馬小軍+莫長明

[摘要] 分子輔助育種、轉基因育種和分子設計育種是植物分子育種學三大發(fā)展方向。該文就此3個育種方向的遺傳連鎖作圖、QTL定位作圖、關聯(lián)分析作圖、分子輔助選擇、花粉管通道介導轉化、農(nóng)桿菌介導轉化、基因槍介導轉化、基因編輯技術、全基因組測序、轉錄組測序、蛋白組測序和品種分子設計等研究領域的發(fā)展現(xiàn)狀和新趨勢進行概述，并結合藥用植物分子育種目標和存在問題的探討，展望了此3種分子育種技術在藥用植物分子育種中的應用前景。

[關鍵詞] 藥用植物育種；分子輔助育種；轉基因育種；分子設計育種

[Abstract] The molecular-assisted breeding，transgenic breeding and molecular designing breeding are three development directions of plant molecular breeding. Base on these three development directions，this paper summarizes developing status and new tendency of research field of genetic linkage mapping，QTL mapping，association mapping，molecular-assisted selections，pollen-mediated transformations，agrobacterium-mediated transformations，particle gun-mediated transformations，genome editing technologies，whole-genome sequencing，transcriptome sequencing，proteome sequencing and varietal molecular designing. The objective and existing problem of medical plant molecular breeding were discussed the prospect of these three molecular breeding technologies application on medical plant molecular breeding was outlooked.

[Key words] medical plant breeding；molecular-assisted breeding；transgenic breeding；molecular designing breeding

分子育種是分子生藥學的一個重要內(nèi)容。所謂分子育種就是將分子生物學技術應用于育種中，在分子水平上進行育種，它是常規(guī)育種的一個新發(fā)展。常規(guī)育種注重表型選擇，而分子育種強調(diào)基因型選擇。分子育種離不開常規(guī)育種，它也同樣以優(yōu)異表型為育種目標，并建立起基因型和表現(xiàn)型之間的聯(lián)系，通過基因型來選擇表現(xiàn)型。藥用植物育種是改善藥材品質(zhì)的重要途徑。近20年來，人們通過系統(tǒng)選育、雜交育種、多倍體育種等常規(guī)育種方法，已培育出了人參、西洋參、地黃、丹參、羅漢果、松藍、柴胡、桔梗、枸杞、厚樸等許多中藥材新品種。但是，由于藥用植物種類多、生長周期長、雜合度高、育種目標特殊等原因，使得藥用植物育種的總體水平較低，育種效率不高。分子育種具有快速、高效、準確等特點，是未來藥用植物育種學的發(fā)展方向。為此，本文對分子育種學的3個主要研究方向——分子輔助育種、轉基因育種和分子設計育種的基本概念和技術進行簡要敘述，同時探討藥用植物分子育種存在的問題并展望其應用前景，以期引起同行關注，促使更多的科技工作者投入到藥用植物分子育種工作中來。

1 分子輔助育種

分子輔助育種是分子育種研究和應用最多的一個方向。分子輔助育種的原理是把與待研究的表現(xiàn)型刻劃在DNA遺傳圖譜上，通過DNA檢測就可以快速、簡便地進行選擇。開展分子輔助育種通常包含遺傳圖譜構建、數(shù)量性狀位點（QTL）定位、性狀關聯(lián)分析和優(yōu)良種質(zhì)篩選4個相互聯(lián)系又有一定獨立性的研究內(nèi)容。

1.1 遺傳連鎖作圖 遺傳連鎖圖譜構建包括3步：①選擇建立適宜的遺傳作圖群體；②選擇合適類型的遺傳標記，篩選多態(tài)性標記，檢測遺傳作圖群體個體或家系基因型；③確立遺傳標記連鎖群、排列順序和距離并繪制圖譜[1]。選擇合適的遺傳作圖群體是成功、高效構建完整、高密度遺傳圖譜及定位QTL的關鍵。植物用于遺傳作圖群體按遺傳穩(wěn)定性可分為F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，BC1，三交等暫時性分離群體和RIL，DH，IF2等永久性分離群體。每類作圖群體各有優(yōu)缺點[2]，會影響遺傳連鎖作圖效率和精度。這些群體都已被廣泛用于自花授粉植物的遺傳連鎖作圖。然而，自交不親和、近交退化、生長周期長的異花授粉植物，較難獲取純合株系，通常以雜交F1[3]，F(xiàn)2和回交群體作為遺傳作圖群體[4]，并結合擬測交策略[5]構建遺傳連鎖圖譜。因此，遺傳連鎖作圖時應結合具體情況選擇不同類型的分離群體。遺傳連鎖圖譜的分辨率和精度，很大程度還取決于群體的大小。群體越大精度越高，但工作量與費用大大增加。遺傳連鎖框架圖譜構建可采用大群體中的隨機小群體（150個單株或家系），需要精細定位某一連鎖區(qū)域時，通常擴大到1 000個以上單株的群體。

遺傳連鎖作圖主要分子標記有RFLP，SSR，RAPD，ISSR，AFLP，SNP，SRAP等。每種分子標記各有優(yōu)缺點，例如SSR具有多態(tài)性豐富、覆蓋整個基因組、共顯性、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，但引物開發(fā)需要已知序列、成本高[6]；RAPD需要DNA量少、多態(tài)性高于RFLP、實驗操作簡單，但不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型、結果重復性差、不適合品種水平分析[7]；SRAP具有簡單、可靠、通量較高、編碼區(qū)片段比例較高、共顯性等特點，能很好定位基因組中開放閱讀框[8]；AFLP可靠、高效，但為顯性標記、引物需要標記、技術與設備要求高、標記分布不均勻[9]。SNP在基因組中分布較SSR標記廣泛，共顯性或顯性、穩(wěn)定性高、基因內(nèi)部SNP可能直接影響表型、易于自動化[10]。遺傳連鎖作圖時，應針對特定物種，根據(jù)具體情況，從標記多態(tài)性、顯性、穩(wěn)定性和實驗操作難易度、費用比等多方面綜合考慮。

遺傳連鎖作圖包括遺傳標記分離、連鎖關系、排序分析和遺傳距離估算等步驟，開發(fā)有MAPMAKER/EXP[11]，Joinmap[12]，CarthaGene[13]等多種作圖軟件。這些軟件在數(shù)據(jù)準備難易、可視化程度和功能等方面存在較大不同。其中，廣泛使用的有MAPMAKER/EXP 3.0，Joinmap 4.0等軟件。MAPMAKER/EXP 3.0適用于BC1，F(xiàn)2，RIL等群體遺傳連鎖圖譜構建及復合性狀基因定位。Joinmap 4.0適用于BC1，F(xiàn)2，RIL，DH等群體遺傳連鎖圖譜構建及整合。

遺傳連鎖圖譜還難于直接在育種中發(fā)揮作用，主要用于QTL定位、基因克隆、性狀遺傳分析和基因組比較研究，其飽和度直接影響到QTL定位精確性。因此，構建高密度遺傳連鎖圖譜對QTL定位十分必要。遺傳連鎖圖譜上標記平均間隔，連鎖框架圖譜要求不大于20 cM；主效基因定位要求在10～20 cM或更小；QTL定位要求在10 cM以下；基因克隆要求目標區(qū)域在1 cM以下[14]?，F(xiàn)有遺傳連鎖圖譜多數(shù)是由不同群體、標記、研究者、實驗條件下所構建的，飽和度不夠高。多標記多群體作圖增加標記位點和圖譜整合是增加遺傳連鎖圖譜飽和度的有效途徑。在具備共有標記可用條件下，可直接采用“錨定標記策略”，將不同遺傳連鎖圖譜整合成一張公共圖譜、一致性圖譜。這不僅可以增加圖譜的飽和度，還可以擴展圖譜的應用范圍。在無共有標記可用條件下，可先用以往的作圖群體開發(fā)共有分子標記再進行圖譜整合。分子遺傳連鎖圖譜雖然發(fā)展很快，但是若不與形態(tài)、同工酶、細胞學等常規(guī)標記結合起來，其在育種中應用價值有限制。因此，必須借助FISH等技術將分子遺傳連鎖圖譜與經(jīng)典遺傳圖譜、細胞遺傳圖譜整合成一張綜合遺傳圖譜。這不僅是重要農(nóng)藝性狀準確定位需要，也是圖位克隆分離目的基因的需要。

1.2 QTL定位作圖 QTL定位作圖的原理與常規(guī)育種中通過表現(xiàn)型3點測驗估算交換值來確定基因順序的原理是一樣的，只是表現(xiàn)型換成了“虛擬基因”QTL。其步驟包括：①構建遺傳連鎖圖譜；②檢測與記錄分離群體中個體的遺傳標記基因型和數(shù)量性狀表型值；③應用適宜統(tǒng)計方法和軟件，確定QTL在連鎖群或染色體上位置，估算QTL遺傳效應參數(shù)，并繪制圖譜。為了提高作圖精度、效率以及更好估算QTL效應，QTL定位作圖統(tǒng)計方法不斷發(fā)展。最初QTL定位作圖廣泛使用的是單標記分析法[15]，但其存在無法確切估算QTL位置、低估QTL遺傳效應、需求個體數(shù)量多等諸多問題。因此，Lander和Bostein[16]以一元回歸分析與極大似然法為基礎，借助于完整分子連鎖圖，提出了區(qū)間作圖法，其具有近無偏估計QTL位置與效應、所需個體數(shù)量較少等優(yōu)勢，伴隨相應軟件Mapmaker/QTL推出而被廣泛應用，但也存在一次僅能檢驗2個標記，無法檢測上位性和基因型與環(huán)境互作等不足。Zeng[17]進一步將多元回歸分析與極大似然法結合，整合其他遺傳標記控制遺傳背景效應，提出了復合區(qū)間作圖法，其保持了區(qū)間作圖法的優(yōu)點，同時提高了作圖精度和效率，但仍存在無法分析上位性和基因型與環(huán)境互作，多個連鎖QTL遺傳方差估計困難等缺點。針對上述定位作圖方法不足，Kao等[18]引入Cockerham模型，多區(qū)間上多個QTL同時檢測，突破了回歸方法的局限，提出多重復區(qū)間作圖法，改進了QTL定位作圖的精確度和有效性，其還可估計QTL間上位性、個體基因型值與數(shù)量性狀遺傳力，但如何確定合適臨界值缺乏理論支持。針對無法分析復雜遺傳現(xiàn)象及環(huán)境作用基因效應，影響重要農(nóng)藝性狀精細定位與遺傳效應分析問題，朱軍等[19]又提出了基于混合線性模型的復合區(qū)間作圖法。該方法可分析QTL上位性各項遺傳主效應及其與環(huán)境互作效應進行QTL定位，但效應檢測靈敏度有限。QTL定位作圖統(tǒng)計分析復雜，依靠計算機來完成非常必要，開發(fā)推出有Mapmaker/QTL[16]，QTL Cartographer[20]，QTLMAPPER[21]，IciMapping[22]，QTLnetwork[23]等多種軟件。

QTL定位的重要目標是為分子輔助育種提供選擇標記和分離克隆QTL上的基因。目前QTL定位群體多為F2，BC1等初級定位群體，遺傳背景較復雜、重組率有限和田間實驗無法重復，影響QTL定位的準確性和穩(wěn)定性，大多數(shù)QTL定位精度不高、在10～30 cM[24]。這一精度無法區(qū)分所定位QTL是單個基因還是數(shù)個QTL連鎖的多基因組成，無法滿足基因分離克隆需要。通常情況下，10～30 cM區(qū)域基因組很可能包含控制同一性狀、效應相反的幾個QTL。這會影響性狀改良時在這一區(qū)域的遺傳獲得量和育種值。因此，要進一步理解QTL遺傳結構和分離克隆QTL，QTL精細定位十分重要。為了提高基于QTL精細定位效果，必須構建近等位基因系、回交近交群體和單片段代換系等永久性次級定位群體，開展多年多點重復實驗，消除群體內(nèi)遺傳背景和環(huán)境的干擾。這些群體的株系，除目標性狀外，遺傳背景基本一致，遺傳背景干擾效應被降低至最小，將極大提高了QTL定位的精度，有助于通過染色體登錄和步移法實現(xiàn)QTL的克隆。

1.3 關聯(lián)分析作圖 關聯(lián)分析作圖也稱連鎖不平衡作圖，是一種以連鎖不平衡為基礎，鑒定某一群體內(nèi)目標性狀與遺傳標記或候選基因關系的分析方法[25]。關聯(lián)分析作圖有4個步驟[26]：①種質(zhì)材料的選擇（盡可能包括物種全部表型和遺傳變異），其中核心種質(zhì)是進行連鎖不平衡作圖最佳選擇；②運用基因組范圍內(nèi)獨立遺傳標記（SSR，SNP，AFLP）和STRUCTURE軟件分析群體結構；③目標性狀選擇及其表型鑒定；④全基因組掃描或候選基因關聯(lián)分析。相比遺傳連鎖分析，關聯(lián)分析作圖具有3個優(yōu)點：①一般以現(xiàn)有自然群體和人工群體為材料，無需專門構建作圖群體；②可同時檢測作圖群體一個座位上的多個等位基因；③可定位數(shù)量性狀基因座位甚至單個基因本身，精度高[24-25]。遺傳連鎖作圖定位的QTL與目標基因常相距1 cM以上，分子輔助育種中易發(fā)生目標基因丟失或連鎖累贅，而關聯(lián)分析作圖鑒定的標記可達單個基因水平，可極大提高輔助選擇的準確性和育種效率。關聯(lián)分析作圖最初用于人類遺傳疾病研究，2001年才首次引入到植物遺傳研究中，發(fā)現(xiàn)了dwarf8基因與花期相關的SSR多態(tài)性位點[27]。關聯(lián)分析作圖包括標記水平的全基因組途徑和序列水平的候選基因途徑2種基本方法，可用于功能基因驗證、功能性標記開發(fā)和數(shù)量性狀QTL定位等研究。目前，主要集中在研究基因序列變異，轉錄后修飾與表型變異關聯(lián)分析作圖是未來發(fā)展的新方向[28]。雖然關聯(lián)分析作圖是挖掘優(yōu)異等位基因的有效途徑，但本身也具有局限性。關聯(lián)分析作圖效果很大程度上取決于群體中連鎖不平衡強弱和分布。連鎖不平衡程度和分布影響因素主要是突變和重組，此外還有群體結構、群體大小、遺傳漂變等[29]。種質(zhì)多態(tài)性不足夠多時，關聯(lián)分析作圖存在統(tǒng)計能力降低，不如遺傳連鎖作圖[30]。另外，遺傳連鎖作圖更適合于全基因組的QTL掃描，關聯(lián)分析作圖則可對特定QTL進行更精細定位，二者進行QTL定位作圖時是互補的，可先用遺傳連鎖作圖進行初步定位，再用關聯(lián)分析作圖進行精細定位[30]。據(jù)此，Yu等[31]提出了將遺傳連鎖作圖和關聯(lián)分析作圖相結合的巢式關聯(lián)分析作圖。

1.4 分子輔助選擇應用 分子輔助育種方法分前景選擇和背景選擇，在攜帶目標基因單株選擇、回交轉育材料選擇與評估和數(shù)量性狀改良等方面有廣泛應用。Izadi-Darbandi 和Yazdi-Samadi[32]針對高分子麥谷蛋白位點Glu-1，開發(fā)DNA標記進行輔助選擇，獲得了具有不同面包加工品質(zhì)的伊朗普通小麥品種。Tanweer等[33]通過分子輔助前景選擇法，將根據(jù)遺傳連鎖圖譜圖位克隆的稻瘟病抗性基因Pi-b[34]和Pi-kh[35]聚合到馬來西亞主栽水稻品種MR219中，獲得了具強稻瘟病抗性的純合植株，分子輔助背景選擇評估顯示95%遺傳背景與MR219一致，既提高了瘟病抗性又保持了品種原有優(yōu)良性狀，在保持MR219在農(nóng)戶中的高使用率和產(chǎn)量方面發(fā)揮了重要作用。Sureshkumar等[36]根據(jù)遺傳連鎖圖譜上與低植酸lpa2-2等位基因緊密連鎖標記，通過SSR標記輔助選擇，回交培育出低植酸玉米品種。Lohithaswa等[37]在玉米F2群體中，鑒定出了3個具有高遺傳力的高粱霜霉病抗性QTL，并通過分子輔助選擇成功滲入到8個易感玉米品系中。Knoll 和 Ejeta[38]利用QTL輔助選擇進行了高粱早期耐冷性篩選。Gao等[39]根據(jù)圖位克隆的性別決定基因ACS7，WIP1和抗枯萎病基因Fom-2，設計分子標記進行輔助選擇，篩選出了雌性抗枯萎病甜瓜品種。Zhang等[40]通過全基因組關聯(lián)分析作圖，證明大豆產(chǎn)量性狀由許多微效位點控制，并利用鑒定的SNP標記和位點進行大豆產(chǎn)量的輔助選擇，準確率達到0.75～0.87。此外，陳偉等[41]采用混合分離群體分析法（bulked segregant analysis，BSA）快速篩選出了2個油酸含量相關和4個亞麻酸含量相關的SSR標記，用于分子輔助選擇育種，獲得了遺傳背景與回交親本基本一致的高油酸和低亞麻酸植株。雖然，抗病分子輔助育種取得了明顯進展，但是抗蟲、品質(zhì)改良、抗逆等分子輔助育種進展緩慢。這是由于現(xiàn)有遺傳連鎖圖譜和QTL定位結果多源于一個或幾個親本組合，使得圖譜飽和度和QTL穩(wěn)定性低，不宜推廣到更廣泛的種質(zhì)范圍，多數(shù)還難于應用于分子輔助育種實踐，尚需在育種親本和種質(zhì)群體中驗證。雖然已構建長春花[42]、石斛[43]、柴胡[44]、羅漢果[45]、丹參[46]等數(shù)種藥用植物遺傳連鎖圖譜。但是，這些遺傳連鎖圖譜均是采用單個F1或F2等非永久性分離群體構建，因而圖譜飽和度和精度也較低，標記間平均距離都多在10.0 cM以上，性狀緊密連鎖標記缺乏，目前尚未見應用于分子輔助育種研究的報道。簡化基因組測序技術可快速、高效構建高密度遺傳連鎖圖譜和篩選性狀相關標記，為解決圖譜飽和度與精度較低問題提供了良好解決途徑。例如，Zhang等[47]和劉甜[48]分別利用RAD-se，SLAF-seq構建了黃連花和丹參高密度遺傳連鎖圖譜，標記間平均距離可達0.7 cM。

2 轉基因育種

轉基因育種是通過基因工程手段將一種或幾種外源基因轉移至某種植物，使其有效表達出相應的產(chǎn)物的一種分子育種方法。轉基因的基本原理與常規(guī)雜交育種有相似之處：雜交是將整條基因鏈（染色體）轉移，而基因轉移是選取最有用的一小段基因轉移，因此轉基因比雜交具有更高的選擇性。

2.1 常規(guī)轉基因育種技術 轉基因育種技術有農(nóng)桿菌介導法、基因槍介導法、花粉管通道法、聚乙二醇介導法和電穿孔法等，其中農(nóng)桿菌介導法、基因槍介導法和花粉管通道法為植物轉基因育種最常用方法。農(nóng)桿菌和基因槍介導法具有明顯優(yōu)勢互補性，還融合發(fā)展出了農(nóng)桿槍、粒子轟擊農(nóng)桿菌和菌體微單轟擊轉基因育種方法[49]。自從農(nóng)桿菌介導法[50]、基因槍介導法[51]和花粉管通道法[52]創(chuàng)立以來，至今三者在農(nóng)作物和園藝作物抗病、抗蟲、抗逆等轉基因育種中均取得了豐碩成果。利用農(nóng)桿菌介導法，1987年，Bytebier等[53]首次成功轉化單子葉植物獲得石刁柏抗卡那霉素植株；1994年，Hiei等[54]首次成功轉化禾本科植物水稻。農(nóng)桿菌介導法具有轉化頻率高、插入片段大且確切、遺傳表達穩(wěn)定、技術與設備簡單等優(yōu)點，從而成為植物轉基因育種應用最廣泛的方法。基因槍介導法也因具有受體材料來源廣泛（單子葉植物、雙子葉植物）等優(yōu)點，成為植物轉基因育種應用第二多的方法?；ǚ酃芡ǖ婪ㄒ虿皇苤参锓N類限制、操作簡單、易普及推廣，得到了一定程度的應用，最突出的成果就是培育出了推廣面積最大的轉基因抗蟲棉品種。與農(nóng)作物和園藝作物相比，藥用植物轉基因育種落后。農(nóng)桿菌介導法主要在次生代謝產(chǎn)物合成方面有一定研究，由于再生體系和轉化體系缺乏，成功獲得轉基因植株的研究較少，僅有青蒿[55]、羅漢果[56]和丹參[57]等數(shù)種植物?；驑尳閷Хㄒ仓挥邪仔g[58]和野甘草[59]等少量藥用植物研究報道。藥用植物花粉管通道法轉基因育種尚未見有研究報道。

2.2 基因編輯育種技術 農(nóng)桿菌介導法、基因槍介導法和花粉管通道法，3種轉基因育種技術，外源基因都是隨機整合到宿主基因組中去，轉基因效果預見性不強，存在基因沉默和出現(xiàn)非預期變異問題?；蚓庉嫾夹g具有靶向突變、刪除、插入、替換目的基因[60]和可獲得不含外源基因的非轉基因植株[61]等優(yōu)點，能很好彌補3種常規(guī)轉基因育種方法存在的問題。它們相互結合已成為一種全新的、強有力的育種方法，正在迅猛發(fā)展。

1996年，Kim等[62]將ZFP（Zinc finger protein）特異識別DNA序列的鋅指結構與核酸內(nèi)切酶FokI的非特異性切割結構域人工串聯(lián)重組融合，形成具有DNA切割功能的新嵌合體融合鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN），創(chuàng)立了第一代基因編輯技術ZFN。此后，經(jīng)眾多科學家不斷改進，ZFN技術發(fā)展成為最成熟的基因編輯技術。2007年，Kay等[63]發(fā)現(xiàn)黃單胞菌分泌注入到植物細胞中的轉錄激活子類效應因子（transcription activator-like effector，TALE）可以特異性識別、結合和激活宿主植物特定基因表達。2010年，Christian等[64]將TALE特異性識別結合DNA的重復序列中央結構域與FokI的催化切割結構域進行串聯(lián)融合，得到了能打斷DNA雙鏈的人工重組轉錄激活子類效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN），發(fā)展出了第二代基因編輯技術TALEN。2007年，丹麥的Barrangou等[65]首次證實成簇規(guī)律間隔短回文重復序列及其位點附近相關基因（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/ associated，CRISPR/CAS）是細菌的獲得性免疫防御系統(tǒng)，用于特異性識別并降解清除外源核酸，以抵御病毒和質(zhì)粒入侵。2012年，Jinek等[66]發(fā)現(xiàn)在crRNA和tracrRNA互補雙鏈RNA引導下，CRISPR/CAS9系統(tǒng)能定向打斷DNA雙鏈，并提出在設計精妙的單鏈RNA引導下，該系統(tǒng)可用于基因編輯。2013年，Cong等[67]成功應用CRISPR/ CAS9系統(tǒng)對哺乳動物基因組進行多重基因編輯，開發(fā)出第三代基因編輯技術CRISPR/CAS9。2015年，Zetsche等[68]又發(fā)現(xiàn)了具有內(nèi)切酶更易進入組織細胞、產(chǎn)生粘性末端、目標位點選擇更靈活的全新CRISPR/CAS基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1。最近，Gao等[69]還發(fā)明了古生菌Argonaute蛋白在DNA引導下進行基因組編輯的技術NgAgo，被譽為第四代基因編輯技術。

ZFN技術原理為，人工設計重組合成ZFN，導入到細胞中，通過鋅指結構靶向特異性的DNA位點并結合，然后利用FokI核酸酶切割結構域剪切特定位點DNA，最后借助細胞內(nèi)固有同源重組或非同源末端連接途徑修復DNA缺口[70]，完成特定DNA序列的堿基突變、刪除、插入和替換等編輯工作。除通過TALE重復序列中央結構域識別并結合特定DNA外，TALEN其他技術原理與ZFN技術類似。CRISPR/CAS9技術原理為，人工設計合成與特異DNA位點具有同源性的單鏈向?qū)NA（a singal guide RNA，sgRNA），并構建sgRNA和CAS9蛋白質(zhì)粒載體，通過體外表達后注入或轉化宿主細胞體內(nèi)表達的方式，使sgRNA和CAS9蛋白得以在細胞內(nèi)結合形成特異識別切割復合體，然后切割復合體在sgRNA同源互補結合引導下靶向特異DNA位點，在CAS9蛋白作用下進行DNA雙鏈剪切，最后也是借助細胞內(nèi)固有同源重組或非同源末端連接途徑修復DNA缺口，完成特定DNA序列的堿基突變、刪除、插入和替換等編輯。CRISPR/Cpf1技術與CRISPR/CAS9技術原理類似，不同是所使用的核酸內(nèi)切酶不一樣。通過農(nóng)桿菌和基因槍介導法，ZFN，TALEN和CRISPR/CAS技術都已被用于煙草、水稻、小麥、番茄、葡萄、甘藍、蘋果、甜橙等[71-79]眾多作物產(chǎn)量、抗病、抗除草劑、品質(zhì)、雄性不育、開花基因靶向突變、刪除、插入和替換研究。三者應用范圍有較大重復，但三者又各有技術特點和適用范圍。ZFN和TALEN技術，針對不同靶DNA序列，需要重新設計合成新核酸酶，實驗繁瑣、成本高。CRISPR/CAS技術僅需設計合成一個能夠結合目標序列的短片段sgRNA，實驗簡單方便，但也存在脫靶率突出和目標序列附近下游必須存在PAM保守序列問題。NgAgo技術實驗結果尚不穩(wěn)定，仍需要進一步優(yōu)化完善。

3 分子設計育種

分子設計育種是一種基于全基因組測序基礎上的前沿分子育種方法，是對育種程序中的諸多因素進行模擬、篩選和優(yōu)化，提出最佳目標基因型以及實現(xiàn)目標基因型的親本選配和后代選擇策略，以提高作物育種中的預見性和育種效率，實現(xiàn)從傳統(tǒng)的“經(jīng)驗育種”到定向、高效的“精確育種”的轉化。

3.1 基因組研究進展 基因組研究包括以全基因組測序為代表的結構基因組學和以轉錄組、蛋白組等為代表的功能基因組學。全基因組測序遺傳圖譜、物理圖譜和轉錄圖譜是分子設計育種的藍圖。轉錄組測序分離鑒定的基因以及揭示的化合物合成、信號轉導、性狀控制調(diào)控網(wǎng)絡是分子設計育種重要理論基礎。采用第一代DNA雙脫氧核苷酸末端終止法與化學降解法測序技術完成了擬南芥[80]、水稻[81]、楊樹[82]等模式植物基因組測序。伴隨第二代高通量、低成本的454，Solexa，SOLiD測序技術的廣泛應用，黃瓜[83]、玉米[84]、大豆[85]等越來越多作物也相繼完成了基因組測序，涵蓋糧食、園藝和油料作物[86]。NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄了150多種植物的基因組數(shù)據(jù)。藥用植物受遺傳背景不清、雜合度高、序列重復性多等因素限制，基因組測序起步晚，研究遠不及農(nóng)作物。2010年才完成首個藥用植物丹參基因組框架圖，隨后相繼完成了人參和靈芝基因組測序。近年隨著讀長更長（可達10 kb）的第三代SMRT單分子實時測序技術成熟推出，解決了第二代測序技術海量數(shù)據(jù)拼接難、高GC含量區(qū)域無法跨越和高度重復片段無法準確測定等問題，將二代和三代測序技術優(yōu)勢互補結合，完成了首個高雜合、高重復序列木本藥用植物杜仲基因組精細圖的構建。伴隨藥用植物基因組測序計劃的開展，羅漢果等越來越多的藥用植物基因組信息也將可獲得。由于獲取信息多、成本較低、簡單高效等優(yōu)點，簡化基因組測序也正蓬勃發(fā)展，包括RAD-seq，GBS，SLAF-seq等技術，已被用于眾多植物的復雜性狀連鎖標記開發(fā)[87-89]、高密度遺傳圖譜構建[90-93]、QTL精細定位[93-95]、群體遺傳結構與多樣性分析[96-97]等研究。此外，藥用植物轉錄組研究更是發(fā)展迅速，先后進行了青蒿、丹參、西洋參、紅豆杉、三七、柴胡、紅花、金銀花、地黃、人參等40多種藥用植物研究[98]，且在人參三萜皂苷、紅花黃酮、丹參酮關鍵酶基因鑒定[99-101]和長春花、羅漢果化合物代謝途徑解析[102-103]等方面取得了長足進展。

3.2 分子設計育種進展 2003年，荷蘭科學家Peleman和van der Voort首次提出分子設計育種概念[104]。分子設計育種是以生物信息學為平臺，以基因組學、蛋白組學和種質(zhì)信息等相關數(shù)據(jù)為基礎，綜合育種過程中所有學科的有用信息，根據(jù)作物育種目標和生長環(huán)境，在計算機上虛擬設計篩選出最佳目標基因型和育種方案，然后據(jù)此開展作物育種實驗的分子育種方法。分子設計育種是一種從傳統(tǒng)“經(jīng)驗式”到“定向、高效、精準”轉變的育種方法，也是一個結合分子生物學、生物信息學、計算機科學、遺傳學、育種學、栽培學、植物保護學、土壤學、生態(tài)學、生物統(tǒng)計學等多學科的系統(tǒng)工程。分子設計育種主要包括3個步驟[105]：①尋找目標性狀基因（或生產(chǎn)品種的原材料），即通過遺傳群體構建、多態(tài)性標記篩選、遺傳連鎖圖譜構建、數(shù)量性狀表型鑒定等研究，鑒定目標性狀基因及基因關系；②尋找目標品種（或設計品種原型），即根據(jù)不同生態(tài)環(huán)境條件，利用已經(jīng)鑒定出的各種重要育種性狀的基因信息（染色體上基因位置、基因遺傳效應、基因到性狀的表達和生化途徑、基因間互作、基因與背景環(huán)境互作等），模擬預測各種可能基因型的表型，從中選擇符合特定育種目標的基因型品種；③尋找育種途徑，即設計目標基因型品種選育途徑（或制定生產(chǎn)品種的育種方案）。分子設計育種一提出，國內(nèi)外均意識到其將會成為未來作物育種的發(fā)展方向，紛紛開始布局研究，在前期研究積累信息多的作物取得了一些進展。“全球水稻分子育種計劃”項目已開始實施。美國已投資建立了4個小麥分子育種實驗室。我國在水稻、大豆、小麥、油菜和植物花色等領域也啟動了分子設計育種計劃[106]。分子設計育種需要重要性狀QTL或基因定位與克隆、基因型到性狀表型控制機制、生物信息學數(shù)據(jù)庫、品種預測模型及模擬工具、分子輔助育種、轉基因育種、遺傳群體培育與創(chuàng)新等研究基礎做鋪墊。受這些基礎研究缺乏限制，分子設計育種仍面臨著一些巨大挑戰(zhàn)，基本還處于性狀遺傳解析、實驗室建立、數(shù)據(jù)庫構建、設計育種理論與技術體系建立等前期工作的準備當中。但是，隨著相關支撐條件不斷完善和分子生物學技術快速發(fā)展，分子設計育種必將在提高育種效率、準確性和降低育種成本方面發(fā)揮重要作用，從而成為解決傳統(tǒng)育種瓶頸的唯一途徑。

4 植物分子育種三大方向發(fā)展趨勢

為更好了解研究發(fā)展趨勢和最新進展，按5年為1個時間段，對1992年至2016年共25年間，植物分子輔助育種、轉基因育種和分子設計育種相關研究論文數(shù)進行了統(tǒng)計，結果見表1。隨著時間發(fā)展，該三大植物分子育種研究方向論文數(shù)均逐年增長。其中，分子輔助育種和分子設計育種研究增長迅速，尤其是分子設計育種研究，轉基因育種研究則在2002—2006年大幅增長后，增幅放緩。這可能與其受到社會反轉基因呼聲影響有關。分子輔助育種的遺傳連鎖作圖、QTL定位作圖研究穩(wěn)步發(fā)展，關聯(lián)分析作圖研究出現(xiàn)爆發(fā)式增長，分子輔助選擇進展則相對緩慢；轉基因育種以農(nóng)桿菌介導轉化研究為主，其次為基因槍介導轉化研究，CRISPR/CAS基因編輯研究則因其簡單易行特點被推崇也出現(xiàn)爆發(fā)式增長；分子設計育種的轉錄組測序研究因其廉價高效特點而井噴式增長，全基因組測序和蛋白組測序研究穩(wěn)步增加，品種分子設計研究開始起步，并在材料平臺、設計軟件開發(fā)和目標品種模擬設計方面取得一些實質(zhì)性進展，根據(jù)設計方案培育出了滿足在UK環(huán)境下生長目標的品種[107-109]。

5 藥用植物分子育種存在的問題與展望

5.1 提高藥效是藥用植物分子育種的主要目標 提高療效在藥材中體現(xiàn)為提高有效成分含量的育種研究，這是藥用植物分子育種的主要目標，也是藥用植物育種的基本要求。藥用植物分子育種的對象只能選擇有效成分明確并且以單體成分為用途的藥用植物，例如開展青蒿（青蒿素）、紅豆杉（紫杉醇）、銀杏（銀杏內(nèi)酯B）、蛇足石杉（石杉堿甲）、穿心蓮（穿心蓮乙素）、人參（人參皂苷Rd，Rh₂，Rg₃）、羅漢果（羅漢果甜苷5、賽門苷等）等分子育種研究，對于有效成分不確定以及不以單一中藥成分為生產(chǎn)目標的藥材不能盲目開展育種工作。轉錄組和代謝組分析已成為次生代謝化合物合成關鍵酶鑒定和代謝途徑解析的有效策略，如Ithin等[110]鑒定了土豆和番茄中參與甾體糖苷生物堿代謝合成的10個關鍵酶基因；Frusciante等[111]解析了藏紅花中藏紅花素生物合成第一步專屬代謝途徑關鍵酶基因；Itkin等[103]解析了羅漢果中羅漢果皂苷Ⅰ至皂苷Ⅵ完整代謝合成途徑。基因編輯技術是進行基因功能鑒定和新品種培育的有力工具。采用TALEN技術，Müller等[112]通過基因靶向敲出鑒定了參與擬南芥次生代謝化合物植保素camalexin生物合成關鍵酶基因CYP71A12。采用CRISPR/Cas 9技術，Jiang 等[113]靶向抑制FAD2基因表達，顯著增加了異源六倍體亞麻薺的油酸含量；Alagoz等[114]精確地靶向敲出藥用植物罌粟生物堿代謝關鍵酶基因4′OMT2，使其發(fā)生1～4個堿基的InDel突變，實現(xiàn)對生物堿代謝途徑的平衡調(diào)控，有效降低了生物堿的含量。成分含量為多基因控制的數(shù)量性狀，育種難度大。有效成分明確的藥用植物可將轉錄組、遺傳轉化、基因編輯和代謝組等技術有機結合，進行有效成分與毒性成分基因挖掘、功能鑒定和代謝途徑解析，以及增加紅豆杉、蛇足石杉等有效成分含量低藥用植物藥效與減少半夏、附子等有毒藥用植物毒性的育種研究。種群內(nèi)有效成分存在嚴重分離的，還可采用擬測交或BSA策略，充分發(fā)揮新一代測序技術強大分析能力，進行SLAF，GBS等簡化基因組測序和遺傳連鎖、QTL定位、關聯(lián)分析作圖研究，快速鑒定與有效成分含量緊密連鎖的分子標記和QTL，借助分子輔助選擇技術提高良種篩選和純種培育的效率，加快育種進程。當然，品種培育試驗與生產(chǎn)應用過程應符合現(xiàn)行《農(nóng)業(yè)轉基因生物安全管理條例》和《農(nóng)業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》要求，進行受體植物、基因操作和轉基因植物及產(chǎn)品安全性（遺傳穩(wěn)定性、環(huán)境安全性、食用安全性）評價。轉基因植物及產(chǎn)品食用安全性評價，除了規(guī)定的毒理學評價、致敏性評價、關鍵成分分析和全食品安全性評價外，還必須進行用藥安全性評價。隨著轉基因技術在藥用植物育種中應用的增加，是否需要制定出專門針對藥材轉基因應用的管理規(guī)定，應認真、慎重的討論。

5.2 挖掘和創(chuàng)造優(yōu)良農(nóng)藝性狀也是藥用植物的分子育種目標 在確保中藥藥效的前體下，改善農(nóng)藝性狀也是藥用植物育種的目標。種子繁育種苗混雜、產(chǎn)量低而種植無效益、產(chǎn)量低而藥材價格過高、病蟲多而藥材農(nóng)殘嚴重是中藥材產(chǎn)業(yè)面臨的突出問題。優(yōu)異農(nóng)藝性狀關系到藥材的產(chǎn)量與質(zhì)量，包括更高的生物產(chǎn)量、更好的抗病、抗蟲、抗逆性狀和特殊農(nóng)藝性狀等。這些性狀均為復雜的數(shù)量性狀，且藥用植物種類繁多，大多數(shù)剛完成從野生到家種的轉變，性狀遺傳規(guī)律認識不足，種質(zhì)缺乏且雜合度高，還存在生長周期長與自交不親和問題。藥用植物育種僅采用系統(tǒng)選育和雜交選育方法進行良種選育將收效甚微，需要借助分子輔助選擇等技術來提高效率和加速育種進程。半夏、三七等種群內(nèi)農(nóng)藝性狀存在嚴重分離的藥用植物也可采用擬測交或BSA策略，應用遺傳連鎖分析進行初步作圖和QTL定位，再利用SLAF，GBS等簡化基因組測序分析進行精細作圖和QTL定位，快速獲得與產(chǎn)量、抗病蟲、抗逆、性別等性狀連鎖的分子標記和QTL，借助分子輔助育種技術篩選優(yōu)良種質(zhì)、培育純種和開展聚合育種研究，即將各種優(yōu)異性狀基因和QTL逐步集中于某個單一品種是藥用植物育種更高的要求。采用CRISPR/Cas 9技術，Shi等[115]靶向突變玉米乙烯反應負調(diào)控基因ARGOS8，使玉米開花期受脅迫條件下的產(chǎn)量每英畝增加了136.08 kg。Wang等[116]靶向突變稻瘟病侵染效應因子基因OsERF922，增強了水稻稻瘟病抗性，且農(nóng)藝性狀與野生型無顯著差異。因此，種質(zhì)嚴重缺乏的珍稀瀕危藥用植物，還可運用基因編輯技術進行種質(zhì)創(chuàng)新和新品種的培育。

5.3 藥用植物常規(guī)育種研究是分子育種的基礎 強大的常規(guī)育種研究基礎，能更有效、更精準的應用分子育種技術。如果沒有常規(guī)育種提供的遺傳群體材料和性狀信息作為基礎，分子育種就成為無源之水。與農(nóng)作物相比，藥用植物的常規(guī)育種研究基礎薄弱，突出表現(xiàn)在種質(zhì)全面收集保存、種質(zhì)系統(tǒng)評價鑒定、性狀遺傳規(guī)律分析、核心種質(zhì)構建、遺傳材料分離純化、種質(zhì)創(chuàng)新等研究工作不足，以致優(yōu)異突變體、高純度品系、重組自交系、近等位基因系、回交近交群體和單片段代換系等遺傳群體材料缺乏。因此，必須加強這些周期長、基礎薄弱的常規(guī)育種研究的持續(xù)積累。

5.4 充分利用最新分子生物學技術為分子育種服務 新品種培育如何確保藥材療效是中藥領域廣泛關注的問題，也是藥用植物育種面臨的巨大挑戰(zhàn)。分子設計育種是一種綜合了多學科、多層次信息的高效、精準、預見性強的育種技術。除了目標性狀發(fā)生變異外，其他性狀保持不變是分子設計育種要達到的目標。因此，分子設計育種可很好適應藥用植物新品種培育過程中確保藥材療效的要求。全基因組測序、控制性狀QTL或基因的定位與克隆鑒定、基因型到性狀表型控制機制、基因與環(huán)境互作效應、分子輔助選擇技術、基因組編輯技術、種質(zhì)資源培育與創(chuàng)新等研究是分子設計育種的必要基礎。藥用植物雖然在遺傳圖譜構建、基因組測序、次生代謝產(chǎn)物基因挖掘與鑒定、種質(zhì)收集評價等方面取得了一定進展，但是分子設計育種這些相關基礎研究積累仍相當薄弱。因此，應選擇如丹參、靈芝等已完成基因組測序、前期研究積累相對較多的藥用植物，制定中長期育種科研規(guī)劃，借助基因組、轉錄組、蛋白組、翻譯組、小RNA組、表觀遺傳組、基因轉導、基因編輯、合成生物學等日新月異的分子生物學技術和信息技術，盡快建立藥用植物分子設計育種技術體系，相信這些新技術的應用必將為藥用植物種質(zhì)創(chuàng)新帶來重大突破。

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[責任編輯 呂冬梅]