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        異丙酚對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

        2017-06-22 14:50:29蔡勁松
        關(guān)鍵詞:胎鼠孕鼠異丙酚

        蔡勁松,馮 帥,戚 翔,梁 治,徐 雪

        (河北醫(yī)科大學(xué)二院麻醉科,河北 石家莊 050000)

        異丙酚對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

        蔡勁松,馮 帥,戚 翔,梁 治,徐 雪

        (河北醫(yī)科大學(xué)二院麻醉科,河北 石家莊 050000)

        異丙酚;胎鼠宮內(nèi)窘迫;缺血/再灌注損傷;神經(jīng)元損傷指數(shù);丙二醛;荷包牡丹堿

        很多宮內(nèi)窘迫的胎兒在出生后會(huì)罹患新生兒腦病,出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、癲癇、腦癱甚至死亡,給患者、家庭以及社會(huì)都帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。異丙酚是一種臨床廣泛應(yīng)用的全身麻醉藥,很多研究表明異丙酚對(duì)全腦缺血大鼠及體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用[3-5],但其對(duì)宮內(nèi)窘迫的胎鼠是否具有神經(jīng)保護(hù)作用在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道,國(guó)外的研究也有限且結(jié)論不一。本研究擬利用胎鼠的宮內(nèi)窘迫模型,觀察異丙酚施加于孕鼠后對(duì)胎鼠神經(jīng)細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)成年SD大鼠24只,其中♀ 18只,♂ 6只,體質(zhì)量240~280 g。將♀鼠與♂鼠分別隨機(jī)編號(hào),按♀ ∶♂為3 ∶1合籠。次日晨進(jìn)行陰道涂片鏡檢,若發(fā)現(xiàn)精子即可確定交配,記為孕0 d,孕18 d時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 將孕鼠編號(hào)后隨機(jī)分為6組,每組3只。S組(假手術(shù)組):孕鼠剖腹手術(shù)前30 min,使用大鼠固定器在清醒狀態(tài)下經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1 ml,孕鼠僅接受剖腹手術(shù),不夾閉雙側(cè)子宮動(dòng)脈。IR組(缺血/再灌注組):孕鼠剖腹手術(shù)前30 min,經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1 ml,術(shù)中夾閉雙側(cè)子宮動(dòng)脈以造成胎鼠宮內(nèi)窘迫。P1~P3組(異丙酚組):孕鼠剖腹手術(shù)前30 min,經(jīng)尾靜脈分別注射異丙酚10,30,50 mg·kg-1,術(shù)中夾閉雙側(cè)子宮動(dòng)脈以造成胎鼠宮內(nèi)窘迫。B組(荷包牡丹堿組):孕鼠剖腹手術(shù)前30 min,經(jīng)尾靜脈注射異丙酚50 mg·kg-1,同時(shí)腹腔注射荷包牡丹堿5 mg·kg-1,術(shù)中夾閉雙側(cè)子宮動(dòng)脈以造成胎鼠宮內(nèi)窘迫。以上各組于關(guān)腹后3 d剖宮取胎鼠腦組織。

        1.2 胎鼠宮內(nèi)窘迫模型的制備 體積分?jǐn)?shù)為0.10的水合氯醛3 mg·kg-1腹腔麻醉,待其意識(shí)、角膜反射消失,肌松良好后,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。備皮、消毒后鋪單,逐層剪開(kāi)下腹部皮膚、肌層,暴露妊娠子宮及通向子宮卵巢的血管。小心分離出雙側(cè)子宮卵巢動(dòng)脈后,用兩個(gè)無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈鉗夾分別夾閉兩側(cè)動(dòng)脈以造成胎鼠宮內(nèi)窘迫。術(shù)中用溫濕的生理鹽水紗布及高架臺(tái)燈保持妊娠子宮及腹腔內(nèi)的溫度。11 min后去除動(dòng)脈鉗夾恢復(fù)子宮及胎盤血供。確定其再灌注情況良好后,腹腔消毒,還納子宮及腹腔臟器并關(guān)腹。

        1.3 取材 體積分?jǐn)?shù)為0.10的水合氯醛3 mg·kg-1行腹腔麻醉后,將孕鼠仰臥位固定在操作臺(tái)上,消毒,鋪單,按原切口逐層剪開(kāi)皮膚、肌層,暴露妊娠子宮,并觀察雙側(cè)子宮角及其內(nèi)胎鼠的大體形態(tài),胎盤有無(wú)淤血。其中胎盤附著有力、臍血管內(nèi)血流清晰者為再灌注良好、造模成功的胎鼠。將胎鼠剖宮取出,剪斷臍帶、清理分泌物后斷頭取腦,并觀察全腦大體形態(tài)。在冰袋上分離出從視交叉向尾側(cè)厚約3 mm的冠狀腦組織塊,迅速投入體積分?jǐn)?shù)為0.40的多聚甲醛溶液中固定,其余部分在液氮中快速冷凍后,置于-80℃冰箱保存,以備腦組織MDA的檢測(cè)。每只孕鼠取2個(gè)胎鼠腦標(biāo)本,共36個(gè)樣本。

        1.4 胎鼠宮內(nèi)窘迫情況的評(píng)估 剖宮產(chǎn)時(shí)觀察羊水質(zhì)量,胎鼠皮膚顏色,臍帶斷離后自主呼吸,四肢活動(dòng)及胎鼠腦膜血管的情況,同時(shí)觀察有無(wú)腦出血、腦水腫的發(fā)生。以上觀察指標(biāo)正常時(shí)得1分,不正常時(shí)得0分,滿分為7分。

        1.5 胎鼠腦組織病理學(xué)評(píng)估 組織塊固定后,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列步驟制成石蠟組織塊。石蠟塊上機(jī)沿包埋面進(jìn)行切片。先以20 μm粗切,找到雙側(cè)海馬最大平面后,改用5 μm進(jìn)行細(xì)切。用鑷子小心夾取切片放入展片儀中展開(kāi),展片完全后用多聚賴氨酸載玻片撈片、晾干后蘇木精伊紅染色(HE)。再經(jīng)脫色,透明,封片后在光鏡下觀察,行神經(jīng)病理學(xué)評(píng)估。每張切片取5個(gè)海馬CA1區(qū)的高倍鏡視野,統(tǒng)計(jì)各視野中每100個(gè)神經(jīng)元中損傷的神經(jīng)元數(shù)目,并將5個(gè)視野中損傷的神經(jīng)元總和除以500,計(jì)算神經(jīng)元損傷指數(shù)(LI)。

        1.6 硫代巴比妥酸法測(cè)定腦組織MDA 將腦組織從-80℃冰箱中取出,用濾紙吸干表面的水分,在電子天平上精確稱重。加入10倍體積的冰生理鹽水,玻璃勻漿機(jī)充分研磨后,在高速低溫離心機(jī)上4 000 r·min-1離心15 min,每個(gè)樣本取勻漿上清液0.1 ml,按MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣操作。加樣完畢后混勻,封閉離心管口并用針刺一小孔,置于沸水浴中45 min,取出后冷卻,4 000 r·min-1離心10 min取上清液備用。取離心后的上清液200 μL,加入至96孔板中,設(shè)置酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)為532 nm,上機(jī)檢測(cè)各管的吸光值,并按照下面的公式計(jì)算腦組織中MDA含量:MDA=(測(cè)定管-空白管)/(標(biāo)準(zhǔn)管-空白管)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/待測(cè)樣本蛋白濃度

        2 結(jié)果

        2.1 胎鼠宮內(nèi)窘迫模型制備成功 通過(guò)病理切片可以觀察到IR組海馬CA1區(qū)大量死亡的神經(jīng)元(染色質(zhì)凝集或邊集、核固縮深染),表明本實(shí)驗(yàn)中所建立的胎鼠宮內(nèi)窘迫模型是成功的。

        2.2 剖宮產(chǎn)后各組胎鼠宮內(nèi)窘迫情況的評(píng)估 S組:剖宮產(chǎn)時(shí)羊水清亮,量中等。胎鼠皮膚顏色紅潤(rùn),臍帶斷離后可進(jìn)行自主呼吸,四肢活動(dòng)良好。胎鼠腦膜血管清晰,無(wú)血管擴(kuò)張及腦出血、腦水腫。

        IR組:剖宮產(chǎn)時(shí)可見(jiàn)羊水量少渾濁,黃綠色糞染。胎鼠皮膚蒼白或發(fā)紺,無(wú)自主呼吸,對(duì)外界刺激無(wú)反應(yīng)。腦膜血管明顯擴(kuò)張充血,腦水腫發(fā)生率高于0.80,個(gè)別胎鼠腦伴有腦出血現(xiàn)象。

        P組:與IR組相比,各治療組的胎鼠腦損傷均有不同程度的改善。羊水相對(duì)清亮,糞染較少。胎鼠皮膚顏色粉紅,在人工刺激下可進(jìn)行呼吸,外界刺激可有四肢活動(dòng)。腦膜血管擴(kuò)張充血明顯改善,腦組織水腫明顯減輕,無(wú)腦出血發(fā)生。

        B組:胎鼠腦損傷較治療組嚴(yán)重,與IR組損傷程度相似。

        各組胎鼠宮內(nèi)窘迫情況的評(píng)分見(jiàn)Fig 1。

        Fig 1 Score of new born fetal rats

        One dot in the figure expressing one fetal rat. The following index was observed to estimate the fetal rat, including amniotic fluid, skin, respiration, activity, menigeal vessel, cerebral hemorrhage and cerebral edema. One index normal 1 score and one index un-normal 0 score.*P<0.05vsgroup IR;#P<0.05vsgroup P1

        2.3 胎鼠腦病理切片的結(jié)果 S組:海馬錐體神經(jīng)元較成鼠密度大,約為8~12層,排列整齊,細(xì)胞核飽滿,核仁清晰,核染色質(zhì)均勻。神經(jīng)元體積大、細(xì)胞質(zhì)染色均一。

        IR組:海馬神經(jīng)元排列紊亂,神經(jīng)元腫脹或皺縮。核染色質(zhì)凝集成塊狀或邊集成新月形,核仁消失,細(xì)胞核固縮,基質(zhì)模糊不清。

        P組:從P1~P3組,可見(jiàn)光鏡下海馬區(qū)神經(jīng)元與IR組相比損傷明顯減輕:錐體神經(jīng)元排列相對(duì)整齊,神經(jīng)元胞體較大,僅個(gè)別細(xì)胞發(fā)生了核固縮深染或染色質(zhì)凝集。

        B組:光鏡下海馬神經(jīng)元損傷程度比IR組略輕,但明顯較各治療組嚴(yán)重。

        2.4 LI的統(tǒng)計(jì)結(jié)果 與S組(7.2±0.9)相比,IR組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生明顯的缺血/再灌注損傷,LI明顯升高(71.9±2.8,P<0.01)。與IR組相比,異丙酚各治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的LI明顯降低(40.8±2.6,21.4±1.4,20.1±1.3,P<0.05)。P2、P3組與P1組相比海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷指數(shù)明顯降低(P<0.05),但P2、P3組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。與IR組相比,B組LI有明顯降低(51.2±2.3,P<0.05),但明顯高于各異丙酚治療組(P<0.05)。各組胎鼠腦病理切片的結(jié)果見(jiàn)Fig 2,3。

        Fig 2 Profile of hippocampus CA1 of fetal rat(HE×400)

        A:group S;B:group IR;C:group P1;D:group P2;E:group P3;F:group B

        Fig 3 Neuronal Lesion-index of hippocampus CA1(LI)

        *P<0.05vsgroup IR;#P<0.05vsgroup P1;△△P<0.01vsgroup S

        2.5 異丙酚對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠腦組織MDA含量的影響 S組胎鼠腦組織的MDA為(3.86±0.20) μmol·g-1。IR組MDA的含量為(9.10±0.45) μmol·g-1,與S組相比明顯升高,P<0.01。異丙酚各治療組MDA的含量分別為(7.32±0.41)、(5.65±0.27)、(5.44±0.28) μmol·g-1,與IR組相比明顯降低,P<0.05。其中P2、P3組與P1組相比,明顯降低(P<0.05),P2、P3組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。B組胎鼠腦組織MDA的含量為(7.54±0.31) μmol·mg-1,與缺血/再灌注組相比明顯降低,P<0.05。各組宮內(nèi)窘迫胎鼠腦組織MDA含量的結(jié)果見(jiàn)Fig 4。

        Fig 4 MDA content of fetal rat brain

        *P<0.05vsgroup IR;#P<0.05vsgroup P1;△△P<0.01vsgroup S

        3 討論

        胎兒宮內(nèi)窘迫是臨床上常見(jiàn)的一類產(chǎn)科疾患,造成新生兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷及后遺癥。許多研究已證實(shí),異丙酚對(duì)缺血/再灌注損傷的腦組織具有保護(hù)作用[3-5],但其對(duì)宮內(nèi)窘迫胎兒是否具有神經(jīng)保護(hù)作用仍待研究。

        病理切片的結(jié)果表明,缺血前孕鼠靜脈注射異丙酚對(duì)宮內(nèi)窘迫的胎鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。與缺血組相比,異丙酚各組中胎鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的損傷明顯減輕。隨著異丙酚的劑量由10 mg·kg-1增加至30 mg·kg-1,其神經(jīng)保護(hù)作用也增高了。但當(dāng)異丙酚的劑量由30 mg·kg-1進(jìn)一步增加到50 mg·kg-1時(shí),其神經(jīng)保護(hù)作用并沒(méi)有進(jìn)一步增加。這證明異丙酚對(duì)胎鼠的神經(jīng)保護(hù)作用不僅具有劑量依賴性,還具有劑量封頂效應(yīng)。

        有研究表明異丙酚的作用位點(diǎn)是GABAA受體[6-7],而荷包牡丹堿是GABAA受體的拮抗劑。本研究對(duì)孕鼠靜脈注射異丙酚的同時(shí),腹腔注射荷包牡丹堿可部分逆轉(zhuǎn)異丙酚對(duì)胎鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。這證明異丙酚對(duì)胎鼠的神經(jīng)保護(hù)作用部分是通過(guò)激動(dòng)GABAA受體實(shí)現(xiàn)的。

        與成年鼠相比,胎鼠腦內(nèi)不飽和脂肪酸的含量更高,而胎鼠的氧耗率高,氧自由基清除系統(tǒng)不完善,這使其更易受到缺血缺氧后脂質(zhì)過(guò)氧化的攻擊[8-9]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的降解產(chǎn)物,其含量直接反映了腦脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比,缺血/再灌注組胎鼠腦組織MDA含量明顯升高。與缺血/再灌注組相比,各異丙酚治療組中胎鼠腦MDA含量均有不同程度的降低。與P1相比,P2、P3組胎鼠腦內(nèi)MAD含量進(jìn)一步降低,而P2、P3組之間MDA含量差異無(wú)顯著性。這表明麻醉劑量的異丙酚就能夠抑制宮內(nèi)窘迫胎鼠腦組織的脂質(zhì)過(guò)氧化程度,更大劑量的異丙酚并未顯示出更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。這可能是由于異丙酚的苯環(huán)上連接有一個(gè)酚羥基,具有較強(qiáng)的還原性,類似于天然抗氧化劑α-tocopherol(vitamin E)的作用,因而異丙酚能降低腦缺血/再灌注后的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),吞噬自由基,維護(hù)細(xì)胞膜、線粒體及生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,從而起到腦保護(hù)的作用[10-14]。

        與缺血/再灌注組相比,B組胎鼠腦MDA含量明顯降低。這表明異丙酚的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用可能與GABAA受體無(wú)關(guān)。

        4 結(jié)論

        異丙酚能明顯減少宮內(nèi)窘迫胎鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷,并降低腦內(nèi)MDA的含量,對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用,大劑量的異丙酚并未顯示出更強(qiáng)的保護(hù)作用。

        GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿能部分地逆轉(zhuǎn)異丙酚的神經(jīng)保護(hù)作用。表明異丙酚的神經(jīng)保護(hù)作用部分是通過(guò)激動(dòng)GABAA受體實(shí)現(xiàn)的。

        (致謝:本實(shí)驗(yàn)于河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理實(shí)驗(yàn)室完成,在此深表感謝。)

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        Neuroprotective effect of propofol on fetal rat brain in intrauterine ischemia/reperfusion injury

        CAI Jin-song, FENG Shuai, QI Xiang, LIANG Zhi, XU Xue

        (DeptofAnesthesiology,theSecondHospital,HebeiMedicalCollege,Shijiazhuang050000,China)

        Aim To observe the neuroprotective effect of different doses of propofol on ischemic fetal rat brain.Methods Eighteen healthy pregnant SD rats were randomly allocated into the following six groups with three rats in each. Group S: sham operation group, Group IR: ischemia/reperfusion group, Group P1~P3: different doses of propofol groups, Group B: bicuculline group. In group S and group IR, 1 ml saline solution was administered via caudal vein. In group P1~P3, 10, 30, 50 mg·kg-1of propofol was administered via caudal vein respectively. In group B, when 50 mg·kg-1propfol was administered via caudal vein, 5 mg·kg-1bicuculline was injected intraperitoneally at the same time. Bilateral uterine ovarian arteries were clamped for 11 mins to make intrauterine distress model of the fetal rats. The brains of fetal rats were removed after 3 days of reperfusion.Brain sections(5 μm thick) were mounted and stained with Hematoxylin and eosin(HE). The profile of the hippocampus CA1 was evaluated under a light microscope and neuronal Lesion-index(LI) was calculated. MDA content of fetal rat brain was detected by thiobarbituric acid reaction method to determine the lipid peroxidation degree of brain.Results LI was (7.2±0.9) and MDA was (3.86±0.20) μmol·g-1in group S. LI was 71.9±2.8 and the content of MDA was (9.10±0.45) μmol·g-1in group IR, which increased significantly compared with those in group S(P<0.01). LI was (40.8±2.6), (21.4±1.4), (20.1±1.3) and the content of MDA was (7.32±0.41), (5.65±0.27), (5.44±0.28) μmol·g-1in propofol groups, which decreased significantly compared with those in group IR(P<0.05). LI and the content of MDA was (51.2±2.3), (7.54±0.31) μmol·g-1in group B,respectively, reversing partly the neuroprotevtive effect of propofl.Conclusion Propofol could protect the neurons in hippocampus CA1 region of fetal rat against intrauterine distress by reducing the concentration of MDA in the brain.

        propofol;fetal rat intrauterine distress;ischemia/reperfusion injury;Lesion-index of neuron;MDA;bicuculline

        時(shí)間:2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.048.html

        2017-01-05,

        2017-02-17

        河北省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(No 132777129)

        蔡勁松:(1966-),男,博士,主任醫(yī)師,研究方向:神經(jīng)保護(hù),通訊作者,E-mail:caijs20081225@126.com

        10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.024

        A

        1001-1978(2017)06-0869-05

        R-332;R322.81;R364.4;R714.5;R742.89;R971.2摘要:目的 觀察異丙酚對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。方法 SD大鼠♀18只,交配后獲得孕鼠。將孕鼠隨機(jī)分為6組(n=3):假手術(shù)組(S組)、缺血/再灌注組(IR組)、異丙酚低、中、高劑量組(P1~P3組)和荷包牡丹堿組(B組)。S組和IR組孕鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1 mL。P1~P3組孕鼠經(jīng)尾靜脈分別注射異丙酚10、30、50 mg·kg-1。B組在注射異丙酚50 mg·kg-1的同時(shí),腹腔注射荷包牡丹堿5 mg·kg-1。夾閉子宮卵巢動(dòng)脈11 min。再灌注3 d后取材,每只孕鼠各取2只胎鼠,每組6只。制作切片,計(jì)算海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷指數(shù)(LI)。硫代巴比妥酸反應(yīng)法檢測(cè)胎鼠腦組織丙二醛(MDA)含量。結(jié)果 S組LI為7.2±0.9,MDA為(3.86±0.20) μmol·g-1,與之相比,IR組的LI為71.9±2.8,MDA為(9.10±0.45) μmol·g-1(P<0.01)。與IR相比,異丙酚各組的LI分別為40.8±2.6,21.4±1.4,20.1±1.3,MDA分別為(7.32±0.41),(5.65±0.27),(5.44±0.28) μmol·g-1(P<0.05)。B組的LI,MDA分別為(51.2±2.3),(7.54±0.31) μmol·g-1,翻轉(zhuǎn)了異丙酚的保護(hù)作用。結(jié)論 異丙酚對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。

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