韓春然，黃赫雁，李煜，戴傳榮，林樅雨，張家成

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

香菇PPO超聲輔助法提取工藝及酶學(xué)特性的研究

韓春然，黃赫雁，李煜，戴傳榮，林樅雨，張家成

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

對(duì)超聲波輔助浸提法提取香菇中多酚氧化酶的工藝進(jìn)行研究，并考察香菇中多酚氧化酶的酶學(xué)特性，并對(duì)3種抑制劑對(duì)多酚氧化酶的抑制效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明：最優(yōu)提取工藝為：磷酸緩沖液中添加的PVPP含量為2.0%，超聲時(shí)間150 s，固液比為3∶5（g/mL）；香菇中多酚氧化酶的最適pH值為6.9，最適溫度為40℃，選取鄰苯二酚為底物時(shí)，其最適濃度為0.3 mol/L，3種抑制劑對(duì)香菇中多酚氧化酶均有抑制作用，抑制效果為抗壞血酸＞檸檬酸＞乳酸，其中抗壞血酸在濃度為2 g/L時(shí)，抑制效果為對(duì)照組的8.42%。

香菇；多酚氧化酶；提??；超聲輔助；酶學(xué)特性；抑制

香菇（Lentinus edodes，Shiitake）屬傘菌目，口蘑科，香菇屬，又名冬菇、香蕈、北菇、花菇，是世界上第二大食用菌。香菇是在木材中生長(zhǎng)的，素有“山珍之王”之稱，它具有高蛋白、低脂肪，適合大多數(shù)人群。香菇菌肉白色，稍厚或厚，細(xì)密，具香味。香菇采收后，在常溫下容易發(fā)生褐變，尤其是受機(jī)械損傷后褐變更加迅速[1]。香菇褐變被視為香菇鮮度下降的主要標(biāo)志。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是導(dǎo)致香菇酶促褐變的主要酶類，引起香菇變黑甚至腐爛，導(dǎo)致品質(zhì)下降。多酚氧化酶催化香菇中的內(nèi)源性多酚物質(zhì)氧化為醌類化合物，使高活性親電子的分子能夠聚合，導(dǎo)致褐色或黑色色素的形成。嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味等[2-3]。為進(jìn)一步研究多酚氧化酶的特性，對(duì)香菇中的多酚氧化酶的提取方法（超聲波輔助浸提法）的提取工藝進(jìn)行了研究，考察了不同pH值、溫度和底物濃度（底物為鄰苯二酚）對(duì)PPO（多酚氧化酶）活性的影響，并對(duì)檸檬酸、抗壞血酸及乳酸3種抑制劑對(duì)多酚氧化酶的抑制效果進(jìn)行探究。為抑制香菇在貯藏及加工過(guò)程中的酶促褐變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：采摘于哈爾濱玉豐菌業(yè)香菇生產(chǎn)基地；磷酸二氫鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）、三氯乙酸（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二酚（教學(xué)試驗(yàn)用）：天津市巴斯夫化工有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）（分析純）：廣東粵美化工有限公司。

1.2 主要儀器

TGL-18C高速冷凍離心機(jī)：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；UV-5200紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；電子天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司；DK-98-11A恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；JY98-111DN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

取新鮮的香菇50 g加pH值為6.9的含2%的PVPP（交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮）[4]的磷酸緩沖液50 mL，勻漿，攪拌，然后在600 W功率的超聲波提取機(jī)上處理一段時(shí)間，靜置40 min，8 000 r/min下離心10 min。取上清液于4℃冰箱保存。

1.3.2 多酚氧化酶活性測(cè)定

取一只試管A加入5 mL pH6.9的磷酸緩沖液，在40℃溫度下水浴10 min，加入40℃預(yù)熱的酶液1 mL，再加入1 mL濃度為20%的三氯乙酸[5-6]溶液使酶失活，然后加入1 mL濃度為0.3 mol/L鄰苯二酚，搖勻，8 000 r/min離心5 min，取上清液，在410 nm處測(cè)定溶液吸光光度值，此為反應(yīng)開始時(shí)的數(shù)值。同時(shí)以緩沖溶液替代酶液做相同處理，作為空白對(duì)照。再另取一只試管B加入5 mL pH6.9的磷酸緩沖液，加入1 mL濃度為0.3 mol/L鄰苯二酚，搖勻，在40℃溫度下水浴10min，加入1mL預(yù)熱的酶液同時(shí)開始計(jì)時(shí)，3min后立即加入1 mL濃度為20%的三氯乙酸溶液，8 000 r/min離心5 min，取上清液，采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定溶液的吸光光度值，此為反應(yīng)終止時(shí)的數(shù)值。同時(shí)以緩沖溶液替代酶液做相同處理，作為空白對(duì)照。

1.3.3 多酚氧化酶酶活計(jì)算

多酚氧化酶活力單位定義為在測(cè)定條件下，每毫升樣品每分鐘引起吸光度值改變0.001，則定義為1個(gè)酶活單位[U/（g·min）]，樣品中的多酚氧化酶的活力按下式方程計(jì)算[7]：

式中：R為多酚氧化酶活性，U/（g·min）；△A為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化；Vt為酶提取液的總體積，mL；W為香菇的鮮重，g；Vs為參加反應(yīng)的酶液體積，mL；T為反應(yīng)時(shí)間，單位min。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVPP的添加量對(duì)香菇中PPO提取效果的影響

取新鮮香菇50 g加pH值為6.9的磷酸緩沖液50 mL，分別加入1%、1.5%、2%、2.5%、3%的PVPP。進(jìn)行勻漿，勻漿均勻后攪拌5 min，靜置30 min，在高速離心機(jī)中8 000 r/min離心10 min。取上清液于水浴鍋中40℃恒溫水浴10 min，分別測(cè)定酶活性。PVPP添加量對(duì)香菇中PPO提取的影響見圖1。

圖1 PVPP添加量對(duì)香菇中PPO提取的影響Fig.1 Effect of PPVP on the PPO extraction of mushroom

由圖1可以看出酶活性在PVPP為1%～3%間先升高后降低，PVPP對(duì)溶液中多酚有吸附作用，可以排除酚類雜質(zhì)對(duì)溶解率的干擾，使多酚氧化酶更充分地溶解在緩沖溶液中，在PVPP含量為2.5%時(shí)酶活性最高。

2.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)香菇中PPO提取結(jié)果分析

取新鮮香菇50 g加pH值為6.9的含2.5%PVPP的磷酸緩沖液50mL，進(jìn)行勻漿，勻漿均勻后攪拌5min，在600 W功率的超聲波細(xì)胞破碎儀上，分別進(jìn)行60、90、120、150、180 s處理，靜置30 min后，在高速離心機(jī)中8 000 r/min離心10 min。取上清液于水浴鍋中40℃恒溫水浴10 min，分別測(cè)定酶活性。超聲時(shí)間對(duì)香菇中PPO提取的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)香菇中PPO提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the PPO extraction of mushroom

由圖2可以看出，酶活性隨著超聲波處理時(shí)間的增加先升高然后降低，在150 s時(shí)酶活性最高，分析原因主要是隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，氣泡的形成及高頻振蕩越強(qiáng)烈，吸收的聲能越大，破壁效果越好，能夠增加酶溶解的量。但不是超聲的時(shí)間越長(zhǎng)，酶濃度越高，處理時(shí)間太長(zhǎng)，由于強(qiáng)烈的沖擊和熱效應(yīng)的影響使得提取物被破壞，尤其是酶類，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使得酶的活性降低[8]。

2.3 固液比對(duì)香菇中PPO提取結(jié)果分析

取新鮮香菇進(jìn)行勻漿，勻漿均勻后攪拌5 min，配制不同固液比為1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5（g/mL）的提取液，在600 W功率的超聲波細(xì)胞破碎儀上，進(jìn)行150 s處理，進(jìn)行超聲波處理，攪拌，離心，萃取上清液，測(cè)定酶活性。固液比對(duì)香菇中PPO提取的影響見圖3。

圖3 固液比對(duì)香菇中PPO提取的影響Fig.3 Effect of the solid liquid ratio on the PPO extraction of mushroom

由圖3可以看出酶活性隨著固液比變化先升高再降低，在固液比3∶5（g/mL）時(shí)酶活性最高，分析其原因?yàn)殡S著固液比增大，細(xì)胞內(nèi)與溶劑之間濃度梯度增大，促進(jìn)多酚氧化酶提取，但當(dāng)固液比過(guò)高，會(huì)發(fā)現(xiàn)溶液變黏稠，則原料顆粒被破碎的機(jī)會(huì)越小，影響超聲效果，不利于酶的溶出，酶活性降低[9]。

2.4 提取法正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，選取吸附劑PVPP添加量、超聲波處理時(shí)間、固液比3個(gè)主要因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。其中吸附劑PVPP選擇2.0%、2.5%、3.0%組添加量，超聲時(shí)間選擇180、240、300 s，固液比選擇2∶5、3∶5、4∶5（g/mL）3組作為正交試驗(yàn)水平；由最優(yōu)組合基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)提取工藝，對(duì)以后研究香菇中PPO的酶學(xué)特性提供基礎(chǔ)。根據(jù)表1進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最優(yōu)提取工藝。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果分析表見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Table 1 Orthogonal test factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表Table 2 Orthogonal test results

由表2可以得出，正交試驗(yàn)因素主次順序?yàn)锳＞B＞C，即PVPP含量＞超聲時(shí)間＞固液比，最優(yōu)提取工藝為A1B2C2，即PVPP含量為2.0%，超聲時(shí)間為150 s，固液比為3∶5（g/mL）。

2.4 pH值對(duì)多酚氧化酶活性的影響

按照1.3.2方法測(cè)定香菇中多酚氧化酶活性，取磷酸鹽緩沖液pH值分別為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，以不加酶溶液的反應(yīng)體系溶液為參比液，測(cè)定酶活性。pH值對(duì)多酚氧化酶活性的影響見圖4。

圖4 pH值對(duì)多酚氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on the determination of PPO activity

從圖4可以看出，香菇PPO活性受pH值的影響，隨著pH值的增加，酶活性逐漸增加，pH值為7.0時(shí)活性最高。當(dāng)pH值增加，PPO活性下降，原因?yàn)镻PO是銅氧化酶，pH值過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致銅離子的解離和蛋白質(zhì)的變性[10]，使酶失去活性。

2.5 溫度對(duì)多酚氧化酶活性的影響

測(cè)定多酚氧化酶活性時(shí)，設(shè)置水浴溫度分別為20、30、40、50、60℃，冷卻后測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活性。溫度對(duì)多酚氧化酶活性的影響見圖5。

圖5 溫度對(duì)多酚氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the determination of PPO activity

由圖5可知，隨著溫度的升高，溶液中分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，使得底物與酶接觸的幾率增高，酶活性增大；隨著溫度的繼續(xù)升高，酶蛋白受熱變性，酶活性降低，最適溫度的大小是這兩種作用相平衡的結(jié)果[11]。本試驗(yàn)中考慮最適溫度為40℃。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雙孢菇[12]、秀珍菇[13]、雞腿蘑[14]、草菇[15]的最適溫度分別為20、35、45、35℃。因此可以看出，PPO的最適溫度與原料的來(lái)源及底物的種類有關(guān)。

2.6 底物濃度對(duì)多酚氧化酶活性的影響

設(shè)定鄰苯二酚濃度分別為 0.1、0.2、0.25、0.3、0.4 mol/L。為了進(jìn)一步研究底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響，計(jì)算該酶的Km（米氏常數(shù)）值和該酶促反應(yīng)的Vmax（最大速度）值。以單位時(shí)間內(nèi)單位體積的產(chǎn)物生成量來(lái)表示該酶促反應(yīng)的速度，將酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）對(duì)底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）作圖，即可得到一條直線，該直線在Y軸上的截距即為1/Vmax，在X軸上的截距即為1/Km的絕對(duì)值。底物濃度對(duì)多酚氧化酶活性的影響見圖6，以鄰苯二酚為底物時(shí)Lineweaver-Burk曲線見圖7。

圖6 底物濃度對(duì)多酚氧化酶活性的影響Fig.6 Effect of the substrate concentration on the determination of PPO activity

圖7 以鄰苯二酚為底物時(shí)Lineweaver-Burk曲線Fig.7 The Lineweaver-Burk curve with substrate of catechol

由圖7可知，Vmax=1/0.622 8=1.605 7 min/A410，Km= 1/0.558 3=1.791 2 mol/L。擬合直線為y=0.513 7x+ 1.049 7，相關(guān)系數(shù)r=0.975 7，表明香菇中PPO對(duì)鄰苯二酚有很好的親和力。酶催化反應(yīng)的初始階段與鄰苯二酚底物濃度成正比。結(jié)合圖6可得，選取底物濃度為0.3 mol/L的用量較為適宜。

2.7 抑制劑對(duì)多酚氧化酶活性的影響

以0.3 mol/L的鄰苯二酚為底物，pH值為6.9的磷酸鹽作為緩沖溶液，在最適溫度條件下，以下列物質(zhì)作為抑制劑：檸檬酸（0、1、2、3、4、5 g/L），VC（0、1、2、3、4、5 g/L），乳酸（0、1、2、3、4、5 g/L）。在410 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活力。抑制劑濃度對(duì)PPO活力的影響見圖8。

由圖8可知，檸檬酸、抗壞血酸、乳酸均能抑制多酚氧化酶活性，其抑制效果為抗壞血酸＞檸檬酸＞乳酸。檸檬酸使酶反應(yīng)體系的pH值發(fā)生改變以及它與銅輔基絡(luò)合使得檸檬酸對(duì)PPO有抑制效果。隨著檸檬酸量的增大，pH值降低，逐漸不適宜PPO所需的條件，并且檸檬酸對(duì)PPO的活性中心的銅離子具有較強(qiáng)的螯合作用，故吸光度迅速降低[16]。選擇濃度為3 g/L的檸檬酸對(duì)PPO進(jìn)行抑制，此時(shí)PPO的活性僅為對(duì)照的25.77%。

圖8 抑制劑濃度對(duì)PPO活力的影響Fig.8 Effect of inhibitors on the determination of PPO activity

抗壞血酸作為一種有機(jī)酸有很好的防褐變效果，VC具有還原性，對(duì)PPO活性起到一定抑制效果。其抑制機(jī)理是它與中間產(chǎn)物鄰苯二醌作用生成鄰二酸和脫氫抗壞血酸，防止了中間產(chǎn)物進(jìn)一步聚合成黑色素。在實(shí)際生產(chǎn)中抗壞血酸是較為理想的PPO抑制劑，它既具有較好的抑制效果，又是食品中固有的營(yíng)養(yǎng)成分，安全性高。但是抗壞血酸本身易于被氧化，所以要使其能保持一定的抑制效果就要保持其含量的穩(wěn)定[17]。本試驗(yàn)中選擇濃度為2 g/L的VC抑制多酚氧化酶，其活性僅為對(duì)照的8.42%。

乳酸作為一種抗褐變的有機(jī)酸常被用于食品工業(yè)中。PPO的相對(duì)酶活性隨著乳酸處理濃度的增大而減?。黄湓?yàn)椴煌瑵舛热樗崽幚鞵PO可能引起PPO三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致PPO活性的降低[18]。本試驗(yàn)中選擇濃度3 g/L的乳酸對(duì)多酚氧化酶進(jìn)行抑制，其活性為對(duì)照的34.0%。

3 結(jié)論

超聲波輔助浸提法提取香菇中多酚氧化酶的最佳工藝為：選取磷酸緩沖液，添加含量為2.0%的吸附劑PVPP，超聲時(shí)間150 s，固液比為3∶5（g/mL）；香菇中多酚氧化酶的最適pH值為6.9，最適溫度為40℃，選取鄰苯二酚為底物時(shí)，其最適濃度為0.3 mol/L，檸檬酸、抗壞血酸、乳酸對(duì)香菇中多酚氧化酶均有抑制作用，抑制效果為抗壞血酸＞檸檬酸＞乳酸，其中抗壞血酸在濃度為2 g/L時(shí)，抑制效果可達(dá)到對(duì)照組的8.42%。

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The Research on Ultrasonic-Assisted Extraction and Enzyme Properties of PPO in Lentinus edodes

HAN Chun-ran，HUANG He-yan，LI Yu，DAI Chuan-rong，LIN Zong-yu，ZHANG Jia-cheng
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，Heilongjiang，China）

This paper studied the ultrasonic-assisted extraction of mushroom，examined the enzymatic properties of polyphenol oxidase in mushroom，and compared the polyphenol oxidase inhibiting effect of three inhibitors.Results showed that PVPP content was 2.0%，ultrasonic time 150 s，the solid liquid ratio 3∶5（g/mL）；The optimal conditions of polyphenol oxidase activities in mushroom were pH 6.9，temperature 40℃，the concentration 0.3 mol/L with the substrate of catechol.Three inhibitors had inhibition in polyphenol oxidase in mushroom.The inhibiting effect was VC＞citric acid＞lactic acid.In the concentration of 2 g/L，the inhibiting effect of VCwas 8.42%in the control group.

Lentinus edodes；polyphenol oxidase；extraction；ultrasound-assisted；enzymatic characteristics；inhibitor

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.010

2016-09-21

韓春然（1970—），女（漢），教授，博士，研究方向：果蔬貯藏與加工。