徐巖 韓玉乾 于放 劉志文 王燕燕

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034）

研究報告

過表達長春花JAR1基因促進文朵靈和長春質(zhì)堿的生物合成

徐巖 韓玉乾 于放 劉志文 王燕燕

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034）

通過克隆長春花JAR1基因并在長春花葉片中瞬時過表達，研究該基因?qū)ξ亩潇`及長春質(zhì)堿生物合成的調(diào)控。以總cDNA為模板，克隆JAR1基因，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pBIGD-JAR1。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)化長春花葉片后，利用半定量RT-PCR與高效液相分析JAR1過表達對文朵靈及長春質(zhì)堿合成的影響。結(jié)果顯示，成功從長春花葉片中克隆1 700 bp左右的JAR1基因；瞬時轉(zhuǎn)化pBIGD-JAR1的長春花葉片中JAR1基因的轉(zhuǎn)錄水平高于空載體對照；JAR1的過表達誘導(dǎo)了合成途徑中關(guān)鍵酶基因CrTDC、CrG10H、CrDL7H、CrSTR、CrLAMT的表達，以及文朵靈和長春質(zhì)堿的積累。結(jié)合實驗結(jié)果分析，JAR1基因過表達可能通過促進茉莉酸（JA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)關(guān)鍵代謝途徑酶基因的表達進而促進長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿的積累。

長春花；長春質(zhì)堿和文朵靈；茉莉酸；茉莉酸異亮氨酸共軛物合酶；次生代謝調(diào)控

藥用植物長春花（Catharanthus roseus）為夾竹桃科（Apocynaceae）植物，是長春花屬（Catharanthus）的一種多年生草本植物。長春花中的單萜吲哚生物堿文朵靈和長春質(zhì)堿作為抗腫瘤藥物具有重要的臨床應(yīng)用價值［1］。但由于植物體內(nèi)含量只有千分之幾［2］，因此如何提高長春花中次生代謝產(chǎn)物的含量一直備受關(guān)注。植物激素能夠顯著促進次生代謝產(chǎn)物的積累［3，4］，并且研究表明，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）作為信號分子能夠促進長春花中的次生代謝產(chǎn)物文朵靈和長春質(zhì)堿的合成［5，6］。而JA需要在茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）合成酶（JAR1）的作用下形成JA與異亮氨酸聚合物［7］，進而通過與下游受體蛋白作用實現(xiàn)JA信號的級聯(lián)放大［8］，而長春花中的JAR1基因以及功能研究尚無報道。因此，本文利用分子克隆手段、瞬時表達技術(shù)將長春花中JAR1基因通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化長春花葉片，并分析其對長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿合成途徑關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平以及代謝產(chǎn)物的積累的影響，以期通過調(diào)控JA信號通路進而實現(xiàn)促進長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿的生物合成。

表1 實驗所用引物序列

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與植物材料 根瘤農(nóng)桿菌GV3101與長春花種子為本實驗室保藏；植物激素JA、長春質(zhì)堿和文朵靈的標(biāo)準(zhǔn)品均購買于阿拉??；pGM-T載體購自天根生化科技有限公司；農(nóng)桿菌GV3101購自上海邁其生物科技有限公司；RNA提取所需的TRNzol Reagent試劑，降解RNA中的DNA試劑RNase free DNase I，反轉(zhuǎn)錄所需的TIAN Script M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，PCR所需要的Taq DNA Polymerase DNA聚合酶，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均來自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自寶生物；瓊脂糖凝膠來自美國Promega公司。其他分析純試劑來自國產(chǎn)。

1.1.2 引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 長春花總RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄PCR 選取新鮮的長春花葉片組織與2粒經(jīng)過DEPC水處理的氧化鋯珠子放入2 mL離心管后經(jīng)高通量組織研磨儀進行組織破碎。破碎后的長春花葉片經(jīng)TRIzol法提取總RNA。并以此RNA為模板，經(jīng)DNaseⅠ處理后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。

1.2.2 JAR1基因擴增以及重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)與擬南芥中同源序列比對，在長春花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲取長春花JAR1基因序列。并依據(jù)此序列設(shè)計引物（表1），利用巢式PCR方法擴增JAR1 基因。膠回收純化目的基因，加A尾后連接至pGM-T載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選及PCR鑒定陽性克隆。選擇陽性克隆擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，然后利用Kpn I與 Sac I進行雙酶切，酶切所得的基因目的片段與同樣經(jīng)Kpn I與 Sac I雙酶切的雙元載體pBIGD連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得表達載體pBIGD-JAR1。陽性克隆經(jīng)PCR、酶切鑒定后測序。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與鑒定 將活化好的農(nóng)桿菌GV3101挑取單菌落在50 mL的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的菌體冰上預(yù)冷后離心去上清，菌體中加入1 mL 預(yù)冷的20 mmol/L CaCl2及50 μL DMSO輕輕混勻，懸浮菌體。冰上分裝后，分別將取2 μL質(zhì)粒pBIGD、pBIGD-JAR1加入并混勻，在液氮中冷凍5 min后，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)5 min。再加入1 mL 新鮮LB培養(yǎng)基，180 r/min，30℃培養(yǎng)2 h。離心、去掉大部分上清，菌體混勻后涂到含抗生素的LB平板上，28℃ 倒置培養(yǎng)過夜。分別使用特定引物PCR鑒定陽性克隆。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化 挑選成功轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的GV3101單菌落擴大培養(yǎng)，離心收集菌體，用10 mL緩沖液（MES 20 mmol/L，MgCl210 mmol/L，Acetosyringone 200 μmol/L，pH 5.6）懸浮細胞，并在28℃下、180 r/min震蕩3 h。然后通過注射方法侵染長春花莖尖分生組織。將處理過的植物放置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱，光照條件為16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)3-4周后收集農(nóng)桿菌侵染部位上方葉片進行下一步的分析。

1.2.5 JAR1瞬時表達鑒定以及長春花合成途徑關(guān)鍵酶基因的半定量RT-PCR分析 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化處理后3周左右，即第三對新葉長出，選取新生長的3對葉片，左側(cè)葉片用來提取總RNA檢測關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，右側(cè)葉片用于分析次級代謝產(chǎn)物長春質(zhì)堿和文朵靈。長春花中文朵靈與長春質(zhì)堿合成途徑如圖1所示。利用特定引物對JAR1以及文朵靈和長春質(zhì)堿生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因CrDL7H、CrLAMT、CrTDC、CrG10H、CrSTR進行半定量RT-PCR，使用引物如表1所示，并通過Image J軟件進行定量分析。

圖1 長春花中文朵靈與長春質(zhì)堿合成途徑［4］

1.2.6 長春花中長春質(zhì)堿和文朵靈的檢測 將收集的右側(cè)葉片分別放到對應(yīng)的2 mL離心管內(nèi)，計算濕重。在每個離心管加入2粒氧化鋯珠子并經(jīng)高通量組織研磨儀進行組織破碎。通過甲醇浸泡與超聲處理，離心收集上清。重復(fù)萃取3次，合并上清液。將收集的甲醇提取液經(jīng)冷凍濃縮離心干燥至干粉。然后加入1 mL甲醇溶解（超聲）。將甲醇溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，液相色譜分析文朵靈及長春質(zhì)堿的含量。液相條件為C18色譜柱，流動相為乙腈（V）：水（V）=30%：70%，檢測波長310 nm（文朵靈）與280 nm（長春質(zhì)堿），流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫為30℃。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品的峰面積計算文朵靈和長春質(zhì)堿含量。

2 結(jié)果

2.1 長春花葉片總RNA提取與目的基因的擴增

利用TRIzol法提取長春花葉片的總RNA（圖2-A），用于目的基因的擴增。RNA經(jīng)DNase I處理好反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板利用特異性引物擴增目的片段，如圖2-B 中1 和2所示，產(chǎn)生了片段大小為1 758 bp以及500-700 bp大小的非特異性條帶，根據(jù)序列分析1 758 bp 大小條帶為JAR1基因。

圖2 長春花葉片總RNA（A）與JAR1的PCR擴增結(jié)果（B）

2.2 pBIGD-JAR1重組質(zhì)粒構(gòu)建

為了研究JAR1在植物體內(nèi)的功能，我們選擇了pBIGD植物雙元載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。首先將擴增的目的基因片段，加A尾后連接pGM-T載體上，轉(zhuǎn)化并鑒定單克隆。如圖3-A，1、2 均為pGMT-JAR1酶切（Kpn I / Sac I）的鑒定結(jié)果，獲得了pGM-T載體與目的基因兩個片段。將酶切獲得的JAR1目的基因與同樣經(jīng)Kpn I / Sac I酶切的pBIGD載體（圖3-A，第三泳道）連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。提取質(zhì)粒后酶切鑒定陽性克隆，如圖3-B 中 1和 2所示，獲得大小為1 758 bp左右JAR1基因，并將其送測序。經(jīng)序列比對一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。序列比對結(jié)果如圖3-C所示，經(jīng)核酸序列比對以及進化分析，發(fā)現(xiàn)CrJAR1與擬南芥中的JAR1即AtJAR1具有極高同源性。

圖3 pBIGD-JAR1重組質(zhì)粒構(gòu)建與進化樹分析

2.3 表達載體農(nóng)桿菌GV3101中的轉(zhuǎn)化

分別設(shè)置了空載體pBIGD作為對照組以及pBIGD-JAR1作為實驗組，將兩組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，轉(zhuǎn)化結(jié)果分別利用PCR進行鑒定。如圖4-A所示，1、2泳道為pBIGD-JAR1，圖4-B的1、2泳道為 pBIGD。結(jié)果表明，實驗組和對照組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

圖4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的克隆PCR鑒定

2.4 JAR1過表達促進長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿合成途徑關(guān)鍵酶基因表達

我們將實驗組（pBIGD-JAR1）和對照組（pBIGD）農(nóng)桿菌擴大培養(yǎng)后，侵染長春花莖尖分生組織，待植物長出新的3對葉片后，分別收集葉片。所收集的左右葉片分別用于RNA的提取以及次生代謝產(chǎn)物的提取。首先，為了分析農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化是否實現(xiàn)了JAR1過表達，我們提取了左側(cè)葉片的總RNA，并利用半定量RT-PCR分析JAR1 基因的表達水平。如圖5-A和5-B所示，與空載體相比，JAR1瞬時表達的葉片中，JAR1基因的轉(zhuǎn)錄水平確實顯著提高，表明本實驗成功實現(xiàn)了在長春花葉片中JAR1基因的過表達。同時，為了分析JAR1是否影響長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達，檢測了長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿合成途徑以及關(guān)鍵酶基因CrDL7H、CrLAMT、CrTDC、CrG10H和CrSTR的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果（圖5-A、圖5-B）顯示，所選取基因的轉(zhuǎn)錄水平與空載體相比較均有很大程度的提高。

圖5 瞬時過表達JAR1基因葉片中的表達水平檢測以及對長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿的合成途徑關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.5 JAR1過表達促進長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿積累

為了分析JAR1過表達是否能夠促進長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿合成的積累，將與左側(cè)葉片相對應(yīng)的右側(cè)葉片利用甲醇提取生物堿，并利用高效液相檢測了瞬時表達JAR1長春花葉片中兩種次生代謝物的含量。結(jié)果如圖6所示，同空載體對照相比，長春質(zhì)堿與文朵靈的含量都有顯著提高。推測JAR1的過表達，提高了共軛物JA-Ile 的合成，進而誘發(fā)了JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)長春花中單萜吲哚生物堿生物合成途徑酶基因的表達，最終促進了次生代謝產(chǎn)物文朵靈和長春質(zhì)堿積累。

圖6 JAR1過表達對長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿積累的影響

3 討論

植物體內(nèi)激素對次生代謝的調(diào)節(jié)報道較多集中在受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［9］，而對于其上游的信號途徑的開關(guān)關(guān)注較少。眾所周知，JA對許多藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累都具有一定促進作用。JA行使功能通常以Me-JA和JA-Ile［7］的形式來實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，JAR1是一種茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）合成酶，被認(rèn)為是擬南芥中JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必須的［8］。合成的JA-Ile與受體蛋白結(jié)合，進而啟動JA應(yīng)答反應(yīng)。

目前長春花JAR1及其功能尚無報道，我們根據(jù)擬南芥JAR1基因序列與長春花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫比對獲得長春花JAR1基因序列，并設(shè)計特異性引物，擴增目的基因，經(jīng)測序及與擬南芥JAR1序列比對，同源性高達82%。將長春花JAR1基因進一步克隆至植物雙元表達載體pBIGD中，并利用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)侵染長春花莖尖分生組織。經(jīng)半定量RT-PCR分析，瞬時轉(zhuǎn)化的長春花葉片中JAR1基因的轉(zhuǎn)錄水平有明顯的提高。

長春花中單萜吲哚生物堿的合成途徑已經(jīng)基本明確，其中有兩條重要的途徑：分別為吲哚途徑（Indole pathway）和類萜途徑（Monoterpenoid pathaway）。在吲哚途徑中，經(jīng)多步酶促反應(yīng)產(chǎn)生色胺（Trytamine），其中最重要的反應(yīng)為L-色氨酸在色氨酸脫羧酶（Tryptophan decar-boxylase，TDC）催化作用下由色氨酸（Tryptophan）生成色胺（Trytamine）。在類萜途徑中經(jīng)由牻牛兒醇10-羥 化 酶（Geraniol 10-hydroxylase，G10H），7-脫氧馬錢苷酸-7-羥化酶DL7H（7-deoxyloganic acid 7-hydroxylase）、馬錢苷酸甲基轉(zhuǎn)移酶（LAMT：loganic acid O-methyltransferase）等酶催化產(chǎn)生裂環(huán)馬錢子苷（Secologanin）［10］。然后，色胺與裂環(huán)馬錢子苷在異胡豆苷合成酶（Strictosi-dinesynthase，STR）的催化下偶合生成長春花所有單萜吲哚生物堿的共同前體物質(zhì)異胡豆苷（Stritosidine），進而生成文朵靈、長春質(zhì)堿、長春堿和長春新堿等生物堿類化合物［11，12］。實驗中我們選取了長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿的合成途徑關(guān)鍵酶基因CrDL7H、CrLAMT、CrTDC、CrG10H以及CrSTR用來分析JAR1過表達對這些關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。同時，利用高效液相檢測長春質(zhì)堿和文朵靈的積累情況。結(jié)果證明，JAR1基因在長春花中的過表達能夠顯著提高合成途徑中CrTDC、CrG10H、CrDL7H等基因的轉(zhuǎn)錄水平，進而大幅度地促進了長春花中文朵靈和長春質(zhì)堿的積累。

4 結(jié)論

成功克隆了長春花JAR1基因，并成功利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)實現(xiàn)JAR1在長春花葉片中的過表達。利用半定量RT-PCR和高效液相色譜分析JAR1對長春花中單萜吲哚生物堿合成途徑酶基因表達的影響以及對文朵靈和長春質(zhì)堿積累的影響。結(jié)果表明，JAR1基因在長春花中的過表達，能夠顯著提高合成途徑中關(guān)鍵酶基因CrTDC、CrG10H、CrDL7H、CrSTR和CrLAMT的表達，促進文朵靈和長春質(zhì)堿的積累。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Promoting the Biosynthesis of Catharanthine and Vindoline in Catharanthus roseus by Overexpressing JAR1

XU Yan HAN Yu-qian YU Fang LIU Zhi-wen WANG Yan-yan
（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034）

This work aims to reveal JAR1 gene regulation roles in the synthesis of catharanthine and vindoline via cloning it from Catharanthus roseus and its transient overexpression in the leaves of C. roseus. The JAR1 gene was cloned using total cDNA as template，and the recombinant plasmid pBIGD-JAR1 was constructed. Transiently transformed to the leaves of C. roseus mediated by Agrobacterium，HPLC and semi-quantitative RT-PCR were utilized to analyze the effects of JAR1 overexpression on the synthesis of catharanthine and vindoline. The results showed that gene JAR1 of 1700 bp was cloned successfully from the leaves of C. roseus，and the transcription of gene JAR1 in the leaves of C. roseus transiently transformed with pBIGD-JAR1was higher than that in the control. The overexpression of JAR1 significantly induced the expressions of key pathway genes（CrTDC，CrG10H，CrDL7H，CrSTR，and CrLAMT）as well as the accumulation of catharanthine and vindoline. The above results suggest that overexpression of JAR1 induce the expressions of key metabolic enzyme genes by promoting the jasmonic acid signal transduction pathway，and subsequently promote the accumulation of catharanthine and vindoline.

Catharanthus roseus；catharanthine and vindoline；jasmonic acid；JAR1；regulation of secondary metabolism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1176

2016-12-29

遼寧省教育廳基本科研業(yè)務(wù)項目（2016J048）

徐巖，女，碩士生，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：m18626654900@163.com

王燕燕，女，博士，研究方向：植物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：wang_yy@dlpu.edu.cn