苗素平

(陽泉師范高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)部，山西 陽泉 045000)

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·農(nóng)業(yè)科學(xué)·

SSR標(biāo)記技術(shù)在“紫甘1號(hào)”紫甘藍(lán)雜交種純度鑒定中的應(yīng)用

苗素平

(陽泉師范高等專科學(xué)校 基礎(chǔ)部，山西 陽泉 045000)

本研究以“紫甘1號(hào)”雜種一代及其親本為材料，以CTAB法提取子葉DNA，運(yùn)用SSR分子標(biāo)記方法對(duì)種子純度進(jìn)行鑒定，并與田間純度鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引物Bo-005在“紫甘1號(hào)”及其親本間具有多態(tài)性，該標(biāo)記鑒定200株雜種一代，種子純度為98%，與田間鑒定結(jié)果完全一致，可以應(yīng)用于“紫甘1號(hào)”的雜交種純度鑒定。

“紫甘1號(hào)”；雜交種純度；SSR分子標(biāo)記

“紫甘藍(lán)”(Brassica oleracea L.)又稱紅甘藍(lán)、紫包菜，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中的一個(gè)變種，為二年生植物，較喜冷涼氣候。紫甘藍(lán)中含有大量的S、Fe等礦質(zhì)元素及維生素C、維生素E等維生素，尤其富含花青素苷，經(jīng)常食用對(duì)人體大有裨益。“紫甘1號(hào)”是作者于2013年選育而成的紫甘藍(lán)雜交一代品種，該品種具有葉球緊實(shí)、色澤紫紅、耐儲(chǔ)運(yùn)、耐裂球、耐熱、較抗病毒病和黑腐病等特性，受到了廣大菜農(nóng)的歡迎。近兩年，隨著種植面積的不斷增加，用種量成倍擴(kuò)大，導(dǎo)致種子質(zhì)量控制難度加大，尤其是種子純度。近年來，因種子純度不夠而導(dǎo)致的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，甚至糾紛事件在種子行業(yè)屢見不鮮，因此，建立一套快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的“紫甘1號(hào)”雜交種純度鑒定方法迫在眉睫。

雜交種純度鑒定最常用的方法是田間種植鑒定，該方法雖簡單直觀，但耗時(shí)、費(fèi)工、易受環(huán)境影響，難以滿足大規(guī)模種子純度鑒定的要求。SSR分子標(biāo)記技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種以簡單重復(fù)序列為基礎(chǔ)的高效遺傳標(biāo)記，因其以基因組為鑒定對(duì)象，不受時(shí)空限制，所以大大節(jié)省了鑒定時(shí)間和成本，同時(shí)它具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、易操作及共顯性等優(yōu)點(diǎn)，已越來越多地被應(yīng)用到雜交種的純度鑒定。李梅等[1]用 SSR 技術(shù)對(duì)‘圓夢(mèng)’苦瓜商品種進(jìn)行鑒定，純度均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求；魯忠富等[2]利用 SSR 技術(shù)建立了浙蒲 2 號(hào)、浙蒲 6 號(hào)等 5 個(gè)浙江主栽品種的指紋圖譜紋，可高效鑒別瓠瓜種子真?zhèn)渭凹兌龋粡埿】档萚3]利用SSR技術(shù)對(duì)漢青一代蘿卜進(jìn)行鑒定，雜交種純度為95.1%；姜陸等[4]利用SSR技術(shù)建立了甜瓜“西州蜜 17 號(hào)”種子的快速鑒定方法，純度達(dá)98%。本研究以“紫甘1號(hào)”雜種一代及其親本為材料，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)種子純度進(jìn)行鑒定，并與田間純度鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，以期為“紫甘1號(hào)”建立高效的種子純度鑒定方法，為保證其種子質(zhì)量安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

“紫甘1號(hào)”雜種一代及其父、母本材料均由課題組提供，采用穴盤進(jìn)行育苗，3-4片葉齡時(shí)采樣，用液氮冷凍后放入超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。SSR引物、PCR擴(kuò)增試劑盒均購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

RapidHIT200型NDA快速檢測(cè)儀(美國IntegenX公司)、2720型PCR擴(kuò)增儀(美國ABI 公司)、MG8600凝膠電泳成像系統(tǒng)(美國Thmorgan公司)、DYY-6C型全自動(dòng)三恒多用電泳儀 (北京市六一儀器廠)、DYCZ-28C型垂直電泳槽 (北京市六一儀器廠)、Allegra X-15R型高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取方法 于3-4片葉齡時(shí)采樣，“紫甘1號(hào)”200株，父本、母本各隨機(jī)抽取20株，DNA提取采用改良的CTAB法。

1.3.2 SSR多態(tài)性引物的篩選 30對(duì)SSR引物序列信息來源于Li等[5]公開發(fā)表的文獻(xiàn)，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。多態(tài)性引物的篩選分別以“紫甘1號(hào)”的父本和母本DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳檢測(cè)篩選出可區(qū)分父母本的多態(tài)性引物。PCR擴(kuò)增體系為10μL：PCR擴(kuò)增混合試劑3.5μL，20 ng/μL上、下游引物各0.5μL，模板DNA 0.5μL，其余為滅菌超純水。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性35 s，適當(dāng)溫度退火30 s，72℃延伸35 s，循環(huán)30個(gè)；72℃延伸8 min，4℃保存。采用 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增P進(jìn)行分離，銀染顯色，統(tǒng)計(jì)條帶并拍照保存。

1.3.3 “紫甘1號(hào)”雜交種的SSR鑒定 以在“紫甘1號(hào)”父母本間具有多態(tài)性的SSR引物作為擴(kuò)增引物，單株編號(hào)200株“紫甘1號(hào)”雜交種進(jìn)行PCR擴(kuò)增及其電泳檢測(cè)，將兼具“紫甘1號(hào)”父母本條帶的單株統(tǒng)計(jì)為真雜交種并計(jì)算純度。

1.3.4 田間表型性狀鑒定 將上述200株單株編號(hào)的“紫甘1號(hào)”幼苗移栽至田間，常規(guī)管理，適時(shí)對(duì)品種生物學(xué)特征(如：葉球大小、緊實(shí)、色澤等)進(jìn)行調(diào)查，按照純度計(jì)算公式：種子純度=(真雜交種株數(shù)/200)×100%計(jì)算純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組DNA提取結(jié)果分析

“紫甘1號(hào)”及其父母本全基因組DNA條帶明亮單一，沒有明顯的降解現(xiàn)象，RNA去除效果較好(圖1)，這表明利用改良的CTAB法提取紫甘藍(lán)DNA效果較好，可用于后續(xù)的SSR分子標(biāo)記多態(tài)性篩選實(shí)驗(yàn)。

圖1 “紫甘1號(hào)”及其親本DNA電泳圖M為DL2000Marker；泳道1、2為F1；泳道3、4為父本；泳道5、6為母本

2.2 共顯性引物的篩選

利用均勻分布于甘藍(lán)染色體上的30對(duì)SSR引物對(duì)“紫甘1號(hào)”親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，共得到具有多態(tài)性的標(biāo)記11個(gè)，但共顯性標(biāo)記僅有1個(gè)，即引物Bo-005，引物序列為F(5'-3'):GAGTGTTTATTATCTGGGTCATT、R(5'-3'):GCA TACAGGTTTCATCCC，父本擴(kuò)增條帶大小為326bp，母本為308bp，利用Bo-005對(duì)“紫甘1號(hào)”DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交種具有較清晰的雙親的互補(bǔ)帶型(圖2)。

圖2 SSR引物在“紫甘1號(hào)”父母本間的擴(kuò)增結(jié)果M為DL2000Marker；泳道1、2為SSR引物Bo-005；3-12泳道為其他引物

圖3 SSR引物Bo-005鑒定“紫甘1號(hào)”雜交種純度M為DL2000Marker；泳道1為父本；泳道2母本；泳道3-17為部分F1單株

2.3 雜交種純度鑒定

為了驗(yàn)證篩選出的SSR共顯性標(biāo)記Bo-005在雜交種純度鑒定中的實(shí)用性，我們利用Bo-005引物分別對(duì)編號(hào)的200株“紫甘1號(hào)”F1的基因組進(jìn)行單株擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)196株雜交種具有雙親帶型，4株僅有母本帶型，編號(hào)分別為26，67，122，146。這表明200株“紫甘1號(hào)”F1中有196株為真雜交種，4株為混雜種，純度為98%。

2.4 田間種株鑒定

為了驗(yàn)證SSR共顯性標(biāo)記Bo-005純度鑒定的準(zhǔn)確性，我們將單株編號(hào)的200株“紫甘1號(hào)”雜交種及親本各10株定植于試驗(yàn)田，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)管理，適時(shí)調(diào)查株型、葉色、葉球大小、緊實(shí)度等品種生物學(xué)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，田間鑒定結(jié)果不僅純度同樣為98%，而且4株混雜種的編號(hào)與Bo-005標(biāo)記鑒定結(jié)果完全一致。4株混雜種中有3株與母本特征完全一致，這可能是由于母本自交而來或者機(jī)械混雜所致；1株與母本相似，這可能是由于母本接受外來雜株花粉所致，而該雜株與母本在Bo-005標(biāo)記位點(diǎn)不存在多態(tài)性。

3 結(jié)論與討論

種子純度是種子質(zhì)量檢驗(yàn)過程中非常重要的一項(xiàng)指標(biāo)，在很大程度上影響品種的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，種子純度鑒定是種子銷售前非常重要的一項(xiàng)工作。SSR標(biāo)記鑒定方法是以植株的全基因組DNA為鑒定對(duì)象，鑒定結(jié)果不受環(huán)境影響，在穴盤育苗期即可完成鑒定，省去田間種植管理等繁瑣過程，具有鑒定周期短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，在其它作物中得到了大量的應(yīng)用。王全等[6]利用 SSR 分子標(biāo)記對(duì)黃瓜種子進(jìn)行純度鑒定，篩選出1對(duì)可用的 SSR 引物。方小雪等[7]利用72對(duì)SSR引物對(duì)“東之星”、“含香雪”兩個(gè)甜瓜品種進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果分別為99.2%和97.2%。本研究以“紫甘1號(hào)”雜種一代及其親本為材料，利用30對(duì)SSR引物對(duì)種子純度進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：引物Bo-005在親本具有共顯性差異，對(duì)200株“紫甘1號(hào)”F1純度鑒定結(jié)果為98%，與田間種植鑒定結(jié)果完全一致。其中，3株雜株的與母本完全一致，可能是由于母本自交或者機(jī)械混雜所致；1株雜株與母本相似，這可能是由于母本接受外來花粉所致，而該雜株的父本與母本在Bo-005標(biāo)記位點(diǎn)不存在多態(tài)性。利用Bo-005標(biāo)記鑒定“紫甘1號(hào)”雜交種純度是一套快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的種子純度鑒定方法，完全可以滿足“紫甘1號(hào)”雜交種的大規(guī)模純度鑒定。

[1] 李 梅，張 斌, 劉 莉，等.“圓夢(mèng)08”苦瓜雜交種純度的SSR鑒定[J].種子，2015,34(4): 113-117.

[2] 魯忠富，徐 沛，吳曉花，等.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在瓠瓜種子純度快速鑒定中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012,24(4): 578-581.

[3] 張小康，朱運(yùn)峰，陳玉霞，等. SSR分子標(biāo)記技術(shù)在漢青一號(hào)蘿卜種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 55(19):5069-5071.

[4] 姜 陸，盧 浩，王賢磊，等.快速檢測(cè)甜瓜西州蜜17號(hào)種子純度的SSR標(biāo)記[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，53(3):407-411.

[5] Li H.T., Chen X., Yang Y.2011, Development and genetic mapping of microsatellite markers from whole genome shotgun sequences in Brassica oleracea[J].Mol.Breeding,2016，28(4): 585-596.

[6] 王 全，張桂華，苗偉利.應(yīng)用 SSR 技術(shù)進(jìn)行黃瓜雜交種種子純度鑒定[J].長江蔬菜，2009(4): 43-44.

[7] 方小雪，姚少林，薄永明.利用SSR分子標(biāo)記鑒定甜瓜雜交種純度[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57(2):178-181.

(編輯：嚴(yán)佩峰)

Application of SSR Molecular Marker Technique in Hybrid Purity Identification of Violet Cabbage of Zigan NO.1

MIAO Su-ping

(Department of Basic Science，Yangquan Teachers College，Yangquan 045000,China)

Zigan NO.1, Zigan NO.1 hybrid and their parents were used as materials in this research, DNA was extracted with CTAB method in cotyledon and detected with SSR molecular marker method, and the SSR identification results were compared with filed identification. The results showed that the primer Bo-005 was polymorphic between Zigan NO.1 and their parents. A total of 200 seedings of Zigan NO.1 were identified by Bo-005 , the obtained purity was 98%, completly identical to field identification. The Bo-005 could be applied to identify the purity of hybrid Zigan NO.1.

Zigan NO.1 ；purity of hybrid ；SSR molecular marker

2017-02-15

苗素平(1980—)，女，山西陽泉人，講師，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué).

S635.1

A

2095-8978(2017)02-0088-03