周亞男，王英琪，劉紅，劉偉，全志剛，王欣卉，寇芳，李志江，楊宏志

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

噴霧干燥法制備魯氏酵母發(fā)酵劑的研究

周亞男，王英琪，劉紅，劉偉，全志剛，王欣卉，寇芳，李志江*，楊宏志*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

利用噴霧干燥法可批量制備產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化用量的魯氏酵母，顯著縮短發(fā)酵周期，增加收益。本研究利用YDP培養(yǎng)基及20 L微生物發(fā)酵罐制備魯氏酵母菌懸液，通過研究不同生長時間魯氏酵母及培養(yǎng)基殘?zhí)呛俊⒓毎芍氐淖兓_定最佳噴霧干燥時間。采用單因素及正交試驗對保護劑及噴霧干燥條件進行優(yōu)化。研究結(jié)果表明：在發(fā)酵罐培養(yǎng)時間27 h時，細胞干重達到最大18 g/L，此時為最佳噴霧干燥時間。保護劑最佳配比為脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%。確定最佳噴霧干燥條件為進口溫度115℃，進料流量15%（蠕動泵轉(zhuǎn)速占比），保護劑與菌泥比例1∶1（g/L），按照上述條件得到發(fā)酵劑的存活率達到83%以上。

魯氏酵母；保護劑優(yōu)化；噴霧干燥工藝

魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是傳統(tǒng)豆醬中增香的微生物。作為最常見的嗜高滲透壓酵母菌，在豆醬的后期發(fā)酵過程中，協(xié)同球擬酵母（Torulopsis）、假絲酵母（Candida）、對風味物質(zhì)的產(chǎn)生起到重要作用[1]。豆醬的釀造過程中離不開酵母菌的作用，自然條件下發(fā)酵的酵母菌含量有限，而且豆醬發(fā)酵周期長，魯氏酵母發(fā)酵劑如果能夠大量的應(yīng)用到豆醬后熟發(fā)酵階段中，可縮短周期、增加風味物質(zhì)、提高企業(yè)經(jīng)濟效益。

目前發(fā)酵劑的生產(chǎn)主要采用真空冷凍干燥和噴霧干燥[2]。相關(guān)研究表明，真空冷凍干燥凍干的菌粉雖活力高，但產(chǎn)量較小，成本較高，不適合批量生產(chǎn)，而且產(chǎn)品呈塊狀不利于發(fā)酵使用。噴霧干燥是一種生產(chǎn)效率高，操作費用低的常用干燥技術(shù)，其應(yīng)用廣泛，產(chǎn)業(yè)化程度高，有廣闊發(fā)展前景[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，用噴霧干燥技術(shù)制備益生菌、乳酸雙歧桿菌、醋酸菌發(fā)酵劑，最終獲得發(fā)酵劑存活率均可達到83%以上[6-8]。在噴霧干燥過程中進口溫度過高，使發(fā)酵劑內(nèi)細胞脫水導致熱滅活，為使魯氏酵母生存的最大化，合理的優(yōu)化噴霧干燥工藝是提高發(fā)酵劑存活率的關(guān)鍵。因此研究以制作傳統(tǒng)豆醬應(yīng)用的魯氏酵母為發(fā)酵劑，研究保護劑優(yōu)化及噴霧干燥法制備魯氏酵母的工藝，為工業(yè)化制備魯氏酵母發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏酵母：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；YPD液體培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；平板計數(shù)瓊脂：Xiya Reagent生物技術(shù)有限公司；海藻糖（食品級）：山東天力藥業(yè)有限公司；谷氨酸鈉（食品級）：Biosharp生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉（食品級）：伊利乳業(yè)有限公司；氯化鈉（分析純）、葡萄糖（分析純）、DNS（3，5-二硝基水楊酸試劑）：天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

20 L微生物發(fā)酵罐：上海洋格生物工程設(shè)備有限公司；754紫外、可見分光光度計：上海光譜有限公司；生物顯微鏡：重慶光學儀器廠；全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；LDZM立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；YM-6000Y小型噴霧干燥機：上海豫明儀器有限公司；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥機：上海森信實驗儀器有限公司；R2140型分析天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Centrifuge 5403 R低溫離心機：Eppendorf生命科技有限公司；FA25model均質(zhì)機：上海佛魯克流體機械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魯氏酵母發(fā)酵液的制備

活化微量魯氏酵母凍干粉，經(jīng)28℃，180 r/min，全溫振蕩器中培養(yǎng)3 d～4 d，細胞總數(shù)達108CFU/mL時作為種子備用。取5%已活化好的種子加入裝有100 mL培養(yǎng)液的三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)30 h～36 h。取三角瓶內(nèi)培養(yǎng)的魯氏酵母為微生物發(fā)酵罐批量制備的菌種，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件（經(jīng)實驗室搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化所得）為溫度28℃、500 r/min、pH 5、DO值設(shè)定30%，接種量5%，接種后發(fā)酵罐內(nèi)液體總體積為10 L，連續(xù)培養(yǎng)30 h。每3 h取樣測定細胞干重、培養(yǎng)基殘?zhí)菨舛?、活菌總?shù)監(jiān)測魯氏酵母的生長曲線。

1.3.2 菌體洗滌

將魯氏酵母從菌體發(fā)酵液中分離，采用4500r/min，低溫4℃離心20 min。用2.5%的氯化鈉溶液對分離的菌體洗滌，同時在4 500 r/min，低溫4℃離心20 min條件下，去除上清液，保留菌體。

1.3.3 酵母菌菌落總數(shù)、培養(yǎng)基殘?zhí)呛考凹毎芍販y定方法

菌落總數(shù)測定：GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》；培養(yǎng)基殘?zhí)呛繙y定：3，5-二硝基水楊酸比色法[9]；細胞干重測定：取5 mL菌體發(fā)酵液于離心管中（離心管提前干燥并稱重），8 000 r/min離心10 min，收集菌體將收集到的菌體用去離子水洗滌兩次離心，放入干燥箱中于80℃干燥恒重，稱重并計算細胞干重[10]。

1.3.4 酵母菌存活率的測定

參照文獻[11]的方法計算酵母菌存活率，如公式（1）：

1.3.5 保護劑優(yōu)化試驗

1.3.5.1 保護劑的單因素試驗

利用噴霧干燥法制備魯氏酵母發(fā)酵劑時，對保護劑的選擇要符合國家標準，即能入口使用、又對身體無害。適當?shù)谋Ｗo劑可以減輕和防止噴霧干燥對菌體的損害，盡可能保持菌體原有特性，提高存活率[12]。分別選擇6%、8%、10%、12%、14%的脫脂奶粉作為賦形劑。1%、3%、5%、7%、9%的海藻糖作為內(nèi)源保護劑，1%、1.5%、2%、2.5%、3%的谷氨酸鈉作為抗氧化保護劑（表1）。分別添加到經(jīng)處理的發(fā)酵液中，以魯氏酵母菌的存活率為檢驗指標，進行單因素試驗。

表1 不同保護劑添加量Table 1 Different amount of protective agent added

1.3.5.2 保護劑的正交試驗

根據(jù)單因素試驗對噴霧干燥的保護劑進行優(yōu)化。噴霧干燥的進料溫度115℃，進料流量15%（蠕動泵轉(zhuǎn)速占比），以魯氏酵母菌的存活率為檢驗指標，分別選取海藻糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉進行三因素三水平的正交試驗。表2為噴霧干燥保護劑優(yōu)化試驗因素水平表。

1.3.5.3 驗證性試驗

以正交試驗優(yōu)選的最佳條件進行重復性試驗，比較各試驗組存活率，分析判斷試驗的可重復性。

表2 噴霧干燥保護劑優(yōu)化試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for protective agent formula optimization

1.3.6 噴霧干燥條件單因素試驗

1.3.6.1 噴霧干燥進口溫度試驗

采用進料流量13%（蠕動泵轉(zhuǎn)速占比）、保護劑與菌泥比例為4∶1（g/L）、進料溫度分別選擇110、115、120、125、130℃進行試驗，以酵母菌活率為檢驗指標。

1.3.6.2 噴霧干燥保護劑與菌泥比例試驗

采用進料流量13%（蠕動泵轉(zhuǎn)速占比）、進料溫度120℃，保護劑與菌泥比例分別選擇1∶3、1∶1、4∶1、8∶1、12∶1（g/L）進行試驗，以酵母菌存活率為檢驗指標。

1.3.6.3 噴霧干燥進料流量試驗

采用進料溫度120℃、保護劑與菌泥比例為4∶1（g/L），進料流量分別選擇12%、13%、14%、15%、16%進行試驗，以酵母菌存活率為檢驗指標。

2 結(jié)果與討論

2.1 魯氏酵母培養(yǎng)基殘?zhí)呛?、細胞干重測定

采用20 L微生物發(fā)酵罐制備魯氏酵母發(fā)酵液，經(jīng)實驗室條件優(yōu)化，確定最佳的培養(yǎng)條件。魯氏酵母的生長曲線如圖1所示，發(fā)酵周期30 h。

圖1 魯氏酵母發(fā)酵罐生長曲線Fig.1 Growth curve of Zygosaccharomyces rouxii on fermented

由圖1可知，在發(fā)酵初期3 h～9 h，菌體生長緩慢，在發(fā)酵18 h時進入對數(shù)期，菌體數(shù)量快速增長，細胞干重在27 h時達到最大18 g/L，活菌總數(shù)可達到3.11× 108CFU/mL，此時培養(yǎng)基殘?zhí)呛繛?.991 g/L。發(fā)酵30 h時，由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)幾乎耗盡，酵母菌活力下降，及自身降解，細胞干重下降。故后續(xù)試驗中，為保證存活率，選擇培養(yǎng)27 h時的發(fā)酵液進行噴霧干燥試驗。

2.2 保護劑優(yōu)化的單因素試驗

本研究以魯氏酵母菌的存活率為檢驗指標進行單因素試驗。3種不同保護劑對酵母存活率的影響如圖2所示。

圖2 脫脂奶粉、海藻糖、谷氨酸鈉分別對魯氏酵母菌存活率的影響Fig.2 The effects of skim milk powder，trehalose and sodium glutamate on the survival rate of Zygosaccharomyces rouxii

隨保護劑含量的增加，酵母菌存活率均呈先上升后下降趨勢，當脫脂奶粉、海藻糖、谷氨酸鈉依次添加量為10%、5%、2%時酵母菌對應(yīng)存活率最高，依次為63%、58%、45%。脫脂奶粉中的蛋白質(zhì)能夠提供保護性外模[13]，能為干粉提供較輕的多孔無定型結(jié)構(gòu)且復水性強[14]，Carlise[15]等研究表明，脫脂奶粉作為包裹劑在噴霧干燥過程中對細胞的存活率有較好的效果。由圖中可以看出海藻糖對應(yīng)的存活率略低于脫脂奶粉。海藻糖作為糖類保護劑二糖代表，許多酵母細胞中存在海藻糖并持有特殊的海藻糖載體[16]，并通過水取代作用和玻璃態(tài)機制維持細胞膜的穩(wěn)定性并降低細胞膜磷脂分子的相轉(zhuǎn)變溫度，從而使細胞膜在高溫脫水的過程中不發(fā)生相轉(zhuǎn)變而處于流動態(tài)[17]，是較好的內(nèi)源性保護劑。同時，谷氨酸鈉能與水密切作用使干粉保留了適當?shù)乃?，滿足了微生物維持生命的最低需求[18]，可作為抗氧化劑保護酵母菌在高溫和貯藏過程中不被氧化[19-20]。從圖中能夠看出，單一的保護劑對酵母菌的存活率不能達到理想效果，而復合保護劑的使用，是目前研究的大方向。

2.3 保護劑優(yōu)化正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果及分析見表3。

由表3正交試驗結(jié)果所示：通過直觀分析法可得，在試驗選定的因素水平中RA＞RB＞RC，各因素對試驗結(jié)果影響水平由大到小的排列順序為A＞B＞C，最佳組合方式為A2B2C1，脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%。

表3 正交試驗結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment

2.4 驗證性試驗結(jié)果分析

以進料溫度115℃、進料流量13%（蠕動泵轉(zhuǎn)速占比）、保護劑組合（脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%）為條件進行驗證性試驗，結(jié)果魯氏酵母存活率為78%，高于正交試驗中的9個試驗組。

2.5 噴霧干燥單因素試驗條件結(jié)果與分析

2.5.1 不同進料溫度對魯氏酵母存活率的影響

不同的進料溫度對存活率的影響如圖3所示。

圖3 進料溫度對發(fā)酵劑的影響Fig.3 Influence of inlet temperature on starter

由圖3可知，進料溫度為115℃時魯氏酵母的存活率達到最高，為83%，發(fā)酵劑呈乳白色、粉粒狀，具有一定醬香味產(chǎn)生。當進口溫度達到120℃時，存活率為34%呈現(xiàn)明顯下降趨勢，此時噴霧干燥機出料口處出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象，制得的發(fā)酵劑顏色偏黃，有焦糊氣味產(chǎn)生。故選擇進口溫度為115℃進行試驗。

2.5.2 不同進料流量對發(fā)酵劑存活率的影響

選擇5個不同的流量進樣，對發(fā)酵劑中酵母菌的存活率進行檢測，結(jié)果如圖4所示。

圖4 進料流量對發(fā)酵劑的影響Fig.4 Influence of injective flow on starter

由圖4可知，當進料流量為15%時，存活率達到最高85%。此后隨著進料流量的增大，經(jīng)霧化后的液滴數(shù)量大量增加，不能瞬間進行干燥，導致發(fā)酵劑內(nèi)的活菌數(shù)降低，故選擇進料流量為15%。

2.5.3 保護劑與菌泥對魯氏酵母存活率的影響

通過對噴霧干燥保護劑的優(yōu)化，采用脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%復合保護劑進行試驗。將保護劑與離心的菌泥分別按照1∶3、1∶1、4∶1、8∶1、12∶1（g/L）比例混合，進行噴霧干燥，測得樣品存活率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 保護劑與菌泥比例對發(fā)酵劑的影響Fig.5 Influence of proportion of protectants cells

由圖5可知，當保護劑與菌泥比例1∶1（g/L）時，樣品存活率最高，達到84%。當保護劑與菌泥1∶3（g/L）時含量過低，不能達到保護效果，導致酵母菌在干燥過程中死亡，影響干燥結(jié)果。當保護劑與菌泥12∶1（g/L）時含量過高，粉狀顆粒中的菌體比例變小，存活率呈現(xiàn)平緩下降趨勢。

3 結(jié)論

本文探究了利用噴霧干燥法制備魯氏酵母發(fā)酵劑的最佳條件，魯氏酵母發(fā)酵罐培養(yǎng)最佳時間為27 h，此時細胞活力最強、活菌總數(shù)達到最大3.11×108CFU/g、細胞干重達到最大18 g/L。保護劑優(yōu)化采用三因素三水平的正交試驗，3種添加物的保護效果依次為：脫脂奶粉＞海藻糖＞谷氨酸鈉，最佳配方為：脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%，按照上述條件得到的發(fā)酵劑中活菌存活率為72%。通過單因素試驗確定了噴霧干燥試驗最適條件：進口溫度115℃，進料流量15%（蠕動泵轉(zhuǎn)速占比），保護劑與菌泥比例1∶1（g/L）。通過上述條件得到的發(fā)酵劑中活菌存活率為84%。

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Study on Preparation of Zygosaccharomyces rouxii Fermentation Agent by Spray Drying

ZHOU Ya-nan，WANG Ying-qi，LIU Hong，LIU Wei，QUAN Zhi-gang，WANG Xin-hui，KOU Fang，LI Zhi-jiang*，YANG Hong-zhi*
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

The use of spray drying method can be batch preparation of industrial，large-scale amount of Zygosaccharomyces rouxii，significantly shorten the fermentation cycle，increase revenue.The study was preparation of the suspension of Zygosaccharomyces rouxii on YDP and microbial fermentor.By studying the growth curve of Zygosaccharomyces rouxii yeast at different growth times and residual sugar content and cell dry weight and total number of viable bacteria.The single factor and orthogonal experiments were used to optimize the protective agent and spray drying conditions.Research indicates，culture time 27 h in microbial fermentor，cell dry weight was 18 g/L.The best proportion of protective agent were 10 percent of skim milk powder and five percent of trehalose and 1.5%of sodium glutamate.Determine the best spray drying conditions were 115℃of inlet temperature and 15%of feed flow and 1∶1（g/L）ratio of preservative to bacteria，The survival rate of the starter was 83%or more according to the above conditions.

Zygosaccharomyces rouxii；protection agent optimization；spray drying process

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.025

2017-03-19

黑龍江八一農(nóng)墾大學研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2017-Y53）作者簡介：周亞男（1993—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者：李志江（1977—），男，副教授，博士，研究方向：食品發(fā)酵與釀造；楊宏志（1963—），男，教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。