每周5次，54.84%（34例）患者完成同步化療。所有患者在接受根治性放療前均未接受化療及免疫治療，且具有完整的臨床、病理及隨訪資料。隨訪時(shí)間截至2016年12月31日，隨訪時(shí)間為19-31個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為16.5個(gè)月，失訪6人，隨訪率為90.3%。收集這62例臨床病理科存檔石蠟包埋食管鱗癌組織和20例距離癌組織2cm以上切緣正常鱗狀上皮組織，該研究在實(shí)施過(guò)程中得到患者及蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院人體試驗(yàn)倫理道德委員會(huì)同意。

2 ElivisionTMplus法免疫組織化學(xué)染色

Cdc25C抗體（兔單克隆抗體E302）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；ElivisionTMplus試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。組織用4%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)制成4 μm 厚的切片，并在65℃ 烤片30min，依次脫蠟、水洗、與第一抗體(Cdc25單克隆抗體)及第二抗體（ElivisionTMplus試劑）孵育， DAB顯色、用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、封片。Cdc25C 抗體按1 ∶ 400 稀釋，所有切片用第一抗體封閉后在4℃過(guò)夜，第二抗體37℃孵育時(shí)間為30min。用已知陽(yáng)性片作對(duì)照，用PBS 緩沖液代替第一抗體做陰性對(duì)照。

3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

Cdc25C陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核中，呈棕黃色，背景不著色。表達(dá)結(jié)果按照著色強(qiáng)度和著色范圍綜合計(jì)分。著色強(qiáng)度：無(wú)色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。著色范圍（計(jì)數(shù)高倍鏡下陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比）：＜10%，1分；11%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。將著色強(qiáng)度得分和范圍得分的乘積作為判斷結(jié)果，若積分=0為陰性表達(dá)，≥1為陽(yáng)性表達(dá)，若積分≥1且≤2為低表達(dá)，≥3為高表達(dá)。每例標(biāo)本均隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（40倍物鏡），取其中位值。結(jié)果最后由兩位病理醫(yī)師采用獨(dú)立雙盲法閱片判定。

4 近期療效評(píng)價(jià)

放療結(jié)束后4周行食管鋇餐造影和胸部CT檢查進(jìn)行近期療效評(píng)定，療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照萬(wàn)均等[3]食管癌放療后近期療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將放療結(jié)束時(shí)食管鋇餐造影和胸部CT檢查結(jié)果分為完全緩解（complete response, CR）即腫瘤完全消失，食管片邊緣光滑，鋇劑通過(guò)順利，但管壁可稍顯強(qiáng)直，管腔無(wú)狹窄或稍顯狹窄，粘膜基本恢復(fù)正常或增粗；部分緩解（partial response, PR）即病變大部分消失，無(wú)明顯的扭曲或成角，無(wú)向腔外潰瘍，鋇劑通過(guò)尚順利，但邊緣欠光滑，有小的充盈缺損及/或小龕影，或邊緣雖光滑，但管腔有明顯狹窄；無(wú)緩解（no response, NR）即放療結(jié)束時(shí)，病變有殘留或看不出病變有明星好轉(zhuǎn)，但仍有明顯的充盈缺損及龕影或狹窄加重。本研究CR+PR患者定義為放療敏感，NR患者定義為放療不敏感。所有病例在放射治療結(jié)束后一年內(nèi)每2個(gè)月隨訪1次，一年以上每3個(gè)月隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括食管鋇餐檢查、胸部CT、腹部彩超等，必要時(shí)增加ECT骨掃描、PET-CT等檢查。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，食管癌組織和癌旁正常組織中Cdc25C蛋白表達(dá)的差異采用χ2檢驗(yàn)，Cdc25C蛋白表達(dá)與各臨床病理參數(shù)及放療敏感性之間的關(guān)系進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Cdc25C在食管鱗癌的高表達(dá)率高于癌旁正常上皮組織

Cdc25C陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核中，在癌旁組織中，僅部分細(xì)胞出現(xiàn)弱陽(yáng)性反應(yīng)，著色淺；而在食管鱗癌中，大量細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，著色深（圖1）。在食管鱗癌中，Cdc25C的總陽(yáng)性表達(dá)率為87.10% (54/62)；食管鱗癌中Cdc25C免疫反應(yīng)高表達(dá)率為77.42% (48/62)，明顯高于癌旁正常組織中的高表達(dá)率25.00% (5/20)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.965，P=0.042）。

2 放療敏感食管鱗癌組織中Cdc25C免疫反應(yīng)性更強(qiáng)

62例患者全部采用5野簡(jiǎn)化調(diào)強(qiáng)同步加量常規(guī)分割放療，放療后4周根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。放療敏感組41例患者中，Cdc25C高表達(dá)率90.24%（37/41）；放療不敏感組21例患者中，Cdc25C高表達(dá)率為52.39%（11/21），兩組之間Cdc25C高表達(dá)率比較差異具有顯著性意義（表1）。

表1 Cdc25C表達(dá)水平與食管癌放療敏感性的關(guān)系Tab. 1 The relationship between Cdc25C level and ESCC radiosensitivity

圖1 食管癌鱗癌組織Cdc25C表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，癌旁正常鱗狀上皮組織Cdc25C免疫反應(yīng)陰性；B，食管鱗狀細(xì)胞癌組織弱Cdc25C免疫反應(yīng)性；C，食管鱗狀細(xì)胞癌組織強(qiáng)Cdc25C免疫反應(yīng)性；比例尺：Al、Bl和Cl，100μm；A2、B2和C2，100μmFig. l Immunohistochemical detection of Cdc25C expression in ESCC. A, negative Cdc25C immunoreactivity in normal squamous epithelial tissue; B, weak Cdc25C immunoreactivity in ESCC；C, strong Cdc25C immunoreactivity in ESCC; scale bar, 100μm in Al, B1 and C1; 100μm in A2, B2 and C2

討 論

我國(guó)食管癌患者約占全世界的70%，其中約95%的食管癌病理類型為鱗狀細(xì)胞癌。由于食管癌早期癥狀不典型，確診時(shí)約60%～70%的患者屬于中晚期，失去最佳手術(shù)治療機(jī)會(huì)。根治性放化療或新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)治療是這類患者主要的治療手段。放療敏感性是決定放化療療效的主要因素，文獻(xiàn)報(bào)道局部晚期食管癌放射治療3年生存率為15%～23%[4-5]，也有許多放療敏感的局部晚期食管癌患者接受根治性放療后得以長(zhǎng)期生存[6]。新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)治療的經(jīng)驗(yàn)也表明，對(duì)放療敏感的食管癌患者接受新輔助放化療后達(dá)到病理學(xué)完全緩解是預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)后因子[7]。因此提高食管癌的放療敏感性，進(jìn)而提高其局部控制率及臨床治愈率，是食管癌放療研究的熱點(diǎn)。

提高食管癌的放療敏感性一直是食管癌放射生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，但是既往研究在腫瘤放療增敏的同時(shí)，正常組織也同樣增敏而受到損傷，大多數(shù)研究結(jié)果因毒副作用較大不能用于臨床。如果能夠從分子機(jī)制上利用腫瘤組織和正常組織對(duì)輻射反應(yīng)的差別，去選擇使腫瘤得到增敏而正常組織不致因受輻射而過(guò)度損傷，將是食管癌放療增敏的有效研究方向。Cdc25是細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的重要因子，通過(guò)去磷酸化和激活細(xì)胞周期依賴酶促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行，其家族包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C三種亞型，Cdc25A 在G1 向S 轉(zhuǎn)換激活CDK2，在G2 向M 期轉(zhuǎn)換激活CDK1，Cdc25A 在胚胎發(fā)生和腫瘤發(fā)生中起到重要作用，Cdc25B磷酸酶在G2/M期轉(zhuǎn)換過(guò)程中可使Cdc2 激酶去磷酸化, 肩負(fù)激活M 期促進(jìn)因子的重大責(zé)任, 是早期有絲分裂的啟動(dòng)因子。Cdc25C在真核細(xì)胞有絲分裂中起重要調(diào)節(jié)作用，在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，Cdc25C通過(guò)去磷酸化活化細(xì)胞周期蛋白B/ CDC2復(fù)合體，使細(xì)胞順利通過(guò)G2期“關(guān)卡”，進(jìn)入M期[2]。P53突變的食管癌細(xì)胞受到放射線損傷以后主要通過(guò)G2/M期阻滯進(jìn)行修復(fù)損傷，Cdc25C的數(shù)量或活性是癌細(xì)胞通過(guò)G2/M期的關(guān)鍵因子，因此，干預(yù)Cdc25C可能會(huì)改變食管癌放療敏感性。在不同輻射劑量引起人肝癌細(xì)胞株HepG2低劑量超敏和輻射抵抗的研究中[8]，當(dāng)輻射劑量為0.05Gy的低劑量輻照并不影響Cdc25C活性，細(xì)胞放射生物學(xué)行為表現(xiàn)為低劑量超敏，而輻射劑量增大為0.5Gy或2Gy輻射水平，磷酸化Cdc25C(S216)則表達(dá)顯著上調(diào)，且磷酸化Cdc25C(S216)在放療16小時(shí)后達(dá)到最高水平，這與G2/M阻滯程度完全一致，這是腫瘤細(xì)胞在輻射條件下發(fā)生輻射抗性的主要原因。提高Cdc25C活性，選擇性解除G2/M阻滯可能是提高放療敏感性的重要途徑[1]。

本實(shí)驗(yàn)表明，Cdc25C的表達(dá)高低，對(duì)食管鱗癌放療敏感性有明顯的影響，放療敏感組Cdc25C高表達(dá)率明顯高于放療不敏感組，推測(cè)可能是過(guò)表達(dá)的Cdc25C對(duì)抗了輻射誘導(dǎo)的G2/M期阻滯，使腫瘤細(xì)胞沒(méi)有損傷修復(fù)機(jī)會(huì)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Li等[9]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)接受術(shù)前放療的局部晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織中CHK2、Cdc25C與CyclinD1表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤組織過(guò)表達(dá)Cdc25C可以提高接受術(shù)前放療的局部晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者的總生存率，并且過(guò)表達(dá)Cdc25C與放療后腫瘤病理緩解率顯著相關(guān)，該研究結(jié)果提示：過(guò)表達(dá)Cdc25C的食管鱗癌對(duì)放療更敏感，腫瘤組織Cdc25C表達(dá)水平可作為食管鱗癌放療敏感性及預(yù)后的一個(gè)預(yù)測(cè)因子。Cdc25C的功能也與其他腫瘤的放療敏感性密切相關(guān)，田允鴻等[10]的研究表明MCF-7細(xì)胞系中乳腺癌干細(xì)胞放療前后G2期細(xì)胞含量分別為22.03%+2.12%和45.83%+2.25% (P＜0.01)，G2期相關(guān)蛋白pCdc25C(ser2l6)放療后表達(dá)明顯增高，故認(rèn)為放療后出現(xiàn)的G2/M期阻滯是與其放療抵抗特性緊密相關(guān)的。Gogineni等[11]研究表明，不可逆的G2/M期阻滯導(dǎo)致了腦膜瘤細(xì)胞的放射抵抗，原因在于CHK2的激活導(dǎo)致的Cdc25C及Cdc2磷酸化和細(xì)胞周期蛋白B1/Cdc2復(fù)合物功能抑制，改變這一通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可以改變腫瘤細(xì)胞的放療敏感性。

影響食管鱗癌放療敏感性的因素眾多，機(jī)制復(fù)雜。Cdc25C可能在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及組織分化過(guò)程中起重要作用， Cdc25C高表達(dá)的食管鱗癌可能對(duì)放療更敏感，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)，Cdc25C有望成為食管鱗癌放療敏感性預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)。

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High expression of Cdc25C in radiosensitive esophageal squamous cell carcinoma

Li Duojie1, Wu Ligao2*, Zhu Chaomang1, Wang Chaoge1, Li Yan1, Li Mengru1
(1Department of Radiotherapy,2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003，China)

ObjectiveTo study the expression of Cdc25C protein in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its relationship with the radiosensitivity of ESCC.Methods62 cases of locally advanced ESCC having

radical radiotherapy were retrospectively analyzed and divided into a radiosensitive group and a radio-insensitive group according to the short-term efect of radiotherapy. The expression of Cdc25C in the cancer tissue before radiotherapy was detected by immunohistochemistry, and its relationship with radiosensitivity analyzed.ResultsThe rate of Cdc25C high expression was signifcantly higher in the cancer tissue than in adjacent normal epithelial tissue, and in the radiosensitive group than in the radio-insensitive group.ConclusionCdc25C high expression in ESCC is closely related to and may help predict the radiosensitivity of ESCC, which provides important reference for ESCC treatment.

Esophagus; squamous cell carcinoma; Cdc25C expression; radiosensitivity

R730.5

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.009

2016-12-12

2017-03-27

安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目

（KJ2017A218）；安徽省衛(wèi)生廳“十二五”臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)基金資助（01Z33）

李多杰，男（1973年）漢族，副教授

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：wlgahbb@126.com