何雪，宋育林，王莉，洪汝濤，胡聞

（1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化科，安徽省消化系統(tǒng)疾病重點實驗室，合肥 230022；2安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院消化科，巢湖238000；3安徽醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院兒科，合肥 230000；4安徽省立醫(yī)院病理科,合肥 230001）

激活PPARγ抑制異煙肼與利福平合用致大鼠肝損傷及HMGB1水平上調(diào)

何雪1,2，宋育林1*，王莉3，洪汝濤1，胡聞4

（1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化科，安徽省消化系統(tǒng)疾病重點實驗室，合肥 230022；2安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院消化科，巢湖238000；3安徽醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院兒科，合肥 230000；4安徽省立醫(yī)院病理科,合肥 230001）

目的探討激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）對異煙肼與利福平合用致肝損傷的作用。方法以異煙肼和利福平合用制作大鼠肝損傷模型，以15d-PGJ2激活PPARγ。造模第14d和第28d分批處死大鼠，測定血清總膽紅素（total bilirubin, TBIL) 、直接膽紅素（direct bilirubin, DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT ),、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST )水平，觀察大鼠肝病理學和超微結(jié)構(gòu)變化，檢測大鼠肝組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA)含量，免疫組織化學測定肝高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）表達。結(jié)果異煙肼和利福平合用所致肝損傷模型小鼠血清TBIL、DBIL明顯升高，肝組織SOD活性顯著降低，MDA含量升高，肝脂肪變性和炎癥細胞浸潤較明顯，肝細胞線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞，HMGB1免疫反應性增強；PPARγ激動劑15d-PGJ2 處理可明顯抑制上述變化。結(jié)論PPARγ激動劑15d-PGJ2可能通過抗氧化及抑制HMGB1表達對異煙肼、利福平合用致肝損傷發(fā)揮保護作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ；高遷移率族蛋白B1；肝損傷；異煙肼；利福平

高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）作為一種典型損傷相關(guān)分子模式在急慢性無菌性炎癥中發(fā)揮重要作用[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制NF-κB活性而下調(diào)HMGB1表達可有效減輕異煙肼、利福平合用所致肝損傷[2]，而過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）激活后可通過多種機制抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用[3-4]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激活后可通過下調(diào)HMGB1減輕急性肺損傷、膿毒癥等炎癥性疾病[5-6]。然而，PPARγ激活能否防治抗結(jié)核藥物致肝損傷以及PPARγ/HMBG1途徑是否參其中目前尚不清楚。本研究檢測了異煙肼、利福平合用致肝損傷時PPARγ與HMGB1的關(guān)系及PPARγ激活對肝損傷的作用。

材料和方法

1 動物

雄性SPF級SD大鼠48只，體重150 ～180g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供[動物使用許可證號SCXK（皖）2011—002]。清潔級條件下飼養(yǎng)，室溫20℃，相對濕度50%，自由進食進水。

2 主要試劑

PPARγ激動劑15d-PGJ2購自美國sigma公司；異煙肼片購自上海信誼藥廠有限公司；利福平膠囊購自上海延安藥業(yè)有限公司；HMGB1多克隆抗體購自北京博奧森生物科技有限公司產(chǎn)品；PV法試劑盒與DAB 試劑盒購于北京中杉科技有限公司。

3 實驗分組

SD大鼠適應性喂養(yǎng)7d后，隨機分為正常組（Normal）、肝損傷模型組（Model）和15d-PGJ2處理組（Treatment），每組8只大鼠。正常組給予等量生理鹽水空腹灌胃；模型組和處理組大鼠分別給予異煙肼50mg/(kg·d)+利福平50 mg/(kg·d)每天一次定時空腹灌胃；處理組同時每日一次腹腔注射15d-PGJ2 10 ug/(kg·d)。造模第14d和第18d分批處死大鼠。處死前，禁食、禁水12h；麻醉后腹主動脈采血，留取血清；留取肝左葉相同部位以福爾馬林緩沖液固定；其余組織保存于液氮罐中待測。

4 大鼠血清生化指標測定

全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清總膽紅素（total bilirubin, TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin, DBIL）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）。

5 HE染色觀察肝組織病理學變化

常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察肝病理學變化。

6 肝超微結(jié)構(gòu)觀察

造模第28d，取各組大鼠肝左葉相同部位肝組織，切成大小約0.1cm3組織塊，2.5%戊二醛固定6h后，常規(guī)電鏡技術(shù)包埋、超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡(JEM-2100F)觀察、拍照。

7 大鼠肝組織超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量測定

制備1%肝勻漿，采用考馬斯亮蘭法測定肝組織中蛋白濃度；分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比測定肝組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

8 肝組織HMGB1表達的免疫組織化學法檢測

肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，PV二步法免疫組織化學染色。 HMGB1多克隆抗體工作濃度1∶400；陰性對照為PBS代替一抗。染色完成后光鏡下攝片，應用Image-Pro Plus 6.0測定其平均光密度值（OD）代表HMGB1免疫組織化學表達水平。

9 統(tǒng)計學分析

用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（s）表示。多組間計量資料比較采用單因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用LSD和SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 激活PPARγ改善異煙肼與利福平合用所致大鼠肝損傷生化指標

生化分析顯示，與正常大鼠比較，以異煙肼與利福平合用致肝損傷的模型組大鼠血清TBIL和DBIL水平明顯升高，而血清ALT和AST水平無明顯變化。以PPARγ激動劑15d-PGJ2處理的肝損傷大鼠，其血清TBIL、DBIL水平與未用15d-PGJ2處理的模型組大鼠相比明顯降低（表1）。

表1 15d-PGJ2對異煙肼與利福平合用致肝損傷大鼠肝生化指標的影響Tab. 1 The effect of 15d-PGJ2 on hepatic biochemical parameters of the rats treated with both isoniazid and rifampicin

2 激活PPARγ改善異煙肼與利福平合用所致大鼠肝損傷的病理學變化

HE染色光鏡觀察顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細胞形態(tài)正常（圖1A）；14d模型組大鼠肝細胞可見不同程度的空泡變性和脂肪變性，以后者為著，部分小葉內(nèi)可見點狀壞死和炎細胞浸潤（圖1B）；28d模型組小葉內(nèi)可見明顯肝細胞點灶性壞死、炎細胞浸潤和界面炎改變（圖1C）；而14d、28d 15d-PGJ2處理組大鼠肝細胞脂肪變性、炎癥浸潤及壞死均較模型組顯著改善（圖1D，圖1E）。

透射電鏡下見28d 正常組大鼠肝細胞核膜間隙均勻，線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本正常，胞漿內(nèi)可見豐富的糖原顆粒，少量溶酶體和脂滴（圖2A）；28d 模型組大鼠肝細胞線粒體腫脹、嵴破壞，結(jié)構(gòu)模糊；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，擴張明顯；胞漿內(nèi)脂滴增多增大，糖原顆粒減少（圖2B）；28d 15d-PGJ2處理組大鼠肝細胞線粒體少量空泡變性，嵴輕度破壞，結(jié)構(gòu)基本清晰；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，無斷裂；胞漿內(nèi)有少量脂滴，較模型組顯著改善（圖2C）。

圖1 15d-PGJ2對異煙肼與利福平合用大鼠肝病理學的影響（HE染色）。A，正常組；B，14d模型組；C，28d模型組；D，14d 15d-PGJ2處理組；E，28d 15d-PGJ2處理組；比例尺，100μmFig. 1 The efect of 15d-PGJ2 on liver pathology of the rats treated with both isoniazid and rifampicin. A, Normal group; B, 14d Model group; C, 28d Model group; D, 14d Treatment group; E, 28d Treatment group; scale bar, 100μm

圖2 15d-PGJ2對異煙肼與利福平合用大鼠肝超微病理學的影響。A，正常組；B，28d模型組；C，28d 15d-PGJ2處理組；比例尺，200nmFig. 2 The efect of 15d-PGJ2 on liver ultrastractural pathology of the rats treated with both isoniazid and rifampicin. A, Normal group; B, 28d Model group; C, 28d Treatment group; scale bar, 200nm

3 激活PPARγ使異煙肼與利福平合用大鼠肝組織SOD活性升高和MDA含量降低

與正常組比較，14d和28d模型組肝組織內(nèi)SOD活性降低，MDA含量升高。與模型組相比，14d和28d 15d-PGJ2處理組肝組織SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低（表2）。

4 激活PPARγ降低異煙肼與利福平合用大鼠肝組織HMGB1免疫反應性

免疫組織化學檢測顯示，正常組肝細胞僅少數(shù)肝細胞質(zhì)漿和細胞核內(nèi)呈弱HMGB1免疫反應性（圖3A）。與正常組比較，模型組肝細胞HMGB1免疫反應性顯著增強：14d模型組以胞質(zhì)表達為主，28d模型組以胞核表達為主，同時可見腫脹、核固縮的肝細胞胞漿及炎癥浸潤區(qū)表達增強，Kupfer細胞和淋巴細胞也可見表達（圖3B，圖3C）。在15d-PGJ2處理組，肝細胞HMGB1免疫反應性較模型組顯著降低（圖3D，圖3E）。

表2 15d-PGJ2對異煙肼與利福平合用大鼠肝勻漿SOD活性和MDA含量的影響Tab. 2 The effect of 15d-PGJ2 on SOD activity and the MDA content in the liver tissue homogenate of the rats treated with both isoniazid and rifampicin

圖3 15d-PGJ2對異煙肼與利福平合用大鼠肝組織內(nèi)HMGB1免疫反應性的影響。A，正常組；B，14d模型組；C，28d模型組；D，14d 15d-PGJ2處理組；E，28d 15d-PGJ2處理組；比例尺，100μm；F，肝組織內(nèi)HMGB1免疫反應性統(tǒng)計學分析；##，與正常組比較，P＜0.01；**，與模型組比較，P＜0.01Fig. 3 The efect of 15d-PGJ2 on hepatic HMGB1 immunoreactivity of the rats treated with both isoniazid and rifampicin. A, Normal group; B, 14d Model group; C, 28d Model group; D, 14d Treatment group; E, 28d Treatment group; scale bar, 100μm; F, statistical analysis of hepatic HMGB1 immunoreactivity;##, P＜0.01, compared with Normal group; **, P＜0.01, compared with Model group

討 論

與我們前期實驗結(jié)果相似[2]，本實驗結(jié)果顯示異煙肼、利福平合用可致大鼠藥物性肝損傷，生化上表現(xiàn)為膽汁淤積，病理學上表現(xiàn)為肝細胞脂肪變性、炎細胞浸潤及點灶狀壞死等，超微結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、胞漿內(nèi)脂滴增多等。PPARγ屬于核激素受體PPARs家族中一員，在糖脂代謝、腫瘤及炎癥信號通路等起著重要調(diào)節(jié)作用，其通過減少中性粒細胞浸潤、增強單核巨噬吞噬作用、抑制NF-κB信號通路等機制在多種炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎保護作用[4-5]。15d-PGJ2為PPARγ強有力激活劑，給予15d-PGJ2干預后，大鼠肝病理學變化及超微結(jié)構(gòu)明顯改善，表明激活PPARγ可減輕異煙肼、利福平合用所致的大鼠肝損傷。

Chowdhury等研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼和利福平合用可引起CYP2E1高表達從而導致氧化應激和線粒體損傷[7]。本實驗顯示模型組肝組織內(nèi)SOD活性降低，MDA含量升高，電鏡下表現(xiàn)為線粒體結(jié)構(gòu)破壞及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，與前述文獻一致[7]。Zhang等[8]研究顯示，PPARγ激活后可增加非酒精性脂肪肝中SOD、GSH含量，同時降低MDA水平。PPARγ活化后亦可減少大鼠腦動脈和人類臍靜脈內(nèi)皮細胞ROS的產(chǎn)生[9]。本實驗中15d-PGJ2處理組大鼠肝組織勻漿MDA含量降低、SOD含量升高,提示PPARγ激活后可能通過抗氧化應激改善異煙肼、利福平合用所致的大鼠肝損傷。

HMGB1作為強有力的促炎因子，參與多種肝病的發(fā)生和發(fā)展[10]。我們前期研究已證實HMGB1表達增加和分布異常與異煙肼、利福平合用所致大鼠肝損傷發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2]。文獻報道，PPARγ激動劑羅格列酮可抑制 RAW 264.7 細胞株中LPS誘導的HMGB1釋放[11]。PPARγ激動劑曲格列酮可抑制內(nèi)皮細胞中HMGB1表達[12]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過激活PPARγ可下調(diào)異煙肼、利福平合用所致的肝HMGB1表達；同時可減輕肝損傷，提示PPARγ/HMBG1途徑可能為PPARγ激活改善異煙肼、利福平合用所致大鼠肝損傷的重要機制之一，HMGB1表達和分布至少部分受到PPARγ調(diào)控。許多文獻資料指出，HMGB1的轉(zhuǎn)位是ROS依賴的過程，氧化應激可促進HMGB1的轉(zhuǎn)位和釋放，釋放后的HMGB1可進一步介導炎癥瀑布反應[1,10,13-14]。因此我們推測抗氧化作用可能為PPARγ調(diào)控HMBG1表達和分布的一個重要途徑之一。

[1] Tsung A, Tohme S, Billiar TR. High-mobility group box-1 in sterile infammation. J Intern Med, 2014, 276(5)∶ 425-443.

[2] 何雪, 宋育林, 王莉，等. 吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽對抗結(jié)核藥所致肝損傷時高遷移率族蛋白 B1 表達的影響. 中國臨床藥理學雜志，2015，31（7）：519-522.

[3] Luconi M, Cantini G, Serio M. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ)∶ is the genomic activity the only answer? Steroids, 2010, 75(8)∶ 585-594.

[4] Croasdell A, Dufney PF, Kim N, et al. PPARγ and the Innate Immune System Mediate the Resolution of Infammation. PPAR Res, 2015, 2015∶549691.

[5] Wang G, Liu L, Zhang Y, et al. Activation of PPARγ attenuates LPS-induced acute lung injury by inhibition of HMGB1-RAGE levels. Eur J Pharmacol, 2014, 726∶ 27-32.

[6] Yuan Z, Luo G, Li X, et al. PPARγ inhibits HMGB1 expression through upregulation of miR-142-3p in vitro and in vivo. Cell Signal, 2016, 28(3)∶ 158-164.

[7] Chowdhury A, Santra A, Bhattacharjee K, et al. Mitochondrial oxidative stress and permeability transition in isoniazid and rifampicin induced liver injury in mice. J Hepatol, 2006, 45(1)∶ 117-126.

[8] Zhang Y, Cui Y, Wang XL, et al. PPARα/γ agonists and antagonists differently affect hepatic lipid metabolism, oxidative stress and inflammatory cytokine production in steatohepatitic rats. Cytokine, 2015, 75(1)∶ 127-135.

[9] Wang P, Li B, Cai G, et al. Activation of PPAR-γ by pioglitazone attenuates oxidative stress in aging rat cerebral arteries through upregulating UCP2. J Cardiovasc Pharmacol, 2014, 64(6)∶ 497–506.

[10] Chen R, Hou W, Zhang Q, et al. Emerging role of High-mobility group box 1 (HMGB1) in liver diseases. Mol Med, 2013, 19(1)∶ 357-366.

[11] Hwang JS, Kang ES, Ham SA, et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor by rosiglitazone inhibits lipopolysaccharide- induced release of high mobility group box 1. Mediators Infamm, 2012, 2012∶ 352807.

[12] Gao M, Hu Z, Zheng Y, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor γ agonist troglitazone inhibits high mobility group box 1 expression in endothelial cells via suppressing transcriptional activity of nuclear factor κB and activator protein 1. Shock, 2011, 36(3)∶ 228-234.

[13] Yu Y, Tang D, Kang R. Oxidative stress-mediated HMGB1 biology. Front Physiol, 2015, 6∶ 93.

[14] A Nogueira-Machado J, M de Oliveira Volpe C. HMGB-1 as a target for infammation controlling. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov, 2012, 6(3)∶ 201-209.

Activation of PPARγ inhibits rat liver injury and HMGBl overexpression induced by isoniazid and rifampicin

He Xue1,2, Song Yulin1*, Wang Li3, Hong Rutao1, Hu Wen4
(1Anhui Key Laboratory of Digestive Diseases, Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China;2Department of Gastroenterology, Chaohu Hospital of Anhui Medical University, Chaohu 238000, China;3Department of Pediatrics, The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230000, China,4Department of Pathology, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001, China)

ObjectiveTo Study the efect of activation of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) on rat liver injury induced by isoniazid and rifampicin.MethodsThe model of rat liver injury was established by combined treatment of isoniazid and rifampicin. PPARγ was activated by 15d-PGJ2. The rats were killed on 14d and 28d of model establishment, respectively. The serum levels of total bilirubin (TBIL), direct bilirubin (DBIL), alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were measured. The pathological and ultrastructural changes of the liver tissue were observed. The activity of superoxide dismutase (SOD) and level of malondialdehyde (MDA) in the liver tissue were examined. The expression of high mobility group box 1 (HMGBl) was detected by Immunohistochemistry.ResultsIn the models of rat liver injury induced by isoniazid and rifampicin, the serum TBIL and DBIL increased obviously, the hepatic SOD activity signifcantly decreased, and the hepatic MDA content increased. Hepatic steatosis and infammatory cell infltration were observed, as well as structural damage of the mitochondrium and endoplasmic reticulum in hepatocytes. HMGBl immunoreactivity increased. Activation of PPARγ by 15d-PGJ2 obviously inhibited the changes above.ConclusionActivation of PPARγ by 15d-PGJ2 can protect against the liver injury induced by isoniazid and rifampicin viaantioxidation and inhibiting HMGB1 expression.

Peroxisome proliferator-activated receptor γ; high mobility group box 1; liver injury; isoniazid; rifampicin

R575

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.006

2016-12-19

2017-04-10

安徽省自然科學基金資助項目（NO.1208085MH155）

何雪（1989年），女，漢族，住院醫(yī)師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：ylsongcn@163.com