周 銘 唐海沁 符趙鑫 劉 銘

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，安徽 合肥 230000)

·心、腦血管及代謝性疾病·

冠心病患者血小板紫外光譜的變化

周 銘 唐海沁 符趙鑫 劉 銘

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，安徽 合肥 230000)

目的 觀察冠心病患者血小板紫外光譜的變化。方法 檢測(cè)對(duì)象分為冠心病組和對(duì)照組，冠心病組包括氯吡格雷組和阿司匹林組。提取血小板體外誘導(dǎo)聚集，采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描得到紫外光譜數(shù)據(jù)，應(yīng)用Origin8.0及SPSS13.0軟件分析。結(jié)果 血小板紫外光譜在204 nm和280 nm波長(zhǎng)處可見(jiàn)吸收峰，血小板聚集后在204 nm波長(zhǎng)處吸收峰顯著大于聚集前；冠心病組與正常組以及冠心病組內(nèi)氯吡格雷組和阿司匹林組血小板紫外光譜波峰出現(xiàn)位置差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 紫外光譜可用于臨床檢測(cè)血小板聚集，為其提供一種更為靈敏、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

血小板聚集；紫外光譜；冠心病

在冠心病發(fā)生和發(fā)展中，血小板的活化和聚集是重要環(huán)節(jié)，不僅能夠作為診斷冠心病的佐證，也可以用來(lái)預(yù)測(cè)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)度〔1〕。臨床上，抗血小板治療作為冠心病治療的基石，在一級(jí)和二級(jí)預(yù)防都起著至關(guān)重要的作用。目前血小板聚集的檢測(cè)方法由于體內(nèi)血栓形成環(huán)境的復(fù)雜性只能粗糙和間接估計(jì)血小板聚集情況，不能充分反映血小板聚集的功能狀態(tài)〔2〕，尋求簡(jiǎn)單、可行的反映血小板聚集程度的臨床檢測(cè)方法成為心血管研究?jī)?nèi)容之一。紫外光譜能夠在一定程度上反映有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛〔3〕。本研究應(yīng)用光譜學(xué)原理將紫外光譜檢測(cè)應(yīng)用于老年冠心病患者血小板聚集的研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇60歲以上住院服用抗血小板藥時(shí)間1 w以上的冠心病患者20例，男14例，女6例，平均年齡(78±7)歲，根據(jù)服用藥物分為氯吡格雷組和阿司匹林組各10例，藥物劑量為氯吡格雷75 mg/d或阿司匹林100 mg/d；同時(shí)選擇10例健康青年志愿者作為對(duì)照組，男6例，女4例，平均年齡(24±1)歲。

1.2 儀器與試劑 雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京譜析通用儀器有限公司 TU1901)；比色皿(1 mm光程)；超聲波清洗器；離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5415R)；10～1 000 μl加樣器(德國(guó)Eppendorf Research plus)，0.5～10 μl加樣器(Flnnplpeffe Y351084027)；真空采血管、EP管；二磷酸腺苷(ADP，美國(guó)Sigma公司A2754-100 mg)；花生四烯酸(AA，Sigma公司A9673-10 mg)；無(wú)水CaCl2(國(guó)產(chǎn)分析純)；生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血小板制備 真空采血管取兩組患者2 ml的1∶9檸檬酸鈉抗凝血作為樣本，用移液器將2 ml血移入EP管后放入離心機(jī)離心，采用Alhaloo法二次離心得到血小板沉淀，二次離心時(shí)的乏血小板血漿上清(PPP)留200 μl備用：取3 μl于比色皿，再將剩余的PPP與血小板沉淀混勻，然后各取混懸液3 μl于另兩個(gè)比色皿內(nèi)。

1.3.2 血小板的誘導(dǎo)聚集 移液器吸取CaCl2及誘導(dǎo)劑加入含3 μl血小板懸液的比色皿內(nèi)，其中氯吡格雷組加誘導(dǎo)劑ADP、阿司匹林組加AA誘導(dǎo)聚集，并使得最終濃度CaCl210 mmol/L，AA 0.7 mmol/L，ADP 10 μmol/L〔4〕。一份是混勻并充分反應(yīng)后稀釋至4 ml；另一份則是待稀釋至4 ml后加入等量的誘導(dǎo)劑，比色皿內(nèi)PPP血小板稀釋后加入CaCl2及誘導(dǎo)劑，反應(yīng)時(shí)間控制在10 min內(nèi)。正常組加入誘導(dǎo)劑ADP并作同樣的處理誘導(dǎo)聚集。

1.3.3 紫外光譜檢測(cè) 稀釋后的血小板充分混勻后放入紫外分光光度計(jì)，設(shè)置紫外光譜掃描范圍200～400 nm，掃描間隔為0.2 nm。基線采用同等量的CaCl2及誘導(dǎo)劑稀釋至4 ml校準(zhǔn)，保證變量是加入的血小板并消除加入的誘導(dǎo)劑對(duì)紫外光譜的影響。檢測(cè)完后用超聲清洗比色皿，防止殘留物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程從釆血至上機(jī)檢測(cè)在3 h〔5〕內(nèi)完成。UVWIN5.0軟件將紫外光譜檢測(cè)數(shù)據(jù)導(dǎo)出，采用Origin8.0軟件作圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

血小板在紫外區(qū)204 nm、280 nm處出現(xiàn)吸收峰，在加用誘導(dǎo)劑后，氯吡格雷組和阿司匹林組，血小板紫外光譜在204 nm波長(zhǎng)吸光度顯著改變且聚集后吸光度峰值大于聚集前(P<0.05)，見(jiàn)表1。正常組波峰位置出現(xiàn)也在204 nm波長(zhǎng)處，與冠心病組比較紫外光譜未見(jiàn)差異。冠心病組與對(duì)照組性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.69)。

表1 血小板紫外光譜204 nm波長(zhǎng)處吸光值

3 討 論

血小板具有細(xì)胞膜系統(tǒng)和細(xì)胞骨架蛋白，特殊的儲(chǔ)存顆粒和線粒體、溶酶體等細(xì)胞器，而冠心病患者中，血小板的活化標(biāo)志物CD62p、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅱa受體(PAC)-1等表達(dá)率明顯高于正常，平均體積和分布寬度也會(huì)顯著增高〔6〕，可以看出血小板反應(yīng)紫外光譜是各種物質(zhì)的綜合光譜。以往人單個(gè)血小板拉曼光譜的研究其振動(dòng)峰主要顯示的是蛋白質(zhì)和脂肪的混合峰，也有718 cm-1處磷脂分子C-N鍵938 cm-1處脂肪鏈C-C骨架的振動(dòng)峰〔7〕。我們的結(jié)果表明血小板在204 nm和280 nm波長(zhǎng)處具有紫外吸收峰，其位置反映的是分別是羧基和蛋白質(zhì)中的共軛苯環(huán)體系，其中204 nm波長(zhǎng)處血小板聚集前后的紫外光譜有著顯著變化。檢索相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)血小板在近紅外光波長(zhǎng)420 nm-1有吸收峰〔8〕，并隨著血小板濃度改變而變化，尚未發(fā)現(xiàn)紫外光譜應(yīng)用于血小板研究的報(bào)道，本研究結(jié)果為臨床檢測(cè)血小板聚集程度提供新的參考方法，可依據(jù)聚集前后血小板特定波長(zhǎng)處紫外吸收峰值的變化占聚集前吸光度的比值來(lái)反映血小板聚集率。

血小板在204 nm波長(zhǎng)處的改變與血小板的聚集密切相關(guān)。在聚集過(guò)程中血小板活化膜糖蛋白(GP)會(huì)重新分布，膜GPⅡb/Ⅲa分子上的纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)暴露，最終與纖維蛋白原的α鏈中的RGD肽序和γ鏈C端十二肽結(jié)合，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使相鄰的血小板聚集〔9〕。GP的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移以及GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原氨基酸殘基的結(jié)合等聚集過(guò)程中發(fā)生的反應(yīng)，不僅有化合鍵的形成而且伴隨著氨基酸羧基的變化，引起聚集后反應(yīng)羧基204 nm波長(zhǎng)處吸收峰值增大。在重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)由于取樣誤差聚集后的血小板量略小于聚集前時(shí)(以280 nm處吸收峰值為標(biāo)準(zhǔn))，仍可得這一結(jié)果。而且，實(shí)驗(yàn)中充分稀釋的誘導(dǎo)劑與血小板混合幾乎不會(huì)引起血小板的聚集〔10〕，依此來(lái)模擬聚集前的血小板，確保其紫外光譜與聚集后具有可比性，同時(shí)也加入了乏血小板的比較，能對(duì)比觀察消除血漿成分對(duì)血小板光譜的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確。目前，檢測(cè)血小板聚集功能，臨床上應(yīng)用最為廣泛的是光比濁法，利用血小板聚集儀測(cè)定血小板聚集前后血漿透光率變化來(lái)間接反映血小板聚集率，但有不足：高脂血癥等其他影響血清透明度的因素會(huì)影響血小板吸光度；只能檢測(cè)較大的血小板聚集物，敏感性不高，因而比濁法不能夠準(zhǔn)確反映血小板的聚集功能〔11〕。散射性粒子檢測(cè)法利用40 μm波長(zhǎng)為675 nm的激光束透射到聚集顆粒發(fā)生反射，能夠很靈敏地檢測(cè)到血小板顆粒的大小及數(shù)量，但聚集顆粒不能全面反映凝血功能。血小板功能分析儀對(duì)纖維蛋白原缺陷性疾病診斷靈敏度低〔12〕，而剪切誘導(dǎo)法受溫度和血小板數(shù)目影響較大，電阻抗法因電極的放置則要求難以滿足臨床需要且靈敏度低，應(yīng)用較少〔13〕。血栓彈力圖作為一種新型的床旁血小板聚集率檢測(cè)方法，運(yùn)用血液凝固牽拉的原理，能夠直接使用全血檢測(cè)全面地分析血液凝固及溶解過(guò)程〔14〕，但檢測(cè)費(fèi)用較高。紫外光譜檢測(cè)法有著很高的靈敏度，在無(wú)紫外吸收的溶劑中可達(dá)0.005%，實(shí)驗(yàn)中也可以觀察到3 μl血小板血漿在204 nm處即有明顯吸收峰，而且多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高，因而能夠更準(zhǔn)確地反映血小板的聚集功能〔15〕。本研究顯示紫外光譜主要揭示的是共軛體系等官能團(tuán)間的關(guān)系，具有一定的局限性。實(shí)際上，氯吡格雷代謝產(chǎn)物與P2Y12受體會(huì)形成二硫鍵〔16〕，纖維蛋白原分子的α、β和γ鏈也是通過(guò)29對(duì)二硫鍵連接，阿司匹林會(huì)抑制AA環(huán)氧化酶使絲氨酸乙?；?7〕。紅外光譜利用分子振動(dòng)能夠產(chǎn)生許多窄帶吸收，相比下能夠更多地反映官能團(tuán)的種類及包含結(jié)構(gòu)。Tablin等〔18〕發(fā)現(xiàn)了寒冷刺激的活化血小板膜-CH2區(qū)具有不同紅外吸收，而冠心病患者血小板也處于活化狀態(tài)，比較冠心病與正常人血小板紅外光譜-CH2區(qū)的振動(dòng)變化，對(duì)于冠心病的診斷具有重要意義。

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〔2015-09-12修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(12010402116)

唐海沁(1956-)，男，碩士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事冠心病血小板功能的研究。

周 銘(1989-)，男，碩士，主要從事冠心病血小板功能的研究。

R318.51

A

1005-9202(2017)11-2661-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.026