劉延娟 楊玉梅 劉嫻 高艷秀 袁航 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 云南省生物質(zhì)能源和環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部生物質(zhì)能源持續(xù)發(fā)展和應(yīng)用工程研究中心，昆明 650500）

甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性

劉延娟 楊玉梅 劉嫻 高艷秀 袁航 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 云南省生物質(zhì)能源和環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部生物質(zhì)能源持續(xù)發(fā)展和應(yīng)用工程研究中心，昆明 650500）

由焦磷酸（PPi）驅(qū)動(dòng)的膜整合焦磷酸酶（PPase）在生物適應(yīng)逆境方面可能起著重要作用，包括H+-PPase、Na+-PPase和Na+，H+-PPase三個(gè)亞家族。相比于H+-PPase，其它兩個(gè)亞家族PPase近年來才在原核生物（特別是動(dòng)物腸道菌）中被發(fā)現(xiàn)，有關(guān)它們的應(yīng)用研究更是匱乏。通過兩輪巢式PCR從人腸道宏基因組中擴(kuò)增得到甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶（CmPP）全長(zhǎng)基因。序列分析表明該基因含有一個(gè)完整的ORF（長(zhǎng)2 100 bp，編碼一個(gè)699 aa的蛋白質(zhì)，G+C含量為59.9 %，堿基分布均衡）。膜拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)CmPP是一個(gè)由16個(gè)跨膜α螺旋組成的膜蛋白，與目前已鑒定過的膜PPase跨膜結(jié)構(gòu)相符。序列比對(duì)分析推測(cè)CmPP屬于K+依賴型Na+，H+-PPase亞家族成員。另外，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得了CmPP轉(zhuǎn)基因煙草。對(duì)其子一代植株的抗旱分析發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫條件下CmPP轉(zhuǎn)基因株系的干物質(zhì)含量、總?cè)~綠素含量和根系活力均下降，而其葉片MDA含量和電解質(zhì)滲透率均升高，但相同脅迫下的變化程度都顯著低于野生型煙草。這些結(jié)果表明CmPP基因的導(dǎo)入能夠有效提高煙草的抗旱能力。

甲基戊糖梭菌；膜整合焦磷酸酶；基因克?。晦D(zhuǎn)基因煙草；抗旱性

地球早期生命和逆境條件下的現(xiàn)世生物似乎依賴焦磷酸（PPi）而不是腺苷三磷酸（ATP）作為主要能源來維持生存。其中，由PPi驅(qū)動(dòng)的膜整合焦磷酸酶（PPase）可能作為主要的H+、Na+泵產(chǎn)生跨膜電化學(xué)離子梯度，推動(dòng)ATP生成、物質(zhì)運(yùn)輸以及其它相關(guān)的生物學(xué)過程［1-3］。根據(jù)被轉(zhuǎn)運(yùn)離子（Na+、H+或兩者）的特異性，膜PPase可分為3個(gè)同源亞家族Na+-PPase、H+-PPase、Na+，H+-PPase。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示H+-PPase和Na+，H+-PPase是由其共同前身Na+-PPase獨(dú)立進(jìn)化形成［1］。所有膜PPase都形成一個(gè)同源二聚體功能形式，并在膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（16-17個(gè)跨膜α螺旋）和關(guān)鍵氨基酸殘基上具有高度的保守性［1，4］。另外，根據(jù)某個(gè)特定位置的氨基酸殘基是Ala或Lys，膜PPase還可分為K+依賴型或K+非依賴型［5］。

具有H+泵活性的膜H+-PPase廣泛存在于包括古生菌、真細(xì)菌、植物和原生動(dòng)物在內(nèi)的生物三界中，發(fā)現(xiàn)最早和研究得最多，特別是近十幾年來在構(gòu)建抗逆生物尤其是植物方面的應(yīng)用已十分矚目［3，6，7］。過表達(dá)同源或異源H+-PPase的各種轉(zhuǎn)基因植物在諸多逆境條件（如高鹽、干旱、氮磷鉀營(yíng)養(yǎng)虧缺、重金屬污染等）下都表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗性或耐受性［8-13］。相比較，其它兩個(gè)亞家族PPase（Na+-PPase和Na+，H+-PPase）最近幾年才僅在原核生物（主要是一些高鹽、缺氧等極端環(huán)境下的古生菌和細(xì)菌，難以分離培養(yǎng)）中發(fā)現(xiàn)［14，15］，而且宏基因組分析顯示人腸道許多厭氧微生物中含有Na+，H+-PPase和/或Na+-PPase基因（其中一些已得到鑒定）［15］，這不僅深度暗示出它們對(duì)原始生物體應(yīng)對(duì)早期地化環(huán)境（當(dāng)世還有遺存）的重要性，同時(shí)也反映出H+-PPase對(duì)現(xiàn)世植物適應(yīng)逆境的關(guān)鍵作用。對(duì)它們的生化研究表明這兩者都具有Na+泵活性，Na+，H+-PPase和低Na+條件下的Na+-PPase還具有H+泵活性［15，16］。不過，目前還沒有任何關(guān)于它們用于提高植物抗逆性的研究報(bào)道。

本研究選定甲基戊糖梭菌的膜整合PPase（CmPP，推測(cè)是Na+，H+-PPase亞家族成員）［15］，通過PCR直接從人腸道宏基因組中克隆其基因，并對(duì)其轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行抗旱分析，以檢驗(yàn)它在植物中的抗逆作用。

1 材料與方法

表1 本研究中所用引物

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株LBA4404以及載體pET32a（+）、pBI121均為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶（Nde I、Sac I、Nco I、EcoR V和Sma I）、T4 DNA連接酶、DreamTaq 和Pfu DNA聚合酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；糞便基因組、質(zhì)粒和植物基因組DNA提取試劑盒以及DNA凝膠純化試劑盒購(gòu)自北京Tiangen公司；PCR mix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為北京Transgene公司產(chǎn)品；其它生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物（表1）合成和DNA測(cè)序均由北京華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 CmPP的基因克隆 根據(jù)NCBI GenBank中已有的甲基戊糖梭菌菌株DSM 5476重疊群（contig C_methylpentosum-1.0.1_Cont6.6） 序 列（ 登 錄 號(hào)ACEC01000124），設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（CmPP-Fw/CmPP-Rv、CmPP-5Nd/CmPP-3Sc），從人腸道中擴(kuò)增和克隆甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因CmPP。參照Tiangen公司的糞便基因組DNA提取試劑盒說明書提取新鮮糞便的宏基因組DNA。取1 μL作模板，使用引物CmPP-Fw和CmPP-Rv和DreamTaq DNA聚合酶進(jìn)行第一輪PCR，程序?yàn)椋?5℃ 5 min；（94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min）×30；72℃ 10 min。 然后，直接取0.5 μL第一輪PCR產(chǎn)物作模板，使用引物CmPP-5Nd和CmPP-3Sc和DreamTaq DNA聚合酶進(jìn)行第二輪PCR，程序?yàn)椋?5℃ 5 min；（94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2.5 min）×1；（94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 2.5 min）×30；72℃ 10 min。CmPP PCR產(chǎn)物純化后先用酶Nco I和EcoR V進(jìn)行鑒定，然后用Nde I和Sac I雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的載體pET32a（+）片段連接，構(gòu)建成其大腸桿菌表達(dá)載體pET（CmPP）。重組克隆用CmPP基因本身上下游引物CmPP-5Nd、CmPP-3Sc通過菌落PCR鑒定，并使用載體上靶基因兩側(cè)的T7啟動(dòng)子通用引物和T7終止子下游引物Tt7Dw-Rv進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 CmPP的生物信息學(xué)分析 DNA和蛋白質(zhì)序列分析采用Vector NTI 11.0 軟件。蛋白質(zhì)跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用在線程序TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM）。DNA和蛋白質(zhì)的序列比對(duì)在NCBI網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上進(jìn)行。

1.2.3 CmPP的植物表達(dá)載體構(gòu)建及其煙草遺傳轉(zhuǎn)化 以質(zhì)粒pET（CmPP）DNA為模板，利用高保真的Pfu DNA 聚合酶和引物CmPP-5Sm、Tt7Dw-Rv將CmPP基因重新擴(kuò)增出來。目的PCR片段經(jīng)純化后通過Sac I酶切，然后與經(jīng)Sma I、Sac I雙酶切的載體pBI121大片段連接，構(gòu)建成其植物表達(dá)載體pBI（CmPP）。重組克隆用載體上游引物35SPro-Fw和CmPP基因下游引物CmPP-3Sc通過菌落PCR鑒定。載體pBI（CmPP）通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，轉(zhuǎn)化菌落通過PCR鑒定（使用引物35SPro-Fw、CmPP-3Sc）。然后，按照常規(guī)的農(nóng)桿菌葉盤侵染法轉(zhuǎn)化煙草。使用試劑盒提取CmPP轉(zhuǎn)化再生煙草植株的基因組總DNA，然后以其為模板通過兩對(duì)交叉引物（35SPro-Fw/CmPP-mRv、CmPP-mFw/NosTer-Rv）進(jìn)行PCR鑒定，得到CmPP的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株。

1.2.4 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗旱性分析 選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙草幼苗（包括CmPP轉(zhuǎn)基因株系和野生型），停止?jié)菜? d后，進(jìn)行干旱處理：對(duì)照（正常澆水）、中度干旱脅迫（土壤含水量為其最大持水量的40%，即40% FWC）、重度干旱脅迫（20% FWC），每天監(jiān)測(cè)土壤含水量，并采用定量灌溉維持各干旱處理的持水量水平。每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)重復(fù)，植株生長(zhǎng)30 d后取樣測(cè)定以下指標(biāo)：（1）將處理苗洗凈晾干后分開根、莖、葉，稱取各部分重量即為鮮重（FW），然后將各部分在115℃烘箱內(nèi)殺青15 min后于70℃烘至恒重，稱取各部分重量即為干重（DW），并因此計(jì)算出各部分的干重比（%）。（2）參考王學(xué)奎［17］的方法測(cè)定處理苗的葉片總?cè)~綠素含量（mg·g-1DW）和根系活力（mg·g-1·h-1DW）。（3）分別采用硫代巴比妥酸（TBA）法和電導(dǎo)儀法測(cè)定處理苗的葉片丙二醛（MDA）含量（μmol·g-1DW）和電解質(zhì)滲透率（%）［17］。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用軟件SPSS 11.5，作圖采用軟件SigmaPlot 12.0。

2 結(jié)果

2.1 CmPP的基因克隆

以新鮮糞便中提取的人腸道宏基因組總DNA作為模板，經(jīng)第一輪PCR擴(kuò)增后，沒有檢測(cè)到預(yù)期大?。s2.3 kb）的目的PCR條帶，但有非特異性較小片段。直接取第一輪PCR產(chǎn)物0.5 μL作模板進(jìn)行第二輪PCR（巢式擴(kuò)增），發(fā)現(xiàn)有明亮的、大小正確（約2.1 kb）的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物CmPP。而且，CmPP的 PCR片段純化后分別用Nco I和EcoR V酶切鑒定，結(jié)果也與預(yù)期完全一致；接著將它通過Nde I和Sac I雙酶切克隆到載體pET32a（+）中，獲得了其陽(yáng)性重組載體pET（CmPP）。

2.2 CmPP的生物信息學(xué)分析

對(duì)重組質(zhì)粒pET（CmPP）進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果（圖1）表明擴(kuò)增到的CmPP基因含有一個(gè)完整的、長(zhǎng)2 100 bp的開放閱讀框（ORF），編碼一個(gè)699 aa的蛋白質(zhì)（理論分子量為72.3 kD，等電點(diǎn)為6.14）。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已有對(duì)應(yīng)序列（登錄號(hào)ACEC01000124）進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的CmPP基因序列有13個(gè)堿基點(diǎn)突變（絕大多數(shù)為T?C、A→G），但僅造成2個(gè)非關(guān)鍵氨基酸的改變（T365C→L122S、A880T→N294Y）。該基因的G+C含量為59.9 %，堿基分布較均衡。

通過在線程序TMHMM對(duì)CmPP蛋白進(jìn)行膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)CmPP是一個(gè)由16個(gè)跨膜α螺旋組成的膜蛋白，其N端沒有信號(hào)肽序列，而且兩個(gè)短末端凸出在外，但背向細(xì)胞質(zhì)側(cè)即外側(cè)（圖2），這與目前已經(jīng)鑒定過的膜PPase的一致結(jié)構(gòu)相符合［1，4］。

圖1 CmPP基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的蛋白序列

以CmPP蛋白序列為檢索序列，對(duì)NCBI中非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Nr進(jìn)行Blastp比對(duì)，發(fā)現(xiàn)跟CmPP親緣關(guān)系最近的直系同源物是與甲基戊糖梭菌共存于人腸道的厭氧柔嫩梭菌（Clostridium leptum）的膜整合焦磷酸酶（登錄號(hào)ZP_02078667），它已被鑒定為Na+，H+-PPase［15］。由此推測(cè)，CmPP很可能屬于Na+，H+-PPase亞家族成員。另外，CmPP蛋白中第474位（圖1）是對(duì)應(yīng)于羧熱產(chǎn)氫菌（Carboxydothermus hydrogenoformans）H+-PPase第460位的Ala殘基，說明CmPP是K+依賴型膜PPase［5］。

2.3 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得

CmPP基因通過引物對(duì)CmPP-5Sm/Tt7Dw-Rv從質(zhì)粒pET（CmPP）模板重新擴(kuò)增出來后，經(jīng)酶切克隆到植物載體pBI121中，構(gòu)建成其植物表達(dá)載體pBI（CmPP）。由于上游引物CmPP-5Sm中引入了翻譯增強(qiáng)元件——kozak序列，理論上應(yīng)該可以使CmPP在其轉(zhuǎn)基因植株中得到有效表達(dá)。

通過農(nóng)桿菌葉盤侵染法，對(duì)植物載體pBI（CmPP）進(jìn)行了煙草轉(zhuǎn)化，并獲得了大量的再生煙草植株。通過基因組PCR對(duì)其中17株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)兩對(duì)引 物（35SPro-Fw/CmPPm-Rv、CmPPm-Fw/ NosTer-Rv）的交叉鑒定結(jié)果完全一致：3號(hào)、7號(hào)、15號(hào)植株與野生型煙草一樣都沒有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；而其他14株均有明亮的PCR主條帶，且大小正確：引物對(duì)35SPro-Fw/CmPPm-Rv和CmPPm-Fw/ NosTer-Rv分別能擴(kuò)增出約1.2 kb（圖3-A）和1.6 kb（圖3-B）的DNA條帶。這表明17個(gè)CmPP轉(zhuǎn)化再生植株中有14個(gè)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，CmPP農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草的陽(yáng)性率達(dá)到了82%以上。

2.4 CmPP提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性

干旱會(huì)破壞植物光合系統(tǒng)、造成細(xì)胞膜損傷和影響根吸收能力從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究選取了9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)這3個(gè)CmPP轉(zhuǎn)基因煙草株系（分別命名為CmPP-9、CmPP-11、CmPP-12），對(duì)其子一代植株進(jìn)行了抗旱性分析，測(cè)定其多個(gè)相關(guān)生理指標(biāo)，包括干重比、總?cè)~綠素含量、根系活力、MDA含量和電解質(zhì)滲漏率。

圖2 在線程序TMHMM預(yù)測(cè)的CmPP蛋白膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

圖3 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR鑒定

由圖4可以看出，3個(gè)CmPP轉(zhuǎn)基因株系和野生型（WT）煙草的根、莖、葉干物質(zhì)含量在正常澆水（對(duì)照）條件下各自差異很小，而在干旱脅迫條件下均下降，且隨脅迫強(qiáng)度增加而愈加明顯，但相同脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系的下降程度顯著低于野生型煙草。在中度干旱（40% FWC）脅迫條件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（CmPP-9、CmPP-11、CmPP-12）相比野生型煙草的根干重比依次高出79.3%、69.1%、70.4%，莖干重比依次高出27.4%、22.4%、16.6%，葉干重比依次高出79.3%、78.9%、70.4%；而在重度干旱（20% FWC）脅迫條件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草的根、莖、葉各部分干物質(zhì)含量相比對(duì)照條件下普遍下降了一半以上，但前者仍然比后者的根干重比依次高出68.3%、67.3%、58.8%，莖干重比依次高出1.2倍、1倍、98.3%，葉干重比依次高出1倍、79.8%、77.8%。

由圖5看出，3個(gè)CmPP轉(zhuǎn)基因株系和野生型（WT）煙草的總?cè)~綠素含量和根系活力在正常澆水（對(duì)照）條件下幾無差異，而在干旱脅迫條件下均降低，且隨脅迫強(qiáng)度增加而愈加嚴(yán)重，但相同脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系的下降程度顯著低于野生型煙草。在中度干旱（40% FWC）脅迫條件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（CmPP-9、CmPP-11、CmPP-12）相比野生型煙草的總?cè)~綠素含量依次高出36.1%、26.2%、18.9%，根系活力依次高出29.3%、24.2%、12.1%；而在重度干旱（20% FWC）脅迫條件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草的總?cè)~綠素含量和根系活力分別下降到不及對(duì)照條件下的10%和60%，但前者仍比后者的總?cè)~綠素含量依次高出1.4倍、1.3倍、1.1倍，根系活力依次高出84.3%、68.7%、47.1%。

由圖6可以看出，3個(gè)CmPP轉(zhuǎn)基因株系和野生型（WT）煙草的葉片MDA含量和電解質(zhì)滲透率在正常澆水（對(duì)照）條件下沒有明顯差異，而在干旱脅迫條件下均升高，且隨脅迫加劇而呈增加趨勢(shì)，但相同脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系的升高程度顯著低于野生型煙草。在中度干旱（40% FWC）脅迫條件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（CmPP-9、CmPP-11、CmPP-12）相比野生型煙草的MDA含量分別低出25%、18.1%、11.5%，盡管兩者的電解質(zhì)滲透率接近；而在重度干旱（20% FWC）脅迫條件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草的葉片MDA含量和電解質(zhì)滲透率分別已升高到對(duì)照條件下的2倍和1.2倍以上，但前者仍然比后者的MDA含量依次低出28.8%、25.7%、20.2%，電解質(zhì)滲透率依次低出14.5%、16.8%、7%。

另外，3個(gè)CmPP轉(zhuǎn)基因株系在中度和重度干旱脅迫條件下的生長(zhǎng)均要好于野生型煙草，但隨干旱程度加劇受抑制越明顯；而對(duì)照（正常澆水）條件下兩者的生長(zhǎng)狀況相似，且都好于干旱脅迫條件下（結(jié)果未顯示）。結(jié)合上面抗旱生理測(cè)定結(jié)果，可以推定CmPP能夠顯著提高其轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗旱能力。

圖4 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草在干旱脅迫下的干物質(zhì)含量比較

圖5 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草在干旱脅迫下的總?cè)~綠素含量和根系活力比較

3 討論

膜整合PPase與生物適應(yīng)逆境密切相關(guān)，其一個(gè)進(jìn)化分支形成的H+-PPase亞家族在提高植物諸多抗逆性方面（如抗鹽、干旱、磷氮鉀營(yíng)養(yǎng)缺乏、重金屬污染等）功效均十分突出［6-13］；比較其另外兩個(gè)亞家族Na+-PPase、Na+，H+-PPase由于發(fā)現(xiàn)較晚，研究得少，還沒有用于提高植物抗逆性的報(bào)道。

當(dāng)前，各種環(huán)境生物已廣被用來挖掘新的抗逆基因［18-21］，而人或其它動(dòng)物的腸道宏基因組可能是獲得Na+-PPase、Na+，H+-PPase基因的理想來源［15］。本研究選定源自甲基戊糖梭菌的膜整合PPase（CmPP），通過PCR直接從人腸道宏基因組中成功克隆到了其全長(zhǎng)基因。生物信息學(xué)分析顯示CmPP是一個(gè)具有16個(gè)跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)并屬于K+依賴型的Na+，H+-PPase亞家族成員，具備膜PPase的保守結(jié)構(gòu)特性和Na+-轉(zhuǎn)運(yùn)PPase共有對(duì)K+的依賴特性［1，4］。但是，可能由于人腸道微生物的多樣性和不均一性［22，23］，擴(kuò)增CmPP基因絕對(duì)需要兩輪巢式PCR才能成功，這與我們先前從水體宏基因組中擴(kuò)增一藍(lán)藻基因類似［20］。另外，由于人類宏基因組具有大陸和民族特異性，并受飲食、藥物等攝入因子的影響［22］，因此本研究擴(kuò)增到的CmPP基因與GenBank中的對(duì)應(yīng)核苷酸序列（登錄號(hào)ACEC01000124）有一定程度的差異（但只有2個(gè)非關(guān)鍵氨基酸的改變）是可以理解的。

還有，CmPP基因的G+C含量為59.9%，堿基分布較均衡，不像許多其他類似的膜PPase基因含有高比例AT堿基和容易出現(xiàn)真核基因的聚腺苷化信號(hào)。這樣，不僅有利于基因擴(kuò)增，而且也適合于對(duì)高等植物的轉(zhuǎn)基因研究。事實(shí)上，本研究獲得的CmPP轉(zhuǎn)基因煙草具有顯著提高的抗旱性，應(yīng)該是CmPP基因?qū)氡磉_(dá)發(fā)揮了作用。

干旱是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要逆境因子，目前已通過遺傳、分子和生化等研究手段鑒定出許多關(guān)鍵基因，功能涉及到脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA轉(zhuǎn)錄后修飾和蛋白翻譯后修飾、滲透保護(hù)劑代謝、抗氧化系統(tǒng)、分子伴侶等方面，調(diào)控植物在形態(tài)和生理水平上對(duì)干旱的應(yīng)答以及抗旱性形成［24，25］。在這些基因相關(guān)的植物抗旱遺傳工程研究中，H+-PPase占據(jù)重要一席［6-13］，目前公認(rèn)由其介導(dǎo)的植物抗旱性與其酶活性調(diào)節(jié)液泡滲透功能以及促進(jìn)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸和根系發(fā)育有關(guān)［7］。生化研究表明已鑒定的Na+，H+-PPase和低Na+條件下的Na+-PPase都具有H+泵活性［15，16］，而屬于Na+，H+-PPase家族的CmPP理應(yīng)具有H+泵活性和與H+-PPase相似的功效。因此，本研究中CmPP基因?qū)氪龠M(jìn)煙草抗旱性的提高是合乎預(yù)期的。而且，我們發(fā)現(xiàn)CmPP也能顯著增強(qiáng)其轉(zhuǎn)基因煙草的抗鹽性，具備H+-PPase的同樣特性［6，8，10］，這部分結(jié)果將在另文報(bào)道。我們計(jì)劃下一步檢驗(yàn)CmPP轉(zhuǎn)基因煙草是否具有提高的抗?fàn)I養(yǎng)（氮、磷或鉀）貧瘠性。總之，本研究中得到的CmPP基因可為植物尤其是農(nóng)作物抗逆基因工程研究提供一個(gè)新的功能基因選擇。

圖6 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草在干旱脅迫下的MDA含量和電解質(zhì)滲透率比較

4 結(jié)論

本研究通過PCR直接從人腸道宏基因組中擴(kuò)增得到甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因CmPP。生物信息學(xué)分析顯示該基因含有一個(gè)完整的ORF，推導(dǎo)蛋白CmPP（699 aa）是一個(gè)具有由16個(gè)α螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)、并且屬于K+依賴型的Na+，H+-PPase亞家族成員；另外，通過對(duì)其轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗旱性分析驗(yàn)證了CmPP基因具備提高植物抗旱性的潛力。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Membrane-bound Pyrophosphatase of Clostridium methylpentosum Increases the Drought Resistance of Its Transgenic Tobacco

LIU Yan-juan YANG Yu-mei LIU Xian GAO Yan-xiu YUAN Hang GONG Ming ZOU Zhu-rong
（Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy，Ministry of Education；Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province；School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650500）

Pyrophosphate（PPi）-energized membrane-bound pyrophosphatases（PPases）are composed of three subfamilies including H+-PPase，Na+-PPase and Na+，H+-PPase，and may play important roles in stress adaptation of organisms. In contrast to H+-PPase，other two PPase subfamilies were recently detected only in prokaryotes（especially animal gut microbial），certainly with scarce application researches. In this study，through two rounds of nested PCR，we amplified the full-length gene of the membrane-bound PPase of Clostridium methylpentosum（CmPP）from human gut metagenome. As indicated by sequence analysis，the CmPP gene contained an entire ORF of 2100 bp encoding a protein of 699 aa，with the G+C percentage of 59.9 % and balanced base distribution. Topological prediction showed CmPP as a multi-spanning membrane protein consisting of 16 transmembrane α-helix segments，in accordance with the membrane topological model of those known membrane PPases. Furthermore，sequence alignment analysis implicated CmPP as a K+-dependent member of Na+，H+-PPase subfamily. In addition，we obtained the CmPP transgenic tobacco plants through Agrobacterium transformation. Under drought stress conditions，the F1plants of CmPP transgenic lines had decreased values in dry matter content，total chlorophyll content and root activity，but increased values in leaf MDA content and electrolyte permeability. However，all these changes in transgenic lines were significantly lower than those in wildtype tobacco under the same stress. Conclusively，our results indicated that introduction of the CmPP gene efficiently improved the drought resistance in tobacco.

Clostridium methylpentosum；membrane-bound pyrophosphatase；gene cloning；transgenic tobacco；drought resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1208

2017-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160169，31460067）

劉延娟，女，碩士研究生，研究方向：植物逆境生物學(xué)；E-mail：2271937509@qq.com

鄒竹榮，男，博士，教授，研究方向：植物逆境生物學(xué)；E-mail：zouzr09@sina.com