姬菩忠趙興緒秦文宋學(xué)文張勇趙紅斌

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050）

大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在小鼠MSCs細(xì)胞中的表達(dá)

姬菩忠1，2趙興緒1秦文2宋學(xué)文2張勇1趙紅斌1，2

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050）

克隆大鼠NeuroD2基因，旨在構(gòu)建pIRES2-AcGFP1-ND2真核表達(dá)載體并檢測其在小鼠MSCs中的表達(dá)。采用RTPCR技術(shù)克隆大鼠NeuroD2基因，分析該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能域、細(xì)胞定位及與其他物種同源性；構(gòu)建pIRES2-AcGFP1-ND2表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）；采用Real-time PCR、免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測重組質(zhì)粒在小鼠MSCs中的表達(dá)。結(jié)果表明，大鼠NeuroD2基因CDS區(qū)全長1 149 bp，共編碼382個(gè)氨基酸，屬于bHLH家族，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)近似“螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）”結(jié)構(gòu)，主要分布在細(xì)胞核，氨基酸序列與家鼠（99%）、羅猴（98%）、人（97.7%）同源性較高；Real-time PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組NeuroD2基因表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05）；免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組NeuroD2蛋白表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05）。成功克隆大鼠NeuroD2基因并構(gòu)建了pIRES2-AcGFP1-ND2真核表達(dá)載體。

NeuroD2；基因克?。簧镄畔W(xué)分析；pIRES2-AcGFP1-ND2

大鼠神經(jīng)源性分化蛋白（Neurogenic differertiation，NeuroD）屬于II類堿性螺旋-環(huán)-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）蛋白家族成員［1-3］，其基因位于2q32，是一種含bHLH結(jié)構(gòu)域并結(jié)合E-box的轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)分化過程中起重要作用［4］，其中NeuroD亞類（NeuroD，Nex-1［Math-2］，Math-3，and NeuroD2［NDRF］）大部分在神經(jīng)發(fā)育過程中表達(dá)［5］。NeuroD2基因主要表達(dá)于大腦組織中，是控制神經(jīng)分化的關(guān)鍵基因，其表達(dá)可從胚胎第11天開始持續(xù)到成年，F(xiàn)arah等［6］通過上調(diào)NeuroD2的表達(dá)使來源于小鼠胚胎的P19細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣形態(tài)并表達(dá)神經(jīng)特異性蛋白β-tubulin III。

本研究通過對大鼠NeuroD2基因的CDS區(qū)進(jìn)行克隆并分析其序列，構(gòu)建重組表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1-ND2，轉(zhuǎn)染小鼠MSCs并檢測其表達(dá)情況，以期為后續(xù)研究該載體誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 取4只清潔級成年Wistar大鼠，體重（150±10 g），雌雄不限，頸動脈處死后迅速取其大腦組織，于液氮中儲存?zhèn)溆谩Ｙ|(zhì)粒、菌株及細(xì)胞真核表達(dá)載體 pIRES2-AcGFP1、克隆載體pMD20-T vector及E. coli DH5α均購自TaKaRa公司；小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞D1細(xì)胞株購自美國ATCC公司（CRL-10915）。

1.1.2 主要試劑 高保真聚合酶、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒、SYBR?Green熒光定量試劑及DNA Marker均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Nhe I和Bam HI購自New England Biolabs；T4連接酶購自Therom Fisher公司；瓊脂糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母浸出粉、氨芐青霉素、IPTG和X-Gal均購自上海生工公司；卡那霉素購自上海麥克林生化科技有限公司；NeuroD2抗體購自Abcam公司；胎牛血清購自浙江天杭科技有限公司；D-MEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco；Trizol、Lipofectamine2000和Opti-MEM Medium購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收 錄 的Norway大 鼠NeuroD2基 因mRNA序 列（NM_019326.1），采用Primer Premier5.0 軟件針對CDS區(qū)設(shè)計(jì)一對引物，并在引物上下游分別插入Nhe I和Bam HI酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)堿基（下劃線所示）。F：5'-CGGCTAGCCGCATGCTGACCCGCCTG TT-3'，R：5'-CGGGATCCCGGGCCGGACAAAGGCAA AG-3'。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR 使用Trizol法提取大鼠大腦總RNA，紫外分光光度計(jì)測定濃度及純度后，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按反轉(zhuǎn)錄說明書步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：98℃ 10 s，63.6℃ 5s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 大鼠NeuroD2基因的克隆PCR產(chǎn)物 通過1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，取1 μL PCR產(chǎn)物、1 μL pMD20-Tvector和3 μL滅菌蒸餾水混勻后，加入5 μL Ligation Mighty Mix，輕輕混勻，16℃ 30 min進(jìn)行連接。連接后將產(chǎn)物導(dǎo)入E.coli DH5α感受態(tài)培養(yǎng)并篩選陽性克隆菌落，通過Nhe I和Bam HI雙酶切鑒定后，送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 大鼠NeuroD2基因的生物信息學(xué)分析 使用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/ protpar am/）、SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy. org/）、Predictprotein（http://www.predic- tprotein. org）、SOPMA（http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/ jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy 8.htm）、MotiFinder（http://quasimotifinder.tau.ac.il/）、TMHMM（http://www. cbs.dtu.dk/ services /TMHMM/）、PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/ form.html）預(yù)測NeuroD2蛋白的結(jié)構(gòu)、功能域及亞細(xì)胞定位。通過軟件MegAlign和BLAST對牛（NM_001205958）、黑猩猩（XM_511456）、人（NM_006160）、羅猴（NM_001265801）、熱帶爪蟾（NM_001079018）、斑馬魚（NM_131082）、挪威鼠（NM_019326）、家鼠（NM_010895）進(jìn)行同源性分析。

1.2.5 真核表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1-ND2的構(gòu)建 將克隆質(zhì)粒pMD20-ND2和pIRES2-AcGFP1載體用Nhe I和Bam HI雙酶切后，回收目的基因和表達(dá)載體片段，T4連接酶16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽性克隆菌落。

1.2.6 小鼠MSCs的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將小鼠MSCs按0.25×104個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的D-MEM/F-12完全培養(yǎng)基中，37℃ 5% CO2，待細(xì)胞貼壁率達(dá)70%-90%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為實(shí)驗(yàn)組（pIRES2-AcGFP1-ND2）和對照組（pIRES2-AcGFP1），每組重復(fù)3次。用無血清Opti-MEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次后，按Lipofectamine2000說明書配置轉(zhuǎn)染體系，轉(zhuǎn)染6 h更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后在熒光顯微鏡下觀察AcGFP1的表達(dá)。隨意挑選5個(gè)高倍鏡視野（×400），每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并計(jì)算表達(dá)AcGFP1蛋白的陽性細(xì)胞比例。

1.2.7 Real-time PCR檢測重組質(zhì)粒 在小鼠MSCs中的表達(dá)轉(zhuǎn)染24 h后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后根據(jù)NeuroD2基因（NM_019326.1）設(shè)計(jì)引物：F：5'-CCTGCTACTCCAAGACGCAGAA-3'，R：5'-CAGAGTCTGCACGTAGGACACCA-3'。以小鼠GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參：F：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，R：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。Realtime PCR反應(yīng)體系20 μL，SYBR?Green 10 μL，上下游引物各0.6 μL，Rox 0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL；反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)；每組重復(fù)4次，所得結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。

1.2.8 免疫熒光和Western blot法檢測重組質(zhì)粒在小鼠MSCs中的表達(dá) 在含無菌蓋玻片的培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染小鼠MSCs 72 h，待細(xì)胞貼壁率在70%-90%時(shí)棄去培養(yǎng)基，爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.01 mol/L PBS清洗、0.5% TritonX-100作用后，5% BSA封閉30 min，滴加稀釋后的NeuroD2一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS清洗3次，滴加FITC標(biāo)記的二抗（1∶200），37℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，滴加濃度為5 mg/mL DAPI染色5 min，蒸餾水沖洗3次，緩沖磷酸甘油封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞，通過RIPA裂解液裂解并收集，4℃ 12 000 r/min離心30 min，收集上清。對提取的總蛋白進(jìn)行定量和變性，按20 μg/孔上樣并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，濃度為NeuroD2（1∶500）和β-actin（1∶1 000）的一抗中4℃孵育過夜。0.01 mol/L TBST洗膜后加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶10 000），37℃孵育2 h，0.01 mol/L TBST清洗4次，ECL顯影曝光，使用Ipwin 32軟件對條帶進(jìn)行灰度值掃描。

1.2.9 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖表采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 NeuroD2基因的擴(kuò)增與克隆

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見一條1 200 bp左右條帶，與目的基因大小相符（圖1-A）；克隆后的陽性質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Bam HI酶切后可見2 500 bp和1 200 bp左右條帶，結(jié)果與預(yù)期大小相近（圖1-B）。

圖1 大鼠Neuro D2基因RT-PCR產(chǎn)物和pMD20-ND2雙酶切凝膠電泳圖

2.2 pIRES2-AcGFP1-ND2表達(dá)載體的構(gòu)建

重組后的質(zhì)粒pIRES2-AcGFP1-ND2進(jìn)行Nhe I和Bam HI雙酶切，得到兩條片段，長度分別約5 300 bp和1 200 bp，與預(yù)期NeuroD2基因和表達(dá)載體片段大小一致（圖2）。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 NeuroD2基因序列及氨基酸結(jié)構(gòu)分析 通過BLAST比對確定測序所得序列為大鼠NeuroD2基因，利用ORF Finder軟件對所得序列分析結(jié)果表明，該基因CDS區(qū)長為1 149 bp，編碼382個(gè)氨基酸（圖3）。Protparam軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)分子式為C18O6H2981N589O532S6，分子質(zhì)量為4.16 kD，理論等電點(diǎn)為10.74。SOPMA分析發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋與無規(guī)卷曲為主，其中α-螺旋占37.43%、無規(guī)卷曲46.07%、β-折疊占6.58%（圖4-A）。利用SWISS-MODEL對該蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示主要由位于122-180位的氨基酸構(gòu)成“螺旋-環(huán)-螺旋”（bHLH）結(jié)構(gòu)（圖4-B），有12個(gè)位點(diǎn)的氨基酸與bHLH結(jié)構(gòu)的保守位點(diǎn)相符。通過PSORT在線分析，得知NeuroD2蛋白主要存在于細(xì)胞核中（圖4-C），可信度為99。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切凝膠電泳圖

圖3 NeuroD2基因CDS區(qū)及其編碼蛋白的序列

圖4 NeuroD2基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及其細(xì)胞中的定位

2.3.2 NeuroD2蛋白結(jié)構(gòu)及功能域分析 使用Predictprotion與MotifFinder對NeuroD2蛋白結(jié)構(gòu)與功能域進(jìn)行預(yù)測，得出RNA結(jié)合位點(diǎn)位于第104、106-109、122-123、127、131位，DNA結(jié)合位點(diǎn)位于第107-109、123、129位（圖5-A）；180-310位氨基酸形成Neuronal helix-loop-helix 轉(zhuǎn)錄因子，74-147位的氨基酸有可能參與形成60S核糖體亞基形成，81-145氨基酸可能形成CDC45蛋白（圖5-B）。

圖5 NeuroD2蛋白的結(jié)構(gòu)及功能域

圖6 NeuroD2同源性分析圖

2.3.3 同源性分析 通過MegAlign比對發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠NeuroD2氨基酸序列與家鼠、羅猴、人、黑猩猩、牛、Norway鼠、熱帶爪蟾、斑馬魚同源性分別為99%、98%、97.7%、97.7%、97%、93.9%、70.8%和57.1%（圖6-A）；通過MEGA6構(gòu)建的NeuroD2系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，Wistar大鼠、Norway鼠和家鼠的親源性最近（圖6-B）。

圖7 轉(zhuǎn)染后AcGFP1蛋白表達(dá)

2.6 NeuroD2蛋白在小鼠MSCs中的表達(dá)

通過對轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞NeuroD2蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，在41 kD左右位置有明顯的深色條帶（圖9-A），通過Ipwin 32軟件對條帶灰度值進(jìn)行掃描，統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組NeuroD2蛋白表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05）（圖9-B）。對轉(zhuǎn)染細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中NeuroD2蛋白表達(dá)呈陽性（圖9-C），對照組未見明顯表達(dá)（圖9-D）。

3 討論

2.4 轉(zhuǎn)染后MSCs中熒光表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中83%的細(xì)胞有綠色熒光蛋白AcGFP1的表達(dá)（圖7-A），對照組中有57.5%的細(xì)胞有AcGFP1綠色熒光蛋白表達(dá)（圖7-B）。

2.5 NeuroD2基因在小鼠MSCs中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后，Real-time PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組均有NeuroD2基因的表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)組NeuroD2基因表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05）（圖8）。

圖8 NeuroD2轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)結(jié)果

bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為一種調(diào)控蛋白，是真核生物中的一個(gè)大家族，其成員從1989年至今已有1 000多條并在不同生物中已得到驗(yàn)證，在生物的生長發(fā)育調(diào)控過程中起著極為重要的作用，它們參與調(diào)控神經(jīng)元發(fā)生、肌細(xì)胞生成、血細(xì)胞生成、性別決定和組織發(fā)育等［7-9］。

Atchley等［10］對392種蛋白bHLH氨基酸的組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，bHLH家族氨基酸序列具有19個(gè)保守位點(diǎn)，以此建立了bHLH序列的預(yù)測基序，并將判斷是否屬于bHLH家族的標(biāo)準(zhǔn)初步定于19個(gè)保守位點(diǎn)中有11個(gè)以上位點(diǎn)的氨基酸與預(yù)測基序相符。本研究發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠NeuroD2蛋白氨基酸序列中有12個(gè)氨基酸與保守位點(diǎn)基序相符，通過生物信息學(xué)軟件對該蛋白不同結(jié)構(gòu)、表達(dá)部位、功能位點(diǎn)及同源性分析，推測Wistar大鼠NeuroD2基因所編碼蛋白屬于bHLH家族。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子因其所調(diào)控基因的功能不同而分為45個(gè)家族，根據(jù)它們所作用的DNA元件和自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)又被分成6個(gè)組［7］，包括在視網(wǎng)膜細(xì)胞命運(yùn)中起決定作用的NeuroD家族［11］、在內(nèi)耳發(fā)育中起重要作用的Atonal家族［12］以及與大腦皮質(zhì)祖細(xì)胞分化有密切關(guān)系的Ngn家族［13］等。作為bHLH家族中的一員，NeuroD2基因的正常表達(dá)可形成正常的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)神經(jīng)分化，調(diào)高神經(jīng)元生存率［14-16］。NeuroD2水平的降低可導(dǎo)致運(yùn)動失調(diào)，癲癇發(fā)作閾值降低和過早死亡［14］。

隨著對干細(xì)胞研究的不斷深入，通過干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷有可能成為神經(jīng)修復(fù)的新途徑。Qian等［17］研究顯示小鼠MSCs可促進(jìn)軸突再生并有助于星形細(xì)胞中組織纖溶酶原活性的提高。Nakano和Lin等［18，19］將SD大鼠MSCs注入腦脊液用于中樞神經(jīng)損傷（SCI）研究，結(jié)果顯示在亞急性和急性SCI中，MSCs可以提高大鼠運(yùn)動功能，也可以促進(jìn)軸突再生。本課題組在研究紅景天苷誘導(dǎo)大鼠MSCs的分化過程中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)之后細(xì)胞均有β-Tubulin Ⅲ、NSE、MAP2、巢蛋白和GFAP等神經(jīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)［20］。本研究構(gòu)建含NeuroD2基因的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染小鼠MSCs，通過Real-time PCR、Western blot和免疫熒光等方法對NeuroD2基因及蛋白表達(dá)量測定發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，此次構(gòu)建的重組質(zhì)粒上調(diào)小鼠MSCs中NeuroD2基因及蛋白的表達(dá)，可為后續(xù)進(jìn)一步誘導(dǎo)小鼠MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究奠定基礎(chǔ)。

圖9 轉(zhuǎn)染后NeuroD2蛋白表達(dá)結(jié)果

4 結(jié)論

本研究從大鼠大腦中克隆了NeuroD2基因，其CDS區(qū)全長1 149 bp，編碼382個(gè)氨基酸，屬于bHLH家族，該蛋白位于細(xì)胞核，其序列具有較高保守性。構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1-ND2在轉(zhuǎn)染小鼠MSCs后得以表達(dá)，Real-time PCR、Western blot和免疫熒光結(jié)果充分證明，該重組質(zhì)粒可上調(diào)NeuroD2在小鼠MSCs中的表達(dá)量。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Construction of Eukaryotic Expression Vector for NeuroD2 in Rat，and Its Expression in Mouse MSCs

JI Pu-zhong1，2ZHAO Xing-xu1QIN Wen2SONG Xue-wen2ZHANG Yong1ZHAO Hong-bin1，2
（1. College of Life Sciences，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2. Institute of Bone Injury，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA，Lanzhou 730050）

This work aims to clone NeuroD2 gene，construct the eukaryotic expression vector pIRES2-AcGFP1-ND2，and analyze its expression in mouse MSCs. The rat NeuroD2 gene was cloned by RT-PCR，and the protein structure，functional domain，cell localization and homology with other species were analyzed. The constructed pIRES2-AcGFP1-ND2 expression vector was transfected to mouse bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs）. The expression of the recombinant plasmid in the mouse MSCs was detected by real time-PCR，Western blot and immunofluorescence. The results showed that，the length of CDS in rat NeuroD2 gene was 1149 bp，and it encoded 382 amino acids，belonging to bHLH family. The secondary structure mainly composed of the α-helices and random coil. Tertiary structure of NeuroD2 was a“helix-loop-helix” structure and mainly localized in nucleus. The NeuroD2 protein of the experimental rat（Rattus norvegicus）shared 99%，98% and 97.7% homology with Mus musculus，Macaca mulatta and Homo sapiens，respectively. The results of real-time PCR，Western blot and immunofluorescence indicated that the expression levels of NueorD2 mRNA and protein in transfected group were significantly higher than that in control group（P ＜ 0.05）. In conclusion，the eukaryotic expression vector pIRES2-AcGFP1-ND2 was constructed successfully.

NeuroD2；gene cloning；bioinformatics；pIRES2-AcGFP1-ND2

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1087

2016-11-29

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81470087），全軍十二五面上項(xiàng)目（CWS11C228）

姬菩忠，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：jipuzhong@163.com

趙興緒，男，博士，研究方向：發(fā)育生物學(xué)；E-mail：zhaoxx@gsau.edu.cn