李書鵬 楊秀芬 袁京京 邱德文

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100081）

蛋白激發(fā)子Hrip1互作蛋白的篩選及其原核表達

李書鵬 楊秀芬 袁京京 邱德文

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100081）

蛋白激發(fā)子Hrip1是從極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）中分離純化出的一種新型超敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白，能激發(fā)煙草、擬南芥和水稻等多種植物的免疫防御反應(yīng)，提高廣譜抗病性。為了探究Hrip1誘導(dǎo)植物抗性反應(yīng)的分子機制，以Hrip1為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交，在水稻cDNA文庫中篩選Hrip1的互作蛋白。經(jīng)回轉(zhuǎn)驗證和x-a-gal染色得到了一個Hrip1互作蛋白-CSN5。構(gòu)建了互作蛋白CSN5的原核表達載體pGEX-6P-2-CSN5，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了可溶性的融合表達蛋白，用GST親和層析柱純化獲得單一條帶的融合表達蛋白，并用Western blot鑒定了融合表達蛋白的正確性。研究結(jié)果為進一步鑒定Hrip1的互作蛋白及其功能奠定了基礎(chǔ)。

蛋白激發(fā)子；互作蛋白；酵母雙雜交；原核表達

蛋白激發(fā)子是一類能激發(fā)植物獲得性抗性，增強植物自身免疫的蛋白質(zhì)，在植物保護上發(fā)揮著重要作用［1-4］。激發(fā)子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的過程主要包括植物受體對激發(fā)子的識別、信號傳導(dǎo)，以及下游抗性相關(guān)基因表達調(diào)控等［5-7］。植物對激發(fā)子的識別是觸發(fā)植物免疫信號傳導(dǎo)的開關(guān)，候選互作蛋白的鑒定與功能研究將為深入了解植物與病原微生物的互作、揭示蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的作用機制奠定堅實的基礎(chǔ)。目前，研究比較清楚的激發(fā)子受體僅有少數(shù)，如細菌鞭毛蛋白（Flagellin）flg22 的受體 FLS2（Flagellin-sensing 2），細菌轉(zhuǎn)錄延伸因子 Tu（EF-Tu）elf18 的受體 EFR，以及水稻上幾丁質(zhì)受體等［8-11］。許多蛋白激發(fā)子與植物的互作蛋白尚未鑒定。

真菌蛋白激發(fā)子Hrip1（Hypersensitive response inducing protein 1），是本實驗室從極細鏈格孢菌中分離純化出了一種分子量為17 562.5 Da新型超敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白。利用快速擴增cDNA末端反應(yīng)（RACE）克隆了Hrip1的編碼基因（GenBank accession number HQ713431）。Hrip1在煙草上引發(fā)了類似于典型超敏反應(yīng)的壞死斑，DNA laddering在內(nèi)的細胞凋亡反應(yīng)，提高煙草對TMV的系統(tǒng)抗性；同時能誘導(dǎo)煙草中NO和ROS的產(chǎn)生，激活水楊酸途徑的蛋白激酶以及多種防御相關(guān)基因的表達［12］。Hrip1轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強，說明蛋白激發(fā)子Hrip1基因在擬南芥中的表達能夠改善和提高植株的耐鹽抗旱能力［13］。此外，Hrip1能顯著提高水稻對稻瘟菌的抗性，誘導(dǎo)抗性基因和蛋白的上調(diào)表達（另文發(fā)表），為了闡述Hrip1誘導(dǎo)水稻的抗性機制，本研究利用酵母雙雜交篩選Hrip1在水稻中的互作蛋白，同時構(gòu)建互作蛋白的原核表達體系，以期為研究水稻對蛋白激發(fā)子Hrip1的識別機制以及Hrip1互作蛋白的進一步鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

日本晴（Oryza sativa ssp. japonica）種子和原核表達載體pGEX-6P-2由本實驗室保存。水稻cDNA文庫、酵母菌株Mav203、酵母雙雜交載體pDBleu（BD）和pPC86（AD）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所王國梁研究員惠贈。酵母Minimal SD Base、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-His/-Trp/-Leu、x-a-gal等購自Clontech。大腸桿菌表達感受態(tài)細胞BL21、ProteinIso?GST Resin、Western blot Kit等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 誘餌載體的構(gòu)建 以本實驗室保存的pet32-Hrip1質(zhì)粒為模板擴增Hrip1片段，用限制性內(nèi)切酶Nco I和Not I對Hrip1片段和pDBleu載體（包含BD結(jié)構(gòu)域）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物回收，T4DNA連接酶25℃鏈接30 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1，涂布卡那霉素50 μg/mL 的LB平板，37℃過夜，挑取若干單克隆菌落，酶切驗證成功后送上海生工生物工程技術(shù)公司進行測序。

1.2.2 誘餌載體的轉(zhuǎn)化和自激活檢測

1.2.2.1 酵母感受態(tài)細胞的制備 從-80℃冰箱中取出酵母菌株MaV203，在YPAD平板上劃線培養(yǎng)，待酵母菌落直徑約為2-3 mm時，挑單克隆于1.5 mL離心管，30℃過夜，取100 μL菌液于50 mL的YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)16-20 h至OD600=0.15，3 500 r/min 離心20 min，收集菌體，30 mL新鮮YPAD重懸細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6，3 500 r/min離心20 min，收集菌體，加入15 mL無菌水重懸細胞，繼續(xù)離心20 min，棄上清，加入1.5 mL 1.1×TE/ LiAc重懸細胞后12 000 r/min 離心30 s，棄上清，加入600 μL 1.1×TE/ LiAc，制成酵母感受態(tài)細胞。

1.2.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母 在1.5 mL離心管中分別加入100 ng的質(zhì)粒DNA、10 μL的carrierDNA、500 μL的PEG/ LiAc和50 μL的酵母感受態(tài)細胞，輕輕混勻；30℃培養(yǎng)30 min，加入50 μL的DMSO，42℃熱激25 min，12 000 ×g 離心10 s，棄上清，加入1 mL的YPD Plus Liquid Medium重懸細胞，30℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h，12 000 ×g離心10 s，棄上清，用0.5 mL NacL（0.9%）溶液重懸細胞，取100 μL菌液涂在SD-Leu平板，30℃倒置培養(yǎng)，觀察酵母轉(zhuǎn)化子生長情況。

1.2.2.3 誘餌質(zhì)粒自激活鑒定 將質(zhì)粒pDBleu-Hrip、pPC86；pDBleu、pPC86分別共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，取100 μL涂于 SD-Trp-Leu平板，30℃培養(yǎng)2 d，分別從SD-Trp-Leu平板上挑取包含pDBleu-Hrip、pPC86；pDBleu、pPC86的單菌落，1 mL SD-Trp-Leu過夜培養(yǎng)，取100 μL菌液，12 000 ×g離心10 s，棄上清，500 μL無菌水重懸細胞，重復(fù)該步驟2次，使菌液最終體積為200 μL，分別吸取1 μL菌液點在不同濃度3AT（0 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L、80 mmol/L） 的SD-Trp-Leu-His 平 板 上，30℃倒置培養(yǎng)3-5 d，觀察酵母菌落生長情況。

1.2.3 Hrip1水稻互作蛋白的篩選 制備包含有誘餌載體pDBleu-Hrip的酵母感受態(tài)細胞，在一個轉(zhuǎn)化組中加入將500 μL的酵母感受態(tài)細胞、1 μg的水稻cDNA文庫質(zhì)粒、20 μL Yeast carrier DNA和1 mL PEG/ LiAc，轉(zhuǎn)化步驟同上，最終取若干400 μL菌液涂50 mmol/L 3AT 的SD-Trp-Leu-His平板，30℃倒置培養(yǎng)3-7 d。從篩庫平板上挑選生長速度快且菌落直徑較大的單菌落，3 mL SD-Trp-Leu液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取200 μL菌液，用無菌水洗過后，重新點在50 mmol/L 3AT 的SD-Trp-Leu-His平板上，能生長的克隆為陽性候選克隆，用天根公司酵母質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并送測序。測序結(jié)果在國際水稻庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中進行比對與分析。將感興趣的候選互作蛋白質(zhì)粒與pDBleu-Hrip1重新共轉(zhuǎn)化酵母細胞，挑單菌落于SDTrp-Leu液體培養(yǎng)基，無菌水清洗細胞后，再次點50 mmol/L 3AT的SD-Trp-Leu-His平板和包含有x-agal（40 μg/mL）的50 mmol/L 3AT SD-Trp-Leu-His平板，能良好生長的為Hrip1互作蛋白。

1.2.4 Hrip1互作蛋白基因的克隆和原核表達載體的構(gòu)建 取1 mg長勢良好的日本晴葉片，用天根植物總RNA試劑盒提取其總RNA，以RNA為模板，使用北京全式金公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）進行第一鏈 cDNA 的合成。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的互作蛋白基因序列設(shè)計特異序列，PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性20 s，59℃復(fù)性20 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，連接pEASY-Blunt Zero載體，轉(zhuǎn)化全式金大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1，篩選單克隆送測序。以測序成功的pEASY-Blunt Zero-CSN5質(zhì)粒為模板，設(shè)計特異引物，擴增互作蛋白CSN5基因序列，用限制性內(nèi)切酶BamH I、Sal I對片段和原核表達載體pGEX-6P-2（GST標簽）雙酶切，產(chǎn)物膠回收，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1，送測序。

1.2.5 互作蛋白的原核表達與純化 取測序正確的重組載體pGEX-6P-2-CSN5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞。取菌落PCR檢測正確的菌株，接種50 mL氨芐青霉素的（終濃度為100 μg/mL）LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約0.6，調(diào)整溫度為37℃、28℃、16℃，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)過夜；收集菌體，超聲破碎后，分別取上清進行SDS-PAGE分析，確定合適的誘導(dǎo)溫度。取菌液接種到50 mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃過夜。按1∶100的稀釋比例轉(zhuǎn)接到1 L的LB培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)，離心收集菌體，用上樣緩沖液（50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸菌體，超聲破碎后，12 000 ×g 離心1 h，收集上清后過0.45 μm濾膜，加入GST親和層析柱，孵育后，用洗脫緩沖液洗脫（50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，還原性谷胱甘肽GSH 20 mmol/L，pH 8.0），收集蛋白用3 KD超濾管除鹽，SDS-PAGE檢測分析。

1.2.6 互作蛋白的Western blot檢測 取純化后的蛋白樣品20 μL，同時取等量空載體菌株的純化產(chǎn)物作陰性對照，用12%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（24 V×1 h），含5% 脫脂牛奶封閉液封閉2 h。取10 mL經(jīng)稀釋的GST一抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育2 h，1×TBST buffer洗滌PVDF膜3次，每次5 min。加入10 mL稀釋的HRP二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，1×TBST buffer洗滌PVDF膜3次，每次5 min。PVDF膜瀝干后，置于專用塑料底層，加入顯色液檢測。

2 結(jié)果

2.1 誘餌載體的構(gòu)建與鑒定

以pET32-Hrip1為模板擴增Hrip1基因，得到一條大小約450 bp的條帶（圖1-A），與預(yù)期相符。用Nco I和Not I雙酶切對Hrip1片段、pDBleu雙酶切，T4連接酶連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Trans1-T1。37℃過夜，挑取若干單克隆菌落培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒酶切檢測，結(jié)果（圖1 -B）得到一條500 bp和一條大于8 000 bp的條帶，說明Hrip1已經(jīng)連接到載體pDBleu中。進一步的測序結(jié)果表明，目的片段按正確讀碼框插入pDBleu載體，沒有堿基的缺失和突變，成功構(gòu)建誘餌載體pDBleu-Hrip。

2.2 誘餌載體的轉(zhuǎn)化和自激活檢測

將pDBleu-Hrip、pPC86；pDBleu、pPC86分 別共轉(zhuǎn)化酵母菌株MaV203，兩種轉(zhuǎn)化菌株都可以在SD-Trp-Leu平板上長出白色菌落，直徑大于2 mm，且含有誘餌蛋白的（pDBleu-Hrip、pPC86）菌株與對照組（pDBleu、pPC86）相比，長勢沒有差別。說明各載體成功轉(zhuǎn)化且誘餌載體對酵母菌株MaV203沒有毒性，可以進行后續(xù)實驗。用SD-Trp-Leu液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)包含誘餌蛋白的菌株（pDBleu-Hrip、pPC86）和對照菌株（pDBleu、pPC86），分別吸取1 μL菌液點在不同濃度3AT的SD-Trp-Leu-His 平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-5 d。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，在3AT濃度為50 mmol/L時，包含誘餌蛋白的菌株和對照菌株都不能正常生長，說明50 mmol/L的3AT可以有效抑制MaV203細胞對報告基因的本底表達，因此可以利用3AT濃度為50 mmol/L的SD-Trp-Leu-His平板進行酵母雙雜交篩選。

2.3 Hrip1水稻互作蛋白的酵母雙雜交篩選

將水稻cDNA文庫轉(zhuǎn)化到包含誘餌載體pDBleu-Hrip的MaV203后， 在50 mmol/L 3AT 的SD-Trp-Leu-His平板篩選，得到182個初始陽性克隆，通過提取質(zhì)粒、序列信息在Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中搜索比對，去掉移碼突變的菌株，得到16個陽性克隆。經(jīng)重新共轉(zhuǎn)化，只有一個克隆可以在50 mmol/L 3AT SD-Trp-Leu-His上生長，同時在含x-agal（40 μg/mL）的篩選板上顯藍色（圖3）。說明篩選到一個水稻文庫蛋白與Hrip1存在相互作用。生物信息學(xué)分析表明，該互作蛋白在水稻庫中的名稱為COP9 signalosome complex subunit 5b（CSN5），基因cDNA全長1 083 bp，編碼360個氨基酸，分子量40 kD。

圖1 Hrip1基因的擴增和重組誘餌載體的雙酶切鑒定

圖2 誘餌載體的自激活檢測

2.4 Hrip1互作蛋白基因的克隆和原核表達載體的構(gòu)建

以反轉(zhuǎn)錄得到的水稻cDNA為模板進行PCR擴增，獲得大小約為1 000 bp的目的條帶（圖4-A）。測序結(jié)果表明，目的條帶的序列與水稻庫中提供的序列完全一致，可以滿足構(gòu)建表達載體的要求。用限制性內(nèi)切酶BamH I、Sal I對CSN5片段和原核表達載體pGEX-6P-2（GST標簽）雙酶切，連接轉(zhuǎn)化后隨機選取若干單克隆，培養(yǎng)菌株后提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果（圖4-B）顯示，在產(chǎn)物中得到一條大小1 000 bp左右的條帶，表明CSN5已經(jīng)連接到pGEX-6P-2質(zhì)粒中，進一步的測序結(jié)果顯示，重組載體的讀碼框正確，插入序列無堿基缺失或突變，表明成功構(gòu)建了pGEX-6P-2-CSN5原核表達載體。

圖3 Hrip1與CSN5的酵母雙雜交互作

圖4 CSN5基因的擴增和重組表達載體的雙酶切鑒定

圖5 CSN5融合蛋白的誘導(dǎo)表達

2.5 互作蛋白CSN5的原核表達與純化

將重組表達載體pGEX-6P-2-CSN5轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21，表達菌株分別在16℃、28℃和37℃下誘導(dǎo)過夜，收集菌體，超聲破碎，取適量上清液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果（圖5-A）顯示，在37℃和28℃下均不能檢測到融合蛋白的可溶性表達，只有當誘導(dǎo)溫度為16℃時，SDS-PAGE顯示出表達分子量67.8 kD的融合蛋白（CSN5蛋白的理論分子量為40 kD，pGEX-6P-2上的GST標簽分子量為27.8 kD），融合表達蛋白大小與預(yù)期一致。為了進一步明確CSN5融合蛋白的可溶性，重新收集16℃誘導(dǎo)的菌體，破碎離心后，分別取上清和沉淀進行電泳分析，以空載體菌株為陰性對照。結(jié)果（圖5-B）顯示，在陰性對照組中，上清和沉淀均沒有檢測到融合蛋白的表達。16℃誘導(dǎo)下，融合蛋白在沉淀和上清中均出現(xiàn)一條蛋白條帶，而且在沉淀中的表達量更多，說明融合蛋白以包涵體和可溶蛋白的形式表達。為了獲取純化的融合蛋白，將菌株接種到1 L的LB液體培養(yǎng)基集中大量培養(yǎng)，收集上清后用GST親和層析柱純化，SDS-PAGE顯示得到單一的蛋白條帶（圖6-A）。

2.6 互作蛋白的Western blot

為了進一步驗證純化得到的蛋白是GST-CSN5。使用抗GST標簽鼠單克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗鼠IgG（H+L）為二抗，Western blot檢測結(jié)果（圖6-B）表明，融合蛋白可以和GST標簽單克隆抗體結(jié)合，且目的條帶大小與融合蛋白分子量一致，說明GST-CSN5在大腸桿菌BL21中得到正確表達。

圖6 CSN5融合蛋白的純化和Western blot檢測

3 討論

植物在面對眾多潛在病原微生物時，依然可以頑強生存下去，這得益于能高效地識別這些微生物產(chǎn)生的激發(fā)子而激活其復(fù)雜而精密的先天免疫系統(tǒng)［14］。在植物與病原物相互作用中，植物細胞中的受體蛋白或靶蛋白起到了關(guān)鍵性作用。分布于細胞表面和細胞體內(nèi)的靶蛋白或受體蛋白識別微生物入侵產(chǎn)生的PAMPs（Pathogen pathogen associated molecular patterns） 或 DAMPs（danger-associated molecular patterns）而啟動信號傳遞和下游多種防御反應(yīng)［15］。

Hrip1是本實驗室分離到的一種蛋白質(zhì)激發(fā)子，可以顯著提高煙草和水稻的抗性，但Hrip1引起植物抗性反應(yīng)的免疫機理仍不清楚［12，13］。在本研究中，將Hrip1構(gòu)建到包含BD結(jié)構(gòu)域的誘餌載體pDBleu上，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選水稻cDNA庫，得到了一個蛋白激發(fā)子Hrip1的互作蛋白CSN5。CSN5是COP9 信號復(fù)合體中（COP9 signalosome complex，CSN）的一個亞基。COP9 信號復(fù)合體由8個蛋白亞基組成CSN1-CSN8，最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥的光形態(tài)構(gòu)成的研究中［16，17］。擬南芥的COP9 突變體顯示出“組成型光形態(tài)建成”的表型，這類突變體在黑暗中生長時會像正常光照生長的幼苗一樣：下胚軸短小、子葉張開、質(zhì)體分化以及光調(diào)控基因的表達。COP9復(fù)合體在高等真核生物中比較保守，主要參與蛋白的泛素化途徑［18］。它具有異肽酶的活性，負責將NEDD8（Neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 8）蛋白從cullin-RING泛素連接酶（CRLs）中去除；以保證CRLs功能的準確性［19，20］。后續(xù)研究證明，CSN廣泛參與了真核生物在生長發(fā)育中的各種代謝途徑，包括光形態(tài)構(gòu)成、花的發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)等［21］。CSN5本身是一種金屬蛋白酶［22］，是CSN的催化活性中心，通過包含的JAMM基序（JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme）將共價連接的RUB1（Related Ubiquitin 1）/NEDD8 切割開而行使其催化活性，。實際上，CSN同樣在植物的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在煙草中，CSN與SCF泛素連接酶在RAR1和SGT1的參與下，調(diào)控R基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)，抵御多種病原物的入侵［23］。CSN5在擬南芥中可以和源自于阿拉伯半乳桿菌（Hyaloperonospora arabidopsidis，Hpa）以及丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae，Psy）的多種效應(yīng)子直接互作，參與擬南芥對Hpa和Psy的抗性［24］。許多植物對病原物的響應(yīng)和信號通路依賴于對特定蛋白質(zhì)的降解，一些病原微生物將植物CSN作為靶標蛋白以阻止寄主的抵抗［21］。本研究通過酵母雙雜交篩選以及共轉(zhuǎn)試驗證明了蛋白激發(fā)子Hrip1能與CSN5相互作用，初步推測CSN5在Hrip1誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)的過程中發(fā)揮著重要作用，植物有可能是在CSN5的參與下完成了對Hrip1的識別，同時啟動相應(yīng)信號傳遞網(wǎng)絡(luò)，進而引起下游多種抗性反應(yīng)，最終使植物具備了系統(tǒng)性獲得抗性，這些推測需要今后進一步研究證實。為了進一步驗證Hrip1和CSN5的體外互作，本研究建立了CSN5原核表達技術(shù)，選取帶GST標簽的pGEX-6P-2作為表達載體，從水稻cDNA文庫中準確克隆到CSN5基因，通過酶切、連接得到正確的pGEX-6P-2-CSN5重組表達質(zhì)粒。將CSN5融合表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21，分別在16℃、28℃和37℃下過夜誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)只有16℃條件下，誘導(dǎo)表達可以得到可溶性性的目的蛋白。表達蛋白通過GST親和層析純化后，得到了單一條帶的目的蛋白。Western blot鑒定了原核表達的CSN5蛋白是正確的。本研究鑒定了蛋白激發(fā)子Hrip1在水稻中的互作蛋白，并建立了互作蛋白的原核表達技術(shù)，研究結(jié)果為后續(xù)體外驗證Hrip1和CSN5的相互作用以及CSN5基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過酵母雙雜交技術(shù)，在水稻cDNA文庫中篩選到了蛋白激發(fā)子Hrip1的互作蛋白CSN5。構(gòu)建互作蛋白CSN5的原核表達載體pGEX-6P-2-CSN5，并在大腸桿菌表達菌株BL21中成功表達，16℃過夜誘導(dǎo)，通過GST親和層析得到純化的可溶性融合蛋白。Western blot鑒定進一步證明了CSN5蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達。

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（責任編輯 朱琳峰）

Screening of Interacting Proteins with Protein Elicitor Hrip1 and Its Prokaryotic Expression

LI Shu-peng YANG Xiu-fen YUAN Jing-jing QIU De-wen
（The State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081）

The protein elicitor Hrip1 is a novel hypersensitive response-inducing protein secreted by necrotrophic fungus，Alternaria tenuissima，and it induces defense response and enhances broad-spectrum disease resistance in tobacco，Arabidopsis and rice plants. In order to investigate the molecular mechanism of Hrip1 inducing plant disease-resistance，we screened its interaction partners from a rice cDNA library using Hrip1 as bait protein and via yeast two hybrid system. After retransformation assay and x-a-gal staining，Hirp1-interacting protein CSN5 was obtained. Then，the recombinant pGEX-6P-2-CSN5 plasmid was constructed and transformed into the chemical competent cells of Escherichia coli BL21. The recombinant fusion protein in a single band was purified with a GST affinity chromatography column，and identified by Western blot. The results provided a base for further identification of the protein interacted with Hrip1 and its functions.

protein elicitor；interacting protein；yeast two hybrid system；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.20170001

2017-01-10

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201403025）

李書鵬，男，碩士，研究方向：蛋白激發(fā)子與植物互作；E-mail：shupengli123@163.com

邱德文，男，博士，研究方向：植物誘導(dǎo)疫苗及生物防治；E-mail：qiudewen@caas.cn