王薇，繆化春，吳鋒，黃銳，趙健

（皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，蕪湖 241002）

天麻多糖結(jié)合電針抑制腦缺血大鼠Meynert基底核神經(jīng)元損傷和上調(diào)BDNF、SCF及VEGF表達(dá)

王薇，繆化春，吳鋒，黃銳，趙健*

（皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，蕪湖 241002）

目的觀察腦缺血后Meynert基底核BDNF、SCF及VEGF等的表達(dá)，比較分析天麻多糖（gastrodia elata polysaccharide, GEP)）結(jié)合電針(electroacupuncture, EA）或單獨(dú)應(yīng)用對(duì)其干預(yù)效果，探討針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)腦缺血的神經(jīng)血管保護(hù)機(jī)制。方法將雄性SD大鼠40只隨機(jī)分成空白對(duì)照組、腦缺血模型組、天麻多糖組、電針組及針?biāo)幗Y(jié)合組，每組8只。采用單側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法制備局灶性腦缺血大鼠模型。模型制備成功后，天麻多糖組大鼠每日給予天麻多糖100mg/kg灌胃1次，連續(xù)2周；電針組大鼠每日電針刺激“百會(huì)”、“足三里”穴1次，每次30min，連續(xù)2周；針?biāo)幗Y(jié)合組每日電針刺激“百會(huì)”、“足三里”穴1次，每次30min，同時(shí)給予天麻多糖100mg/kg灌胃1次，連續(xù)2周。尼氏染色法觀察各組大鼠Meynert基底核神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及存活數(shù)，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠Meynert基底核BDNF、SCF及VEGF蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠缺血側(cè)Meynert基底核神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)顯著減少，BDNF、SCF及VEGF免疫染色顯著增強(qiáng)；與模型組比較，天麻多糖組、電針組及針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠缺血側(cè)Meynert基底核神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)顯著增加，BDNF、SCF及VEGF免疫染色顯著增強(qiáng)；針?biāo)幗Y(jié)合組與天麻多糖組、電針組比較，缺血側(cè)Meynert基底核神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)顯著增加，BDNF、SCF及VEGF免疫染色也增強(qiáng)。結(jié)論腦缺血后Meynert基底核神經(jīng)血管相關(guān)因子表達(dá)增加，提示Meynert基底核是腦缺血后易損區(qū)域之一；天麻多糖結(jié)合電針可上調(diào)BDNF、SCF及VEGF表達(dá)，對(duì)Meynert基底核起到神經(jīng)的保護(hù)作用，且作用優(yōu)于天麻多糖或電針的單獨(dú)應(yīng)用。

腦缺血；天麻多糖；電針；Meynert基底核； BDNF；SCF；VEGF

腦缺血病嚴(yán)重威脅到患者的神經(jīng)功能及生存質(zhì)量，如何有效地防治腦缺血仍為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)[1]。目前，關(guān)于腦缺血損傷區(qū)域的研究主要集中在大腦皮質(zhì)、海馬、齒狀回等部位[2-4]，其中大腦皮質(zhì)是腦缺血的主要易損區(qū)之一，而Meynert基底核是與其密切聯(lián)系的一個(gè)重要核團(tuán)，由該核發(fā)出的膽堿能神經(jīng)纖維主要投射至大腦皮質(zhì)，參與認(rèn)知過程[5]。有研究表明，電針（electroacupuncture, EA）治療可促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的增殖與分化，從而在一定程度上促進(jìn)腦組織功能的恢復(fù)[6]。天麻多糖（gastrodia elata polysaccharide, GEP）是從中藥天麻中提取的一種重要的活性成分，具有清除自由基及抗衰老的作用，可改善神經(jīng)功能缺損[7]，但其對(duì)腦缺血的治療機(jī)制尚不完全清楚。腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）可維持神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)和發(fā)育，促進(jìn)損傷神經(jīng)元修復(fù)和神經(jīng)突觸再生[4,8]；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損或變性時(shí)，干細(xì)胞因子（stem cell factor, SCF）表達(dá)增加并激活NSCs向損傷區(qū)域移位，發(fā)揮神經(jīng)再生作用[9]；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）可特異性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖進(jìn)而促進(jìn)腦內(nèi)新生血管形成和神經(jīng)發(fā)生來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。本課題組前期研究顯示天麻多糖結(jié)合電針可顯著促進(jìn)腦缺血大鼠額葉皮質(zhì)SCF和巢蛋白的表達(dá)[11]，但天麻多糖與電針結(jié)合對(duì)Meynert基底核內(nèi)的神經(jīng)、血管相關(guān)因子的表達(dá)影響，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過比較分析天麻多糖與電針結(jié)合或單獨(dú)應(yīng)用對(duì)腦缺血大鼠Meynert基底核BDNF、SCF及VEGF表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)腦缺血后Meynert基底核的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

成年健康雄性SD大鼠40只，體重（180～ 220g），由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)-2008-0033]。將大鼠隨機(jī)分為5組：即空白對(duì)照（blank control, Con）組、腦缺血模型（cerebral ischemia model, CIM）組、天麻多糖 (GEP)組、電針（EA）組和針?biāo)幗Y(jié)合（EA+GEP）組，每組8只。

2 主要試劑及儀器

兔抗大鼠BDNF、SCF和VEGF抗體、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒和HRP-DAB增強(qiáng)型顯色液均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；G6805-2型電針儀購(gòu)自上海醫(yī)用電子儀器廠理療分廠；Image-J圖像分析軟件購(gòu)自美國(guó)。

3 天麻多糖的制備

新鮮天麻洗凈經(jīng)勻漿機(jī)制成糊狀，分別經(jīng)蒸餾水浸提和95%乙醇醇沉制得粗天麻多糖，再經(jīng)DEAE-Cellulose-52柱分離制備天麻多糖。

4 造模方法

參照繆化春等方法[3]，采用線栓右側(cè)大腦中動(dòng)脈法制備局灶性腦缺血模型，以清醒后大鼠出現(xiàn)不能完全伸直左前爪，行走時(shí)偏向左側(cè)并向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒等神經(jīng)體征視為造模成功。大鼠自由攝食進(jìn)水，將造模成功大鼠用于實(shí)驗(yàn)。

5 治療方法

天麻多糖組和針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠每天按100mg/kg劑量進(jìn)行天麻多糖灌胃，連續(xù)2周。電針組和針?biāo)幗Y(jié)合組每日用電針治療儀針刺“百會(huì)”和“足三里”穴1次，以局部輕顫為度，每次30min，波寬1ms，電壓2V，頻率2Hz，連續(xù)治療2周。正常組和模型組則不給予任何治療，以上各組動(dòng)物均在相同的環(huán)境飼養(yǎng)。

6 組織切片制備及染色反應(yīng)

所有大鼠均經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟和升主動(dòng)脈，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈快速輸入100ml生理鹽水，然后輸入4%多聚甲醛溶液300ml灌注固定。開顱后將大鼠置于大鼠腦立體定位儀上，切取出含有Meynert基底核的節(jié)段，經(jīng)4%多聚甲醛后固定24h，脫水，透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm，切片分4套收集，按常規(guī)方法脫蠟至水。其中1套采用尼氏染色法觀察各組大鼠Meynert基底核內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)變化，其余3套按照試劑盒說明書分別進(jìn)行BDNF、SCF和VEGF的免疫組織化學(xué)反應(yīng)和HRP-DAB顯色步驟。陰性對(duì)照反應(yīng)用PBS替代相應(yīng)的一抗。常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍片。

7 結(jié)果判定

參照大鼠腦立體定位圖譜，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)每只大鼠選取前囟后1.4mm的相同腦冠狀切面各4張作為觀察對(duì)象，在400倍視野下參照參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行存活神經(jīng)元的計(jì)數(shù)以及觀察分析測(cè)量相同單位面積內(nèi)的BDNF、SCF和VEGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均灰度值。

8 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

1 天麻多糖結(jié)合電針更有效抑制腦缺血大鼠Meynert基底核神經(jīng)元損傷

尼氏染色結(jié)果顯示，正常組大鼠Meynert基底核神經(jīng)元排列緊密，細(xì)胞染色清晰，胞核位于中央。模型組Meynert基底核神經(jīng)元中部分發(fā)生細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核固縮，存活神經(jīng)元數(shù)量較正常組顯著減少；天麻多糖組、電針組和針?biāo)幗Y(jié)合組Meynert基底核的神經(jīng)元形態(tài)有明顯改善，存活神經(jīng)元數(shù)量較模型組顯著增加；與天麻多糖組和電針組比較，針?biāo)幗Y(jié)合組Meynert基底核的神經(jīng)元存活數(shù)顯著增加（圖1，表1）。

2 天麻多糖結(jié)合電針更明顯上調(diào)腦缺血大鼠Meynert基底核內(nèi)BDNF、SCF及VEGF免疫反應(yīng)性表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色顯示，各組大鼠Meynert基底核均有BDNF、SCF及VEGF陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞被DAB染成棕黃色，陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。與正常組比較，模型組大鼠Meynert基底核的BDNF、SCF及VEGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞平均灰度值降低；與模型組相比較，天麻多糖組、電針組和針?biāo)幗Y(jié)合組Meynert基底核的BDNF、SCF及VEGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，細(xì)胞平均灰度值明顯降低；但天麻多糖組與電針組相比較，Meynert基底核BDNF免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均灰度值無(wú)差異；與天麻多糖組和電針組比較，針?biāo)幗Y(jié)合組Meynert基底核的BDNF、SCF及VEGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞平均灰度值明顯降低（圖2，表2）。

圖1 腦缺血、天麻多糖與電針對(duì)大鼠Meynert基底核神經(jīng)元存活的影響（尼氏染色）。A，空白對(duì)照組；B，腦缺血模型組；C，天麻多糖組；D，電針組；E，針?biāo)幗Y(jié)合組；比例尺，50μmFig. 1 The efects of cerebral ischemia, GEP and EA on the survival of neurons in the NBM of rats (Nissl staining). A, blank control group; B, cerebral ischemia model group; C, GEP group; D, EA group; E, EA+GEP group; scale bar, 50μm

表1 大鼠Meynert基底核存活細(xì)胞數(shù)比較Tab. 1 Comparison of the number of surviving neurons in the NBM in each group

圖2 天麻多糖與電針對(duì)腦缺血大鼠Meynert基底核內(nèi)BDNF、SCF與VEGF免疫反應(yīng)性的影響。比例尺，50μmFig. 2 The efects of cerebral ischemia, GEP and EA on the immunoreactivities of BDNF, SCF and VEGF in the NBM of rats. Scale bar, 50μm

表2 大鼠Meynert基底核內(nèi)BDNF、SCF及VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和免疫反應(yīng)強(qiáng)度比較Tab. 2 Comparison of the number of BDNF, SCF and VEGF positive cells and the immunoreactive intensity of these factors in the NBM in each group

討 論

Meynert基底核屬于基底前腦中的大細(xì)胞核群，位于豆?fàn)詈讼路剑按┵|(zhì)和大腦腳間窩之間，主要由膽堿能神經(jīng)元組成，由該神經(jīng)核發(fā)出的膽堿能神經(jīng)纖維主要投射到大腦新皮質(zhì)，形成Meynert基底核-皮質(zhì)通路，參與學(xué)習(xí)和認(rèn)知過程[5,13]。本實(shí)驗(yàn)觀察到腦缺血后Meynert基底核神經(jīng)元存活數(shù)量較正常組顯著降低，神經(jīng)血管相關(guān)因子表達(dá)較基礎(chǔ)水平上升，提示Meynert基底核為腦缺血的受損部位之一。長(zhǎng)期腦缺血可能會(huì)導(dǎo)致記憶力、定向力、計(jì)算力、理解判斷力障礙，還可出現(xiàn)情感障礙和行為異常等一系列神經(jīng)功能障礙的表現(xiàn)[14]。有研究顯示，損傷Meynert基底核可引起大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元密度及乙酰膽堿的釋放量同時(shí)減少，最終可導(dǎo)致動(dòng)物的高級(jí)認(rèn)知功能障礙[13]。腦缺血引起的神經(jīng)功能障礙是否與Meynert基底核受損有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。

BDNF是由神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)[8]，BDNF通過與其受體TrkB的結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中特定神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育及突觸可塑性的調(diào)節(jié)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]；在生理情況下，BDNF表達(dá)維持較低水平，但受外界因素影響如腦缺血時(shí)，BDNF表達(dá)上調(diào)[3,16]。SCF是一種具有多種功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可與腦內(nèi)多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子及營(yíng)養(yǎng)因子共同作用，調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活、分化和遷移[17]；缺血缺氧等因素可誘導(dǎo)SCF的表達(dá)增加并與其酪氨酸激酶受體（tyrosine kinase receptor，KIT）結(jié)合，刺激NSCs增殖，并保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)與重建[18]。Zhao LR等對(duì)局灶性腦缺血大鼠進(jìn)行SCF皮下注射，結(jié)果顯示腦內(nèi)雙側(cè)皮質(zhì)下區(qū)神經(jīng)元前體細(xì)胞數(shù)量明顯增多，大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能得到一定的恢復(fù)[19]。VEGF是一種特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，它與血管發(fā)生有密切的關(guān)系，平時(shí)呈低水平表達(dá)；當(dāng)發(fā)生腦缺血時(shí)，缺血性腦損傷誘導(dǎo)VEGF及其受體VEGFR -2表達(dá)增加，兩者相結(jié)合促進(jìn)缺血部位血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和微血管生成，在一定程度上發(fā)揮修復(fù)受損神經(jīng)元和縮小梗死灶面積的作用[20,21]。另外，VEGF表達(dá)升高還可以啟動(dòng)IP3K/Akt /NF-κB和MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)再生，抑制神經(jīng)元凋亡和局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)NSCs增殖、遷移和分化，改善神經(jīng)功能[22]。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色觀察到腦缺血后Meynert基底核神經(jīng)血管相關(guān)因子BDNF、SCF及VEGF 3種蛋白表達(dá)量較基礎(chǔ)水平上升，表明腦缺血可刺激神經(jīng)血管相關(guān)因子表達(dá)代償性上調(diào)，提示神經(jīng)血管相關(guān)因子參與了腦缺血后神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制；雖然腦缺血可刺激BDNF、SCF和VEGF的表達(dá)上調(diào)，但并不足以對(duì)抗缺血性腦損傷，可能還需要通過外界因素介入促進(jìn)其表達(dá)進(jìn)一步升高才可能有利于腦缺血損傷的修復(fù)[4,16,20]。

天麻多糖是中藥天麻中一種重要的活性成分，其在降血壓、延緩衰老、抗菌、抗病毒、抗氧化和提高機(jī)體免疫力等方面有顯著療效[7]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)天麻多糖可促進(jìn)額葉皮質(zhì)巢蛋白和干細(xì)胞因子表達(dá)增加，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)，從而保護(hù)缺血區(qū)腦組織[11]。本實(shí)驗(yàn)觀察到天麻多糖可減輕Meynert基底核神經(jīng)元受損，增加BDNF、SCF及VEGF的蛋白表達(dá)，這與之前的研究結(jié)果一致[3,11]，提示應(yīng)用天麻多糖可促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)血管相關(guān)因子的表達(dá)增高，修復(fù)受損神經(jīng)元，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善神經(jīng)功能缺損。

腦缺血在中醫(yī)學(xué)屬“中風(fēng)”范疇，根據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論，其病變?cè)谀X，故針刺治療時(shí)首取督脈穴位。而“百會(huì)”穴歸屬督脈，針刺此穴可通經(jīng)活絡(luò)、通督醒腦，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病有治療作用[23]?！白闳铩毖▽僮汴?yáng)明胃經(jīng)，針刺此穴具有通經(jīng)活絡(luò)、補(bǔ)氣養(yǎng)血、健脾胃和促進(jìn)胃腸活動(dòng)等作用[24]，故本實(shí)驗(yàn)選用行經(jīng)督脈和陽(yáng)明經(jīng)穴的“百會(huì)”和“足三里”穴進(jìn)行電針刺激。有研究表明電針可通過活化動(dòng)物腦內(nèi)Notch信號(hào)通路增加BDNF和VEGF的表達(dá)，促使內(nèi)源性NSCs增殖、分化和遷移，參與神經(jīng)再生修復(fù)，促進(jìn)腦功能恢復(fù)，改善神經(jīng)功能缺損[16]。本研究應(yīng)用電針治療腦缺血后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Meynert基底核神經(jīng)元存活數(shù)量及BDNF、SCF及VEGF的表達(dá)均上調(diào)，此種表達(dá)現(xiàn)象同樣存在于大鼠海馬CA3區(qū)[3]，提示電針可能通過上調(diào)BDNF和VEGF等神經(jīng)血管相關(guān)因子的表達(dá)水平來(lái)刺激缺血區(qū)內(nèi)源性NSCs增殖，有利于腦缺血損傷的修復(fù)。天麻多糖與電針結(jié)合可使Meynert基底核神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)及BDNF、SCF及VEGF的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，效果明顯優(yōu)于單用天麻多糖或電針，其原因可能是電針增加了胃腸對(duì)天麻多糖的吸收，兩者協(xié)同共同促進(jìn)神經(jīng)血管相關(guān)因子的顯著表達(dá)，進(jìn)而修復(fù)受損神經(jīng)元，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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Combined treatment by gastrodia elata polysaccharide and electroacupuncture protects the nucleus basalis of Meynert of rats from cerebral ischemia and increases the expression of BDNF, SCF and VEGF

Wang Wei, Miao Huachun, Wu Feng, Huang Rui, Zhao Jian*
(Department of Anatomy, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

ObjectiveTo study the expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF), stem cell factor (SCF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the nucleus basalis of Meynert (NBM) after focal cerebral ischemia, compare and analyze the efects of gastrodia elata polysaccharide (GEP), electroacupuncture (EA) and their combination (EA+GEP) on it, and explore the mechanism underlying the protective efect of EA+GEP on nerves and vessels in cerebral ischemia.MethodsForty male Sprague-Dawley rats were randomized into fve groups of eight rats∶ the blank control group, cerebral ischemia model group, GEP group, EA group, and EA+GEP group. The cerebral ischemia model was established by occlusion of the middle cerebral artery (MCAO), after which the GEP group were given 100mg/kg body weight GEP by gavage once daily for 2 successive weeks; the EA group were given 30-minute-EA in baihui and zusanli acupoints once daily for 2 successive weeks; the EA+GEP group were given 30-minute-EA in baihui and zusanli acupoints as well as 100mg/kg GEP by gavage, both once daily for 2 successive weeks. The number and morphology of surviving neurons in the NBM were observed after Nissl staining, and the expression of BDNF, SCF and VEGF protein in the NBM was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with the blank control group, the number of surviving neurons in the NBM decreased signifcantly in the model group, and the immunoreactivity of BDNF, SCF and VEGF wasremarkably higher. The number of surviving neurons and the expression of BDNF, SCF and VEGF in the NBM were signifcantly higher in the GEP group and the EA group than in the model group, and were even higher in the EA+GEP group. Conclusion The expression of nerve and vascular related factors in the NBM increases after cerebral ischemia, suggesting that the NBM, which is related to cognitive functions, is vulnerable to cerebral ischemia. The combined treatment by GEP and EA increases the expression of these factors and protects the nerves and vessels in the NBM in cerebral ischemia, the efect of which is superior to that of GEP or EA alone.

Cerebral ischemia; gastrodia elata polysaccharide; electroacupuncture; nucleus basalis of Meynert; brain derived neurotrophic factor; stem cell factor; vascular endothelial growth factor

R741

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.005

2016-11-19

2017-03-30

皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金（WK201612）；安徽省自然科學(xué)基金（1608085QH223）

王薇，女(1985年)，漢族，助教

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：309778721@qq.com