余 婭，王虹又，易宗平，陳 萍

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 400016)

帕瑞昔布對大鼠心梗后心室重構的改善作用及對PI3K/Akt信號通路的影響

余 婭，王虹又，易宗平，陳 萍

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 400016)

目的 探討不同劑量的帕瑞昔布對大鼠心梗后心室重構的改善作用及對PI3K/Akt信號通路的影響。方法 40只♂ SD大鼠隨機分為5組(n=8)：假手術組(S組)、心室重構模型組(R組)、帕瑞昔布低劑量組(P1組)、中劑量組(P2組)、高劑量組(P3組)。R組、P1組、P2組、P3組大鼠采用開胸結扎心臟左冠狀動脈前降支的方法制備急性心肌梗死模型。建模24 h后連續(xù)2周每天分別給予P1組、P2組、P3組大鼠腹腔注射4、8、12 mg·kg-1的帕瑞昔布，余2組給予等量的生理鹽水。于建模處置4周時右側頸動脈插管的方法測定大鼠血流動力學變化；處死大鼠，取心臟測定左室肥厚指數；HE染色、Masson染色觀察梗死周邊區(qū)心肌組織病理變化及間質膠原纖維增生情況；TUNEL染色光鏡下觀察心肌細胞凋亡情況；RT-PCR法檢測心肌梗死周邊區(qū)ANP mRNA、BNP mRNA含量的變化； Western blot法測定心肌PI3K、Akt、p-Akt及caspase-3的蛋白表達。結果 與S組比較，心室重構模型組血流動力學各項指標明顯變化，左室肥厚指數、ANP mRNA、BNP mRNA及caspase-3的蛋白表達明顯升高，PI3K、p-Akt的蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與R組比較，中、高劑量帕瑞昔布可改善大鼠血流動力學，降低左室肥厚指數(P<0.05)。低、中、高劑量帕瑞昔布組均可降低ANP mRNA、BNP mRNA及caspase-3的蛋白表達，提高PI3K、p-Akt的蛋白表達(P<0.05)。結論 中、高劑量帕瑞昔布能延緩心肌梗死大鼠的左心室重構過程，改善心臟功能，這種保護作用可能與PI3K/Akt信號通路的激活有關。

心肌梗死；心室重構；環(huán)氧化酶2抑制劑；帕瑞昔布；凋亡；PI3K/Akt信號通路

心肌梗死(myocardial infarction，MI)后心室重構是MI后心肌實質和間質發(fā)生的一系列病理變化，引起心肌肥厚、擴張，心功能進行性惡化，嚴重影響患者的預后。交感神經的過度激活以及前列腺素(prostaglandin，PG)為主的炎癥介質釋放在心室重構中發(fā)揮著舉足輕重的作用[1-2]。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是合成前列腺素的關鍵酶。既往部分研究[3-5]認為抑制COX-2的活性，降低前列腺素的表達，可延緩心室重構，對心臟具有保護作用。然而，也有觀點[6-7]認為抑制COX-2的活性，降低前列腺素的合成，可加重心臟重構，對心臟功能有一定的損害作用。Timmers等[8]報道了長期使用塞來昔布可增加豬心肌梗死后的死亡率，降低心臟功能，加重心室重構。以上這些相互矛盾的研究結果使COX-2抑制劑對心臟的作用難以被明確解釋，增加了臨床使用COX-2抑制劑治療心臟疾病的難度。因此，本實驗探索不同劑量的COX-2高選擇性抑制劑帕瑞昔布對心肌梗死后心室重構的影響。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)/Akt信號通路是細胞內最重要的生存通路，可調節(jié)細胞凋亡過程，能夠明顯抑制細胞凋亡[9]。研究發(fā)現，PI3K/Akt信號途徑對缺血缺氧誘發(fā)的心肌細胞凋亡可產生心肌保護作用[10-11]。因此，本實驗采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型，觀察不同劑量的帕瑞昔布對心梗后心室重構的影響及PI3K/Akt信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康SPF級成年♂ SD大鼠40只，體質量230～250 g,由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證: SCXK(渝2012-0001)。采用隨機數字表法將大鼠分為5組(n=8)：假手術組(S組)、心室重構模型組(R組)、帕瑞昔布低劑量組(P1組)、中劑量組(P2組)、高劑量組(P3組)。

1.2 藥物與儀器 注射用帕瑞昔布鈉(輝瑞制藥有限公司,批號：L61449)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)；Masson試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)；β-actin抗體(美國Proteintech公司)；PI3K、Akt、p-Akt、caspase-3抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；小動物呼吸機(浙江醫(yī)科大學醫(yī)學儀器實驗廠)；RT-PCR反應儀(美國應用生物系統(tǒng)中國分公司)；電泳儀、凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 動物模型制備及分組處理 參照文獻[12]的方法，建立急性心肌梗死模型。大鼠禁食12 h后，質量濃度為35 g·L-1的水合氯醛(10 mL·kg-1)腹腔注射麻醉。氣管插管后連接小動物呼吸機行正壓通氣，監(jiān)測ECG。常規(guī)備皮消毒后，左外側切口經第3肋間隙進入胸腔，暴露心臟，在左心耳下緣與肺動脈圓錐交界下方3～4 mm處結扎左冠狀動脈前降支。觀察到左室前壁顏色變白且心電圖ST-T弓背向上抬，心肌梗死模型建立成功。嚴格止血后，逐層關閉胸腔并保持負壓，待大鼠自主呼吸恢復后拔出氣管導管。S組前降支只穿縫線，不結扎。P1組、P2組、P3組大鼠于手術后24 h開始分別給予4、8、12 mg·kg-1的帕瑞昔布腹腔注射，余2組給予等量的生理鹽水，共2周。

1.4 觀測指標

1.4.1 血流動力學監(jiān)測 建模4周后，大鼠稱重并麻醉，仰臥固定，暴露右頸總動脈，將充滿濃度為50 kU·L-1肝素生理鹽水的心導管經右頸總動脈插入左心室，連接壓力換能器及BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，待穩(wěn)定后監(jiān)測左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室收縮壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室收縮壓最大下降速率(-dp/dtmax)，重復3次，記錄平均值。

1.4.2 左心室肥厚指數測定 血流動力學監(jiān)測結束后，處死大鼠，取心臟，減去左右心耳及大血管，用4℃ PBS磷酸緩沖液沖洗干凈，濾紙吸干后置于電子天平上稱重并記錄。再沿室間隔邊沿剪去左右心房及右心室。將取下的左心室及室間隔置于電子天平上稱重并記錄。分別計算心臟重量/體質量(HW/BW)、(左心室+室間隔質量)/體質量(LV+S)/BW、(左心室+室間隔質量)/心臟重量(LV+S)/HW。

1.4.3 大鼠心肌組織HE染色、Masson染色、TUNEL染色 心臟左室常規(guī)清洗后，經甲醛固定制成石蠟切片(4 μm)。HE染色，高倍鏡下觀察心肌梗死周邊區(qū)心肌細胞形態(tài)學變化。Masson染色，高倍鏡下觀察心肌梗死周邊區(qū)纖維增生情況，每張玻片隨機取4個視野，應用IPP6.0圖像分析軟件，心肌膠原容積分數(CVF)=心肌膠原面積/所測視野面積×100%。TUNEL染色，高倍顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡情況，每張玻片任選4個視野，應用IPP6.0圖像分析軟件，計算心肌細胞凋亡率/%=TUNEL陽性細胞核數/細胞核總數×100%。

1.4.4 RT-PCR法測定心肌ANP mRNA及BNP mRNA的表達 將左室梗死與非梗死交界區(qū)的心肌組織取下，置于液氮中保存。取適量組織用TRIzol法提取總RNA，參照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參。β-actin上游引物：5′-TTGGCATAGAGGTCTTTA-3′，下游引物：5′-AGATGACCCAGATCATGTTTGA-3′；ANP上游引物：5′-GCTCCTTCTCCATCACCAAG-3′，下游引物：5′-AGCCCTCAGTTTGCTTTTCA-3′；BNP上游引物：5′-TTCTGCTCCTGCTTTTCCTT-3′，下游引物: 5′-CGATCCGGTCTATCTTCTGC-3′。擴增條件為94℃ 5 min、94℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，循環(huán)35次，72℃ 7 min,4℃ 5 min。將擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，Quantity one軟件分析目的基因與內參基因吸光度。

1.4.5 Western blot法測定心肌PI3K、Akt、p-Akt及caspase-3蛋白表達 全蛋白提取法提取心肌組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各組蛋白質均50 μg上樣，行SDS-PAGE電泳分離蛋白質，電轉膜后分別加入稀釋的PI3K抗體(1 ∶800)、Akt抗體(1 ∶700)、p-Akt抗體(1 ∶600)、caspase-3抗體(1 ∶600)、β-actin抗體(1 ∶4 000),4℃過夜，d 2用TBST液漂洗膜，并用1 ∶4 000的熒光二抗37℃孵育1h，結果應用Fusion生物凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描定量，計算各樣品的相對密度值作為各蛋白質的相對含量。

2 結果

2.1 帕瑞昔布對心室重構模型大鼠血流動力學的影響 帕瑞昔布對心室重構模型大鼠血流動力學的改善作用如Tab1所示，帕瑞昔布劑量在8～12 mg·kg-1范圍內能明顯提高LVSP、+dp/dtmax，降低LVEDP、-dp/dtmax，且隨著劑量的增加，改善作用越明顯(P<0.05)。帕瑞昔布劑量低于8 mg·kg-1時對心室重構模型大鼠的血流動力學無明顯改善作用(P>0.05)。

2.2 帕瑞昔布對心室重構模型大鼠左心室肥厚指數的影響 帕瑞昔布對心室重構模型大鼠左心室肥厚指數的改善作用如Tab 2所示，帕瑞昔布劑量在8～12 mg·kg-1范圍內能明顯增加體重，降低HW/BW、(LV+S)/BW、(LV+S)/HW，且隨著劑量的增加，改善作用越明顯(P<0.05)。帕瑞昔布劑量低于8 mg·kg-1時對心室重構模型大鼠的左心室肥厚指數無明顯改善作用(P>0.05)。

Tab 1 Hemodynamic parameters in five ±s,n=8)

*P<0.05vsgroup S;#P<0.05vsgroup R;ΔP<0.05vsgroup P2

Tab 2 Left ventricular mass index in five ±s,n=8)

*P<0.05vsgroup S;#P<0.05vsgroup R;ΔP<0.05vsgroup P2

Fig 1 Pathomorphological variance of myocardial tissues(HE staining,×400)

A:Group S; B:Group R; C:Group P1; D:Group P2; E:Group P3

Fig 2 Interstitial fibrosis of myocardial tissues(Masson staining,×400)

A:Group S;B:Group R;C:Group P1;D:Group P2;E:Group P3

Fig 3 Cardiac myocyte apoptosis of myocardial tissues(TUNEL staining,×400)

A:Group S;B:Group R;C:Group P1;D:Group P2; E:Group P3

2.3 帕瑞昔布對心室重構模型大鼠心肌組織的形態(tài)學、纖維化及細胞凋亡的影響 光鏡下觀察Masson染色顯示心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。假手術組心肌細胞排列較均勻，無斷裂，示正常心肌細胞形態(tài)，可見少量膠原纖維及炎性細胞浸潤；心室重構模型組心肌細胞腫脹增粗最明顯，形態(tài)極不規(guī)則，排列紊亂，細胞間隙可見大量膠原纖維增生，呈網狀分布，并且炎性細胞浸潤明顯，與假手術組比較，膠原容積分數CVF明顯升高(P<0.05)。經帕瑞昔布治療后細胞肥大、排列紊亂及心肌間質纖維化程度有明顯減輕，膠原容積分數CVF較心室重構組明顯降低，且隨著劑量的增加，改善效果越明顯(P<0.05，Fig 1、2，Tab 3)。

TUNEL法檢測5組梗死周邊區(qū)心肌細胞凋亡情況。細胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡陽性細胞。與假手術組比較，心室重構模型組在梗死周邊區(qū)有大量的心肌細胞發(fā)生凋亡，凋亡指數AI明顯增加(P<0.05)；與心室重構模型組比較，經帕瑞昔布治療后梗死周邊區(qū)心肌細胞凋亡發(fā)生明顯減少，凋亡指數AI降低(P<0.05)，且隨著劑量的增加，下降程度越明顯(P<0.05，Fig 3，Tab 3)。

Tab 3 Comparison of myocardial collagen volume fraction(CVF) and myocardial apoptosis index(AI) in five ±s, n=8)

*P<0.05vsgroup S;#P<0.05vsgroup R;▲P<0.05vsgroup P1;ΔP<0.05vsgroup P2

2.4 帕瑞昔布對心室重構模型大鼠心肌梗死周邊區(qū)ANP mRNA、BNP mRNA表達的影響 與假手術組比較，心室重構模型組的心肌肥厚標志基因ANP mRNA、BNP mRNA表達增加(P<0.05)。與心室重構組比較，帕瑞昔布各劑量組心肌肥厚標志基因ANP mRNA、BNP mRNA的表達降低，且隨著劑量的增加，下降程度越明顯(P<0.05，Fig 4，Tab 4)。

Fig 4 Expressions of ANP mRNA and BNP mRNA in five groups Tab 4 Expressions of ANP mRNA and BNP

GroupANPmRNABNPmRNAGroupS1.59±0.062.27±0.03GroupR3.04±0.10*3.81±0.11*GroupP12.16±0.67#2.88±0.07#GroupP21.72±0.12#▲2.59±0.02#▲GroupP31.57±0.07#▲△2.48±0.05#▲△

*P<0.05vsgroup S;#P<0.05vsgroup R;▲P<0.05vsgroup P1;△P<0.05vsgroup P2

2.5 帕瑞昔布對心室重構模型大鼠心肌梗死周邊區(qū)PI3K、Akt、p-Akt及caspase-3蛋白表達的影響 各組Akt蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)。與假手術組比較，心室重構模型組的PI3K、p-Akt的蛋白表達降低，caspase-3的蛋白表達增加(P<0.05)；與心室重構組比較，帕瑞昔布各劑量組PI3K、p-Akt的蛋白表達升高，caspase-3的蛋白表達降低(P<0.05)，其中以高劑量帕瑞昔布組蛋白表達改變最明顯，中劑量帕瑞昔布組次之(P<0.05，Fig 5，Tab 5)。

Fig 5 Expressions of PI3K, Akt, p-Akt and caspase-3 in five groups Tab 5 Expressions of PI3K, Akt, p-Akt and

GroupPI3K/β-actinp-Akt/Aktcaspase-3/β-actinGroupS4.22±0.060.77±0.011.88±0.02GroupR2.23±0.07*0.62±0.01*2.90±0.04*GroupP13.03±0.09#0.65±0.01#1.93±0.01#GroupP23.26±0.09#▲0.71±0.01#▲1.12±0.03#▲GroupP33.61±0.08#▲△0.77±0.03#▲△0.79±0.04#▲△

*P<0.05vsgroup S;#P<0.05vsgroup R;▲P<0.05vsgroup P1;△P<0.05vsgroup P2

3 討論

隨著人們生活方式的改變及人口老齡化,心肌梗死的發(fā)病率逐年提高[13]。心室重構是心肌梗死發(fā)展為心衰過程中最重要的病理過程，嚴重影響心肌梗死患者近晚期預后，因此如何及時有效的預防和逆轉心室重構過程是改善心肌梗死轉歸的關鍵所在。本實驗采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支后飼養(yǎng)28 d的方法建立心室重構模型，于結扎成功后24 h開始腹腔注射低(4 mg·kg-1)、中(8 mg·kg-1)、高(12 mg·kg-1)劑量的帕瑞昔布(相當于正常成人用藥 40～80 mg，即臨床等效劑量)，觀察帕瑞昔布能否改善心肌梗死后心室重構，以及是否具有劑量依賴關系。結果顯示，低劑量帕瑞昔布(4 mg·kg-1)對心肌梗死后心臟的改善作用僅限于微觀病理形態(tài)學的改變，可抑制心肌細胞肥大及間質膠原纖維的增生，對心臟功能及左室肥厚的改善沒有明顯作用。當帕瑞昔布達到中劑量(8 mg·kg-1)時對心室舒縮功能(LVSP、+dp/dtmax、LVEDP、-dp/dtmax)及左室肥厚均有不同程度的改善，并隨著藥物劑量的增大，對心室舒縮功能及左室肥厚的改善效果更明顯。而Straino等[14]的實驗中，發(fā)現短期(5 d)應用超低劑量的帕瑞昔布(0.7 mg·kg-1)可提高大鼠心臟功能。本實驗結果與此具有明顯差異，可能與其研究中只探討了帕瑞昔布的短期效用，未探究長期作用有關。

心鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)是一類重要的心臟內分泌激素，正常生理狀態(tài)下少量分泌。急性心肌梗死后由于心室的收縮和舒張功能急劇減退，容量和壓力負荷相對過重，導致心肌細胞尤其是梗死區(qū)與非梗死區(qū)交界處受到的牽拉刺激最大，產生并釋放的ANP、BNP增多。因此，梗死交界區(qū)ANP、BNP的含量可反映梗死局部張力的變化，是心肌細胞病理性肥大的可靠指標，對評價心室重構有重要指導意義[15]。本研究結果顯示，心室重構組ANP mRNA、BNP mRNA的含量明顯增高，帕瑞昔布可明顯降低ANP mRNA、BNP mRNA的表達，且隨著劑量的增加，降低程度越明顯，這在我們前期研究的基礎上進一步表明，帕瑞昔布可抑制心肌梗死后心肌細胞肥大，延緩心室重構，且具有劑量依賴關系。

心肌梗死后由于缺血缺氧，心肌細胞首先啟動凋亡相關機制，形成凋亡復合體，通過多種蛋白酶的活化誘導細胞凋亡。由于心肌細胞再生能力有限，加之平滑肌細胞異常增生，極大的損害了心臟正常結構及功能。探究啟動細胞抗凋亡作用的機制，可為減少缺血缺氧引起的心臟損傷提供有效的途徑。PI3K/Akt信號傳導途徑是促使抗細胞凋亡發(fā)生的重要調控因子[16]，PI3K可直接激活Akt發(fā)生磷酸化，p-Akt能夠進一步通過抑制促凋亡蛋白caspase-3、Bax等的形成發(fā)揮保護心肌的作用[17]。研究發(fā)現，PI3K/Akt信號途徑對缺血缺氧誘發(fā)的心肌細胞凋亡，可產生心肌保護作用[11,18]。本研究采用帕瑞昔布長期治療后發(fā)現，梗死周邊區(qū)心肌細胞的凋亡及caspase-3蛋白表達降低，PI3K、p-Akt蛋白表達增加，且以高劑量的帕瑞昔布降低細胞凋亡、改善蛋白表達最明顯。因此，上述研究結果表明，帕瑞昔布可能通過上調磷酸化Akt的表達，抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮延緩心室重構的保護作用，但其下游的具體機制還需要深入研究。

綜上所述，帕瑞昔布可提高大鼠心肌梗死后心臟功能，延緩心室重構，該心肌保護作用的產生可能與PI3K/Akt信號通路的激活有關。但本實驗僅研究了帕瑞昔布對大鼠心梗后心臟功能和左室肥厚的改善作用，未明確功能的改善能否轉化為整體預后的提高，因此其臨床實用性有待進一步研究。

(致謝:本實驗動物飼養(yǎng)、建模、血流動力學的監(jiān)測以及左室肥厚指數的測定主要在重慶醫(yī)科大學動物實驗中心完成，病理切片、RT-PCR以及Western blot主要在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室完成，感謝各位老師和同學對本實驗的指導和幫助！)

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Improvement effects of parecoxib on ventricular remodeling after acute myocardial infarction in rats and its influence in PI3K/Akt signaling pathway

YU Ya, WANG Hong-you, YI Zong-ping, CHEN Ping

(DeptofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To observe the improvement effects of parecoxib on ventricular remodeling after acute myocardial infarction in rats and its influence on PI3K/Akt signaling pathway.Methods Forty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups(n=8):sham operation group (group S), ventricular remodeling model group(group R), low dose of parecoxib group(group P1), middle dose of parecoxib group(group P2), and high dose of parecoxib group(group P3). A myocardial infarction model was established by ligating the left anterior descending branch(LAD) of coronary artery in group R, group P1, group P2 and group P3.One day after the operation,the rats were given intraperitoneal injection of 4，8，12 mg·kg-1parecoxibin Group P1, group P2 and group P3,respectively, for two weeks. The same volume saline was given in group S and group R. Four weeks later, LVSP, LVEDP,+dp/dtmax, -dp/dtmaxwere monitored.The hearts were harvested to calculate left ventricular hypertrophy index.The pathological change of heart was examined with an optical microscope. The expressions of atrial natriuretic peptide(ANP) mRNA and brain natriuretic peptide(BNP) mRNA were detected by RT-PCR. The expression of PI3K,Akt,P-Akt and caspase-3 was detected by Western blot.Results Compared with group S, the cardiac function was decreased, the left ventricular hypertrophy index, the expression levels of ANP,BNP mRNA, caspase-3 were increased, and the expression levels of PI3K, P-Akt were reduced in group R(allP<0.05).Compared with group R, the cardiac function was ameliorated, the left ventricular hypertrophy index were reduced in group P2 and group P3(allP<0.05).The expression levels of ANP,BNP mRNA, Caspase-3 were decreased, and the expression levels of PI3K and P-Akt were increased in group P1,group P2 and group P3(allP<0.05).Conclusions Middle and high doses of parecoxib can mitigate the process of ventricular remodeling after myocardial infarctionand improve the myocardial function, and its underlying mechanism may be related to activating PI3K/Akt signaling pathway.

myocardial infarction; ventricular remodeling; cyclooxygenase 2 inhibitors; parecoxib; apoptosis;PI3K/Akt signaling pathway

時間：2017-5-25 17:44 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.046.html

2017-02-13，

2017-04-15

衛(wèi)生部國家臨床重點專科建設項目[財社(2011)170號]；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科學重點項目(2012-018)；重慶市醫(yī)學重點學科[渝衛(wèi)科教(2007)2號]；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科研計劃項目(No 2012-1-018)

余 婭(1990-)，女，碩士生，研究方向：麻醉與心臟的保護，E-mail:18580020379@163.com； 陳 萍(1962-)，女，碩士，教授，碩士生導師，研究方向：麻醉與臟器的保護，通訊作者，E-mail: mazuichen@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.023

A

1001-1978(2017)06-0863-06

R-332；R322.11；R329.25；R331.31；R542.22；R977.3