謝晶+張麗+曾金祥+李敏+王娟+謝雄雄+鐘國(guó)躍+羅光明+袁金斌+梁健

[摘要] 采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)快速分析鑒別短管兔耳草的化學(xué)成分，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)，試驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS儀器，YMC-Triart C₁₈色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫；質(zhì)譜采用電噴霧（ESI）離子源，在負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，通過(guò)保留時(shí)間、精確分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片，并結(jié)合參考文獻(xiàn)，對(duì)短管兔耳草成分進(jìn)行鑒定，該實(shí)驗(yàn)共鑒別出22個(gè)化合物，其中黃酮類化合物11個(gè)，苯乙醇苷類化合物6個(gè)，環(huán)烯醚萜類化合物1個(gè)，有機(jī)酸類化合物4個(gè)。UPLC-Q-TOF-MS/MS方法能快速鑒別短管兔耳草中的各類化學(xué)成分，方法簡(jiǎn)單，快速，可為短管兔耳草的臨床應(yīng)用提供物質(zhì)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 短管兔耳草；UPLC-Q-TOF-MS/MS；化學(xué)成分；快速鑒別

[Abstract] The chemical constituents of Lagotis brevituba were rapidly determined and analyzed by using ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS/MS） method，providing material basis for the clinical application of L. brevituba. The separation was performed on UPLC YMC-Triart C₁₈ （2.1 mm×100 mm，1.9 μm） column，with acetonitrile-water containing 0.2% formic acid as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.4 mL·min^-1 gradient elution and column temperature was 40 ℃，the injection volume was 2 μL. ESI ion source was used to ensure the data collected in a negative ion mode. The chemical components of L. brevituba were identified through retention time，exact relative molecular mass，cleavage fragments of MS/MS and reported data. The results showed that a total of 22 compounds were identified，including 11 flavones，6 phenylethanoid glycosides，1 iridoid glucosides，and 4 organic acid. The UPLC-Q-TOF-MS/MS method could fast identify the chemical components of L. brevituba，providing valuable information about L. brevituba for its clinical application.

[Key words] Lagotis brevituba；UPLC-Q-TOF-MS/MS；chemical constituents；fast identification

藏藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，生長(zhǎng)環(huán)境獨(dú)特藥用效能高，尤其對(duì)某些特殊疑難病癥如風(fēng)濕病、心血管病、胃病等方面顯示出其他藥物無(wú)可替代的作用[1]。這些特性說(shuō)明藏藥具有非常重要的開發(fā)價(jià)值。如何快速鑒別藏藥化學(xué)成分，為藥效活性提供參考依據(jù)是當(dāng)前藏藥進(jìn)一步現(xiàn)代化開發(fā)與應(yīng)用亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

短管兔耳草系玄參科兔耳草屬植物L(fēng)agotis brevituba Maxim的干燥全草，是著名藏藥“洪連”的主要基原植物，也是2015年版《中國(guó)藥典》收載僅有的9種藏藥材之一。其應(yīng)用歷史悠久，在著名藏醫(yī)古籍《月王藥診》、《四部醫(yī)典》及《晶珠本草》中均有記載，并被《四部醫(yī)典》列為藏草藥之首，具有極高的藥用價(jià)值。藏醫(yī)學(xué)在臨床上用于治療腎炎、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化癥、全身發(fā)燒、肺病、濕熱瀉痢、陰道流黃黑色液物、綜合性毒性中毒及“心熱”等多種疾病。前期研究表明短管兔耳草具有抗炎[2]、抗癌[3]、抗阿爾茨海默病[4]、降尿酸[5]、抗肝損傷[6]等多種作用。這表明藏藥短管兔耳草具有很好的開發(fā)與應(yīng)用前景。物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明是藥物現(xiàn)代化開發(fā)的先決條件，因此如何快速闡明短管兔耳草化學(xué)成分，為臨床藥效提供物質(zhì)依據(jù)，已成為其現(xiàn)代化開發(fā)的決定性因素。

目前短管兔耳草化學(xué)成分研究多采用傳統(tǒng)分離純化方法[7-8]。這些方法費(fèi)時(shí)耗力，難以滿足短管兔耳草化學(xué)成分快速鑒別的需要。近年來(lái)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)集超高效液相色譜的快速高效分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性于一體，在中藥領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛，已成為分離鑒定各種化合物的重要手段[9-10]。因此，本實(shí)驗(yàn)以藏藥短管兔耳草為研究對(duì)象，應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)對(duì)其甲醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行研究，根據(jù)其準(zhǔn)分子離子以及二級(jí)碎片離子、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)等鑒定短管兔耳草的化學(xué)成分，以為短管兔耳草臨床應(yīng)用及現(xiàn)代化開發(fā)提供支撐。

1 材料

島津LC-30A超高效液相色譜儀，PDA紫外檢測(cè)器；YMC-Triart C₁₈色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.9 μm）；Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀，配備 ESI 離子源及 Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)AB Sciex公司）；KQ-5200DB型超聲清洗機(jī)（昆山市超聲波儀器公司）；AL204 型電子分析天平[Mettler Toledo 儀器（上海）有限公司]；Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)（德國(guó)默克密理博公司）；BUCHI電動(dòng)旋蒸蒸發(fā)儀（瑞士步琪公司）。

大車前苷對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)MUST-16041508）、 金絲桃苷對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)MUST-16032113）、木犀草素對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)MUST-16011015）均購(gòu)自成都曼思特生物科技公司；毛蕊花糖苷（純度≥97%，實(shí)驗(yàn)室自制）；松果菊苷（純度≥98%，批號(hào)P23N7F25444）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。乙腈（色譜純，美國(guó)anaour公司），甲酸[色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司]，其余試劑為分析純。短管兔耳草購(gòu)于成都荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)鐘國(guó)躍教授鑒定為短管兔耳草L.brevituba的干燥全草。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

短管兔耳草全草粉碎，稱取2.0 g，于錐形瓶中加入50 mL 75%甲醇超聲提取30 min，重復(fù)3次。抽濾，旋干，用75%甲醇定容至25 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，供UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取對(duì)照品金絲桃苷2.18 mg、大車前苷2.33 mg、木犀草素2.24 mg、松果菊苷2.07 mg、毛蕊花糖苷2.45 mg分別置于5 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并稀釋至刻度，分析前過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.3 LC-MS 條件

2.3.1 色譜條件 YMC-Triart C₁₈分析色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～5 min，5%～15% B；5～14 min，15%～16% B；14～28 min，16%～22% B；28～33 min，22%～95% B；流速0.4 mL·min^-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI），負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 200；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度550 ℃；氣簾氣30 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣50 psi；去簇電壓（DP）-100 V；采用AB analyst TF軟件采集數(shù)據(jù)，TOF-MS一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描TOF-MS/MS離子累積時(shí)間分別為250，150 ms，碰撞能量CE 40 eV，CES碰撞能量疊加為（40±10） eV。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用AB Sciex公司Peakview 1.6數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)UPLC-Q-TOF-MS/MS采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1 短管兔耳草中化學(xué)成分確認(rèn)

按照1.4.2項(xiàng)下方法對(duì)75%甲醇提取短管兔耳草藥材成分進(jìn)行定性分析，（-） ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖（TIC）見圖1。應(yīng)用Peak View 1.6軟件分析其中各化學(xué)成分的保留時(shí)間及其質(zhì)譜信息，并結(jié)合其分子離子峰與對(duì)照品、文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，再對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行辨別，從而鑒定出短管兔耳草提取物中22個(gè)化合物，鑒定結(jié)果見表1。由于黃酮化合物在質(zhì)譜中有相似的規(guī)律，其具有相同的母核，本次實(shí)驗(yàn)選擇了具有代表性的化合物7，13，19，21詳細(xì)分析其裂解過(guò)程，苯丙素類選擇化合物9，10，15分析其裂解過(guò)程，有機(jī)酸類化合物選擇化合物20分析其裂解過(guò)程。

3.2 黃酮苷元裂解規(guī)律以及其二級(jí)碎片離子

化合物7分子組成 C₂₁H₂₀O₁₂，母離子為m/z 463.100 8[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為464。其脫去1分子吡喃半乳糖基得到m/z 301.012 4的碎片離子峰。繼而脫去1分子CHO產(chǎn)生m/z 272.030 8，再脫去1個(gè)OH得到m/z 255.029 7的碎片離子峰，最后脫去1分子CO得到m/z 227.033 2的碎片離子峰[16]。與對(duì)照品金絲桃苷比較，發(fā)現(xiàn)其液相出峰時(shí)間與其相同，從而證明化合物7為金絲桃苷。

化合物13分子組成C₂₈H₂₈O₁₈，母離子為m/z 651.131 2[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為652。二級(jí)碎片離子m/z 351.060 8顯示雙葡萄糖醛酸片段，母離子失去1個(gè)雙葡萄糖醛酸片段得到m/z 299.057 9的碎片離子峰。其碎片離子峰推斷為香葉木素苷元。苷元發(fā)生裂解失去1個(gè)CH₃得到m/z 284.035 7碎片離子。香葉木素苷元同時(shí)發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生m/z 193.036 4和m/z 131.035 8黃酮特征碎片離子。根據(jù)文獻(xiàn)[15]，推測(cè)化合物13為香葉木素-7-O-雙葡萄糖醛酸苷。其裂解見圖2。

化合物19分子組成 C₁₅H₁₀O₆，母離子為m/z 285.042 7[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為286。二級(jí)碎片離子峰m/z 257.044 0為分子失去1分子CO，繼續(xù)失去1分子CO產(chǎn)生m/z 229.052 0的碎片離子峰。同時(shí)母核發(fā)生RDA裂解分別產(chǎn)生m/z 150.999 3，133.058 2 的碎片離子，這2個(gè)碎片離子都是黃酮環(huán)裂解的特征離子，可以推斷其為黃酮類化合物。其中m/z 133.025 4 的碎片離子為B環(huán)和C環(huán)中的殘基組成的，所以其豐度遠(yuǎn)大于m/z 150.999 3的豐度[25-26]。之后又與對(duì)照品木犀草素進(jìn)行比對(duì)，化合物19出峰時(shí)間與對(duì)照品相同，質(zhì)譜裂解規(guī)律一致。從而確認(rèn)化合物19為木犀草素。具體裂解過(guò)程見圖3。

化合物21分子組成C₁₆H₁₂O₅，母離子m/z 283.059 6[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為284。其裂解脫去甲基產(chǎn)生m/z 268.038 2的碎片離子峰，為基峰。該基峰離子繼續(xù)發(fā)生裂解，脫去1分子CO生成m/z 240.042 0的碎片離子峰，繼而丟失1個(gè)CHO產(chǎn)生m/z 211.038 2碎片離子峰。同時(shí)此化合物發(fā)生了RDA反應(yīng)，產(chǎn)生m/z 151.000 3的黃酮特征碎片離子峰。根據(jù)文獻(xiàn)[20]，推測(cè)化合物21為刺槐素。裂解方式見圖4。

3.3 苯丙素類化合物裂解規(guī)律以及其二級(jí)碎片離子

化合物9的分子組成為C₂₉H₃₆O₁₆，母離子m/z 639.218 7[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為640。二級(jí)碎片離子m/z 477.139 4推測(cè)為失去了1分子葡萄糖基或者是咖啡?；筮M(jìn)行下一步裂解，產(chǎn)生m/z 315.112 5，表明化合物繼續(xù)脫去1分子葡萄糖基或者咖啡酰基。m/z 297.101 2為m/z 477.139 4碎片離子脫去1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為180的中性碎片，其可能是咖啡?；蛘呤嵌嘶继腔瑫r(shí)失去了1分子的H₂O。而m/z 179.033 3又是m/z 297.101 2的互補(bǔ)離子。m/z 160.999 2則可能為剩下的咖啡?；蛘呤瞧咸烟菤埢摎潆x子。根據(jù)文獻(xiàn)[17]，進(jìn)行對(duì)比初步判斷這個(gè)化合物為大車前苷，之后又與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，其出峰時(shí)間與大車前苷對(duì)照品相同，質(zhì)譜裂解規(guī)律一致。最終確認(rèn)化合物9為大車前苷。其裂解方式見圖5。

化合物15分子組成為C₂₉H₃₆O₁₅，母離子為m/z 623.209 8[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為624。質(zhì)譜圖中出現(xiàn)m/z 477.168 3碎片離子，可能為母離子失去末端的咖啡酞基或葡萄糖基產(chǎn)生的，但是丟失葡萄糖基需要斷裂2個(gè)糖苷鍵，證實(shí)m/z 477.168 3為斷裂末端咖啡酰基的可能性比較大。化合物繼續(xù)發(fā)生裂解失去146，推測(cè)化合物繼續(xù)失去1分子鼠李糖基。m/z 315.1188與m/z 135.0422相差180，說(shuō)明該化合物丟失1個(gè)葡萄糖基。其中m/z 135，161為咖啡酰基苯乙醇苷的特征離子峰，其中m/z 161離子為強(qiáng)峰。根據(jù)文獻(xiàn)[21]，可以推測(cè)它是毛蕊花糖苷。之后又與對(duì)照品相比較，其出峰時(shí)間與對(duì)照品出峰時(shí)間相同，質(zhì)譜裂解途徑一致，說(shuō)明推斷正確。毛蕊花糖苷裂解方式見圖6。

化合物10分子組成為C₃₅H₄₆O₂₀，離子峰為m/z 785.287 5[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為786。二級(jí)碎片離子m/z 623.243 2為準(zhǔn)分子離子丟失1個(gè)葡萄糖基（C₆H₁₀O₅）產(chǎn)生的產(chǎn)物離子。之后繼續(xù)丟失1分子咖啡酰基產(chǎn)生了m/z 461.178 4碎片離子。碎片m/z 623，461是松果菊苷的特征碎片離子。根據(jù)文獻(xiàn)[18]，可以初步確定化合物10為松果菊苷，之后與對(duì)照品相比對(duì)發(fā)現(xiàn)其出峰時(shí)間與對(duì)照品相匹配，質(zhì)譜裂解途徑一致，說(shuō)明推斷正確。

3.4 環(huán)烯醚萜類化合物裂解規(guī)律以及其二級(jí)碎片離子

化合物18分子組成為C₂₄H₂₈O₁₁，母離子為m/z 491.163 1[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為492。二級(jí)碎片離子峰m/z 315.109 3表明分子脫掉相對(duì)分子質(zhì)量為176的肉桂酸基和1分子CO所產(chǎn)生的。m/z 175.040 2為脫去肉桂酸基，其后繼續(xù)脫去1分子CO產(chǎn)生m/z 161.024 4的碎片離子，表示大基團(tuán)發(fā)生碎片裂解之后產(chǎn)生了1分子脫氧葡萄糖基。根據(jù)文獻(xiàn)[24]，可以推測(cè)化合物18為球花苦苷。其裂解過(guò)程見圖7。

3.5 有機(jī)酸類物質(zhì)裂解規(guī)律及其二級(jí)碎片離子

化合物20分子組成為C₁₈H₃₄0₅，母離子為m/z329.237 4[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量為330。碎片離子峰m/z 229.147 0為失去了1個(gè)C₆H₁₂O片段，隨之繼續(xù)失去了1分子H₂O生成m/z 211.136 3的碎片離子峰。之后分子脫去1個(gè)C₃H₄片段產(chǎn)生了m/z 171.104 6的碎片離子峰，再進(jìn)行裂解丟失1分子CO₂產(chǎn)生m/z 127.113 5的碎片離子峰。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)[20]比對(duì)，化合物20可能為9，12，13-三羥基-10-十八碳烯酸或者是9，10，11-三羥基-12-十八碳烯酸，見圖8。

4 討論

短管兔耳草是重要的藏藥材，具有多種藥理活性，但其物質(zhì)基礎(chǔ)尚缺少研究。傳統(tǒng)先提取分離純化中藥提取物，得到化合物單體之后再進(jìn)行核磁共振波譜鑒定結(jié)構(gòu)的成分分析方法操作復(fù)雜，工作量大。UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)結(jié)合了超高效液相色譜的快速高分離能力和高分辨質(zhì)譜的高靈敏度和高精確度，避免了傳統(tǒng)成分分離分析方法的不足，不僅可快速對(duì)中藥復(fù)雜成分進(jìn)行定性分析，還具有操作簡(jiǎn)單、信息量大、節(jié)省溶劑的特點(diǎn)，因而在中草藥成分研究中日益廣泛[29]。

本試驗(yàn)應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析了短管兔耳草甲醇提取物成分的質(zhì)譜信息，快速成功鑒別了22個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)其中含有黃酮、苯乙醇苷、環(huán)烯醚萜、有機(jī)酸及萜等類多種成分。這些不同的成分具有不同的藥效，如黃酮類化合物金絲桃苷具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛等活性[30]，木犀草素是抗腫瘤的啟動(dòng)因子，對(duì)直結(jié)腸癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、人乳腺癌等細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，能增敏多種致凋亡因子，具有多靶點(diǎn)抗腫瘤的潛力[31]，木犀草素-7-O-葡萄糖苷能夠保護(hù)心肌肉細(xì)胞[32]，苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷具有抗高血壓活性及XOD抑制活性等[33]，松果菊苷可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)線粒體功能及細(xì)胞凋亡、抗腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)血管性癡呆鼠腦中膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)水平等途徑發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[34]，原兒茶酸具有抑菌抗炎，有抑制細(xì)胞凋亡等多種藥理作用[35]，這些成分為短管兔耳草抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、抗阿爾茨默癥等臨床應(yīng)用提供了較好的物質(zhì)依據(jù)。這表明本試驗(yàn)推斷出的化合物，在一定程度上闡明了短管兔耳草的藥效物質(zhì)，為短管兔耳草的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供了初步物質(zhì)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]