逄 利 孟祥偉

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

重組分子靶向R9-GRIM-19融合蛋白治療肝癌的療效與機制

逄 利 孟祥偉

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

目的 探討多聚精氨酸蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域R9作為維甲酸/干擾素聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡相關(guān)基因(GRIM)-19載體表達(dá)R9-GRIM-19融合蛋白對肝癌的治療作用。方法 應(yīng)用PCR法擴增R9-GRIM-19序列，與載體pET32 a (+)連接，在大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)上表達(dá)并經(jīng)Ni2+-NTA純化，在體外及體內(nèi)檢測R9-GRIM-19融合蛋白抑制肝癌生長的能力。結(jié)果 pET32a-R9-GRIM-19重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21菌株內(nèi)實現(xiàn)了高效表達(dá)；R9-GRIM-19融合蛋白能夠進(jìn)入肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)，并能抑制HepG2細(xì)胞的增殖；體內(nèi)抑瘤實驗表明R9-GRIM-19對肝癌HepG2小鼠移植瘤具有明顯的抑制作用。結(jié)論 成功地在大腸桿菌中表達(dá)了R9-GRIM-19融合蛋白，純化的融合蛋白具有抑制肝癌生長的能力。

肝癌；多聚精氨酸；融合蛋白

維甲酸/干擾素聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡相關(guān)基因(GRIM)-19是一種抑癌基因，目前認(rèn)為其通過負(fù)性調(diào)節(jié)某些信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及代謝。GRIM-19作為一個生長抑制因子，是腫瘤基因治療的一個新的靶點，其在抗腫瘤治療方面已經(jīng)展現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢，而對正常細(xì)胞無影響〔1，2〕。將外源性GRIM-19蛋白導(dǎo)入惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)是一種切實有效的分子靶向治療方案，但是作為一種大分子生物活性物質(zhì)，GRIM-19蛋白在天然狀態(tài)下不能穿過腫瘤細(xì)胞膜發(fā)揮治療效應(yīng)。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)是一類具有生物膜穿透功能的小分子肽類物質(zhì)，能攜帶多種大分子物質(zhì)穿入幾乎所有哺乳動物的細(xì)胞，而不破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，對宿主細(xì)胞無明顯的毒性作用〔3〕。多聚精氨酸PTD是根據(jù)PTD結(jié)構(gòu)特點設(shè)計合成的模擬跨膜肽，其膜轉(zhuǎn)運作用與多聚精氨酸的個數(shù)有關(guān)，8～10個精氨酸組成的PTD作用最強，通常選用R9-PTD〔4〕。本實驗利用R9-PTD作為跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)域，與GRIM-19進(jìn)行融合，并在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，進(jìn)一步在體外及體內(nèi)檢測R9-GRIM-19融合蛋白抑制肝癌生長的能力，以探索肝癌治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)、質(zhì)粒pET32 a (+)購自德國Novagen公司；人肝癌細(xì)胞株(HepG2)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑 蛋白Marker和DNA Marker購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、HindⅢ、DNA連接酶、Taq酶、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計與合成 為了將擴增出的目的片段克隆到表達(dá)載體中，在目的基因的上下游引物中分別加入pET32a(+)載體上BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點，用于將目的基因片段正確有效地插入到載體中。R9-GRIM-19引物序列為正義引物：5′-CGCGGATCCCGACGACGACGACGACGACGACGACGAATGGCGG CGTCAAAGGTGAAGCA-3′；反義引物：5′-CCCAAGCTTCTACGTGTACCACATGAAGCCGTGG-3′。

1.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 采用PCR方法擴增R9-GRIM-19融合基因，利用瓊脂糖凝膠電泳回收R9-GRIM-19基因片段。用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對pET32a (+)進(jìn)行酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收載體pET32a (+)；利用ClonExpress?Entry One Step Cloning Kit將擴增回收好的R9-GRIM-19片段，重組克隆到線性化的pET32a (+)載體中。將重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，挑取單菌落，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定。

1.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將含有重組質(zhì)粒pET32a(+)-R9-GRIM-19的E.coli BL21(DE3)接種于含氨芐西林(100 μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h后，按1%接種量接種于含400 ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，當(dāng)光密度(OD)600達(dá)0.6～0.8時，加入0.4 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，離心收集菌體，超聲破碎后分別取上清及沉淀，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.6 目的蛋白的純化與復(fù)性 取表達(dá)菌體裂解上清液進(jìn)行Ni2+-NTA親和層析：將含有R9-GRIM-19的樣品加入經(jīng)Tris-HCl 緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，10%甘油，pH8.5)平衡的Ni2+-NTA介質(zhì)中，用該緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，再用梯度濃度的咪唑溶液(含20～500 mmol/L咪唑的Tris-HCl緩沖液)依次洗脫，收集各個洗脫峰，行10% SDS-PAGE電泳鑒定。復(fù)性：將純化后的樣品裝入透析袋中，先后置于透析復(fù)性緩沖液中梯度透析。透析結(jié)束后離心除去不溶物，收集上清，即為復(fù)性后的目的蛋白。

1.7 細(xì)胞實驗

1.7.1 融合蛋白的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記 純化后的GRIM-19、R9-GRIM-19融合蛋白放在碳酸鹽緩沖液中透析過夜。取適量FITC，加入二甲基亞砜(DMSO)，標(biāo)記蛋白溶液后離心，用磷酸鹽緩沖液(PBS)透析除去游離熒光素。

1.7.2 融合蛋白R9-GRIM-19穿透HepG2細(xì)胞能力檢測 取對數(shù)生長期的HepG2計數(shù)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基接種至6孔培養(yǎng)板上，每孔接種細(xì)胞約5×105個，37℃培養(yǎng)過夜。分別加入FITC標(biāo)記的GRIM-19蛋白和R9-GRIM-19融合蛋白，至終濃度為40 μg/ml，37℃作用2 h；棄上清，PBS洗3次；加入甲醇，置于-20℃固定10 min；加入含50%甘油的PBS封片，倒置熒光顯微鏡下觀察融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.7.3 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測融合蛋白R9-GRIM-19對HepG2細(xì)胞增殖的影響 將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以2×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度(5、10、20、30、40和50 μg/ml)的R9-GRIM-19融合蛋白及GRIM-19蛋白(濃度為50 μg/ml)各100 μl，每個濃度設(shè)5個平行組，空白對照組加等體積的緩沖液，背景組為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。實驗終止前4 h，每孔加入20 μl濃度為 5 mg/ml的MTT。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，37℃孵育20 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處每孔的吸光度，計數(shù)細(xì)胞的抑制率，抑制率=(1-給藥組OD值/陰性對照組OD值)×100%。以藥物的不同濃度和細(xì)胞的存活率作圖，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.8 動物實驗

1.8.1 肝癌HepG2動物模型的建立 取對數(shù)生長期的HepG2，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基離心洗滌2次，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/ml。于裸鼠前肢背部皮下接種HepG2細(xì)胞，每個接種部位注射0.1 ml細(xì)胞懸液，待移植瘤生長至體積約100 mm3時開始實驗。

1.8.2 肝癌裸鼠的治療及觀察指標(biāo)

1.8.2.1 動物分組及給藥 選取腫瘤大小相近的裸鼠，隨機分為陰性對照(Vehicle)組、GRIM-19組、R9-GRIM-19低、中、高劑量組，每組6只。各組給藥方式：R9-GRIM-19低、中、高組按照4、8、16 mg/kg體重，隔日一次腹腔注射；GRIM-19組給予16 mg/kg體重的GRIM-19蛋白隔日一次腹腔注射；Vehicle組給予相同劑量及頻次的PBS腹腔注射。

1.8.2.2 療效觀察 分別于治療后第0、3、7、14、21、28天測量腫瘤大小〔5〕，體積(mm3)=長×寬2×0.52，繪制移植瘤裸鼠的腫瘤生長曲線。治療28 d后將各組裸鼠麻醉后取出腫瘤組織稱取瘤重，抑瘤率=(1-治療組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)×100%。腫瘤組織4%甲醛溶液固定，行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 pET32a-R9-GRIM-19原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 R9-GRIM-19基因與載體pET32a (+)連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選陽性的重組質(zhì)粒用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在約5 800、430 bp處各有一條DNA條帶，分別與pET32a和R9-GRIM-19的理論堿基數(shù)基本一致，證明pET32a-R9-GRIM-19重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 pET32a-R9-GRIM-19重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的表達(dá)載體pET32a-R9-GRIM-19轉(zhuǎn)化E.coli B21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在37℃經(jīng)0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h，離心超聲裂解誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌，SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)形式，特異性的表達(dá)條帶主要出現(xiàn)在菌體經(jīng)破碎后收集的沉淀中，上清中含量很低，表明表達(dá)的R9-GRIM-19融合蛋白主要以包涵體的形式存在于超聲沉淀中。見圖2。

M：蛋白 Marker；1：pET32a-R9-GRIM-19-BL21表達(dá)載體蛋白提取液上清；2：pET32a-R9-GRIM-19-BL21表達(dá)載體蛋白提取液沉淀 圖2 SDS-PAGE檢測R9-GRIM-19蛋白表達(dá)形式

2.3 目的蛋白的層析純化 SDS-PAGE電泳顯示，穿透液(F泳道)中不帶His標(biāo)簽的不能與樹脂特異性結(jié)合的雜蛋白被洗脫了下來。從E泳道可以看出，隨著洗脫的進(jìn)行，殘留在樹脂上的帶有His標(biāo)簽的目的蛋白越來越少，直至最終被完全洗脫下來。并且洗脫下來的條帶十分單一，幾乎沒有雜帶，說明純化得到的目的蛋白純度很高。見圖3。

2.4 融合蛋白R9-GRIM-19的跨膜效應(yīng) FITC標(biāo)記的R9-GRIM-19融合蛋白和GRIM-19蛋白分別與HepG2共孵育，熒光顯微鏡觀察顯示：R9-GRIM-19融合蛋白組HepG2內(nèi)部有很強的綠色熒光，而GRIM-19蛋白組HepG2內(nèi)幾乎不見綠色熒光，說明R9介導(dǎo)GRIM-19蛋白穿透HepG2進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。見圖4。

M.蛋白標(biāo)記；S.原液；F.穿透液；E.目的蛋白洗脫樣 圖3 鎳離子親和層析純化R9-GRIM-19的SDS-PAGE電泳

A.HepG2 細(xì)胞與R9-GRIM-19融合蛋白共孵育；B.HepG2細(xì)胞與GRIM-19蛋白共孵育 圖4 融合蛋白R9-GRIM-19轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入HepG2細(xì)胞 (×200)

2.5 融合蛋白R9-GRIM-19對HepG2細(xì)胞增殖的影響 R9-GRIM-19對HepG2細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用，并且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著蛋白濃度的增大，抑制作用越來越強。在處理24 h時，R9-GRIM-19對HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(44.7±4.8)μg/ml；而GRIM-19組HepG2細(xì)胞增殖無明顯變化。

2.6 融合蛋白R9-GRIM-19對HepG2移植瘤生長的抑制作用

根據(jù)肝癌裸鼠腫瘤體積繪制腫瘤的生長曲線(圖5)，在治療前體積基本相同的條件下，Vehicle組和GRIM-19組腫瘤的體積幾乎成直線增長趨勢，而在用R9-GRIM-19治療組的腫瘤體積明顯受到了抑制。治療第28天處死裸鼠，剝?nèi)×鰤K并稱重，計算平均值及抑瘤率，與Vehicle組和GRIM-19組相比，R9-GRIM-19組腫瘤重量明顯降低(P<0.05)，R9-GRIM-19 4 mg/kg、8 mg/kg和16 mg/kg治療組腫瘤重量分別為0.87 g、0.72 g和0.64 g，均顯著小于Vehicle組的1.18 g，各組抑瘤率分別為26.3%、39.0%和45.8%；GRIM-19組的腫瘤抑制率與Vehicle組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 各組移植瘤本積的變化

2.7 病理組織學(xué)觀察 不同劑量R9-GRIM-19融合蛋白組(4、8、16 mg/kg)的小鼠腫瘤細(xì)胞分布疏松，腫瘤細(xì)胞呈團塊狀分布，胞質(zhì)透亮狀改變，核固縮，核分裂象減少，可見炎癥細(xì)胞浸潤，腫瘤組織出現(xiàn)壞死灶；Vehicle組和GRIM-19蛋白組腫瘤的HE染色鏡下可見腫瘤細(xì)胞排列致密，以圓形或橢圓形為主，大小不一，細(xì)胞體積大，核染色質(zhì)深，胞核較大，核分裂象多見，腫瘤組織切片中沒有觀察到明顯的壞死。見圖6。

圖6 HE染色觀察小鼠腫瘤組織形態(tài)(×200)

3 討 論

GRIM-19是一種抑癌基因，其功能主要包括腫瘤抑制，參與線粒體代謝和增強先天免疫〔5～8〕。GRIM-19在多種腫瘤組織中低表達(dá)或表達(dá)缺失，其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期負(fù)相關(guān)。研究表明GRIM-19的缺失或下調(diào)促進(jìn)了惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入外源性GRIM-19可特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，達(dá)到有效靶向治療腫瘤的目的，而對正常細(xì)胞無凋亡效應(yīng)、無細(xì)胞毒性〔1，2〕，均提示GRIM-19作為一個生長抑制因子，是腫瘤基因治療的一個新的靶點，將外源性GRIM-19蛋白導(dǎo)入惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)可能是一種切實有效的分子靶向治療。利用介入方法將生物活性物質(zhì)遞送到病灶組織，不僅可以達(dá)到良好的治療效果，而且降低了對正常組織的損傷，但由于生物活性分子受自身理化因素的影響，無法實現(xiàn)正常的藥物遞送。PTD是介導(dǎo)生物活性蛋白轉(zhuǎn)移的新方式，它能夠高效穿過生物膜，將與其連接的多肽、蛋白質(zhì)及DNA等大分子跨膜導(dǎo)入幾乎所有的組織和細(xì)胞，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高而且對細(xì)胞沒有損傷〔3〕。

利用分子生物學(xué)技術(shù)將目的基因克隆到原核表達(dá)載體中，并使其在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)是獲得大量、高純度融合蛋白最有效的手段。本實驗結(jié)果顯示：與肝癌HepG2細(xì)胞孵育2 h后，就能在細(xì)胞內(nèi)觀察到明顯的綠色熒光反應(yīng)，而GRIM-19蛋白與HepG2細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞內(nèi)部沒有觀察到熒光反應(yīng)，說明不含R9蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的GRIM-19蛋白無法穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

1 Huang Y，Yang M，Yang H，etal.Upregulation of the GRIM-19 gene suppresses invasion and metastasis of human gastric cancer SGC-7901 cell line 〔J〕.Exp Cell Res，2010；316(13)：2061-70.

2 Kong D，Zhao L，Du Y，etal.Overexpression of GRIM-19，a mitochondrial respiratory chain complex I protein，suppresses hepatocellular carcinoma growth 〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2014；7(11)：7497-507.

3 Ryu JS，Kuna M，Raucher D.Penetrating the cell membrane，thermal targeting and novel anticancer drugs：the development of thermally targeted，elastin-like polypeptide cancer therapeutics 〔J〕.Ther Deliv，2014；5(4)：429-45.

4 Okamoto T，Inozume T，Mitsui H，etal.Overexpression of GRIM-19 in cancer cells suppresses STAT3-mediated signal transduction and cancer growth 〔J〕.Mol Cancer Ther，2010；9(8)：2333-43.

5 Menon C，Polin GM，Prabakaran I，etal.An integrated approach to measuring tumor oxygen status using human melanoma xenografts as a model 〔J〕.Cancer Res，2003；63(21)：7232-40.

6 Chen Y，Lu H，Liu Q，etal.Function of GRIM-19，a mitochondrial respiratory chain complex I protein，in innate immunity 〔J〕.J Biol Chem，2012；287(32)：27227-35.

7 Liu Q，Wang L，Wang Z，etal.GRIM-19 opposes reprogramming of glioblastoma cell metabolism via HIF1α destabilization 〔J〕.Carcinogenesis，2013；34(8)：1728-36.

8 孫寶勝，孟凡旭，于士龍，等.GRIM-19蛋白在taurolidine誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡中的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(2)：424-6.

〔2017-01-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省科技發(fā)展計劃重點科技攻關(guān)項目(No.20150204006YY)

孟祥偉(1961-)，男，教授，主要從事消化系統(tǒng)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

逄 利(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤及中毒的研究。

R735.7

A

1005-9202(2017)11-2626-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.011