趙紫霞徐桂彩，2李炯棠楊世勇

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141；2. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，舟山 316022；3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，雅安 625014）

用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測(cè)方法

趙紫霞1徐桂彩1，2李炯棠1楊世勇3

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141；2. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，舟山 316022；3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，雅安 625014）

旨在開發(fā)用于水產(chǎn)品物種鑒定的檢測(cè)方法，以鑒別虹鱒（Oncorhynchus mykiss）假冒大西洋鮭（Salmo salar）的現(xiàn)象。根據(jù)大西洋鮭和虹鱒基因組序列相似性比對(duì)結(jié)果，在核基因肌紅蛋白基因區(qū)設(shè)計(jì)了三對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增引物，分別為大西洋鮭特異性引物、虹鱒特異性引物和鮭鱒通用引物。在上游引物5'端標(biāo)記生物素分子，使擴(kuò)增產(chǎn)物被親和素修飾的電極表面捕獲錨定，在下游引物5'端標(biāo)記二茂鐵分子，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有電化學(xué)信號(hào)。基于以上方法構(gòu)建了電化學(xué)生物傳感體系，通過(guò)循環(huán)伏安信號(hào)檢測(cè)特定擴(kuò)增引物，從而能夠鑒別樣品是否來(lái)源于大西洋鮭或虹鱒。本研究構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確、清潔的特點(diǎn)，能夠用于成魚、魚苗、魚卵、魚肉及其加工制品的物種鑒定，并能夠從混有其他物種DNA的樣品如魚泥中成功檢測(cè)魚肉DNA的物種來(lái)源。

大西洋鮭；虹鱒；物種鑒定；循環(huán)伏安；生物傳感

大西洋鮭（Salmo salar），屬于鮭科（salmonidae）、鮭屬（Salmo），20世紀(jì)60年代在挪威人工養(yǎng)殖成功，目前已經(jīng)成為世界性的養(yǎng)殖魚類，主要以海水網(wǎng)箱的形式養(yǎng)殖生產(chǎn)商品魚［1］。國(guó)內(nèi)大西洋鮭養(yǎng)殖產(chǎn)量較低，但以其為原料制作的三文魚刺身、煙熏三文魚及其它加工產(chǎn)品等很受消費(fèi)者歡迎，在我國(guó)水產(chǎn)品市場(chǎng)上稱為“挪威三文魚”，銷售價(jià)格較高。

虹鱒（Oncorhynchus mykiss），屬于鮭科（Salmonidae）、大馬哈魚屬（Oncorhynchus），自19世紀(jì)起在美國(guó)開始淡水養(yǎng)殖，我國(guó)曾從朝鮮、美國(guó)、日本等國(guó)多次引種，目前在20多個(gè)省市區(qū)都有人工養(yǎng)殖，是國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖范圍較廣的冷水魚類［1］。目前市場(chǎng)上存在部分不法經(jīng)營(yíng)者使用虹鱒來(lái)冒充大西洋鮭［2，3］，向虹鱒飼料中添加色素，使原本為白色、青色的虹鱒肉呈現(xiàn)出類似大西洋鮭的橘紅色澤和紋理，偽稱進(jìn)口的“挪威三文魚”高價(jià)銷售，嚴(yán)重侵害消費(fèi)者權(quán)益。因此，迫切需要建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，用于大西洋鮭和虹鱒的物種鑒定。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的DNA分析成為目前物種鑒定方法的主流。例如，DNA條形碼技術(shù)［4-6］和熒光定量PCR［7-9］等。但DNA條形碼技術(shù)需要對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，成本高且耗時(shí)較長(zhǎng)；熒光定量PCR對(duì)設(shè)備和操作水平的要求較高。本研究致力于開發(fā)用于大西洋鮭和虹鱒物種鑒定的新型檢測(cè)方法，將PCR反應(yīng)與電化學(xué)生物傳感檢測(cè)技術(shù)［10-12］結(jié)合起來(lái)，通過(guò)物種特異性DNA片段的擴(kuò)增和產(chǎn)物循環(huán)伏安信號(hào)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、靈敏、快捷、清潔無(wú)污染的水產(chǎn)品物種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

大西洋鮭、虹鱒成魚：采自山東東方海洋科技股份有限公司、通威三文魚有限公司、北京臥佛山莊養(yǎng)殖有限公司；冰鮮三文魚刺身：購(gòu)自北京岳各莊水產(chǎn)品市場(chǎng)；冷凍和加工三文魚產(chǎn)品：購(gòu)自京東商城；海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP：美國(guó)Thermo Fisher 公司；RNA酶A、Al2O3、納米金（粒徑30 nm，檸檬酸鈉還原氯金酸法制備）溶液、殖-硫辛酸、EDC/NHS羧基活化液、親和素：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；所有引物均由上海生工公司合成；實(shí)驗(yàn)使用去離子水；化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 大西洋鮭和虹鱒基因組數(shù)據(jù)檢索在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）的基因和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行，序列相似性比對(duì)使用NCBI在線BLAST工具和CLC Genomics Workbench軟件完成，引物設(shè)計(jì)使用Primer 3軟件完成。

1.2.2 電極表面修飾 使用Al2O3粉末拋光金圓盤電極（直徑3 mm），分別用乙醇和去離子水在超聲條件下清洗電極表面各10 min，在0.5 mol/L硫酸中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，初始電位-200 mV，折回電位+1 500 mV，掃描速率100 mV/s，至循環(huán)伏安圖不再變化為止。浸入納米金溶液，+1.55 V電位下沉積15 min，靜置5 min，去離子水清洗。

電極表面浸入含10 mmol/L α-硫辛酸的乙醇溶液活化20 min，移入濃度為100 g/L 的EDC/NHS混合液活化羧基，向電極表面滴加0.2 g/L的親和素50 μL，偶聯(lián)30 min，去離子水洗脫未結(jié)合親和素。保存于4℃，pH 7.0 磷酸緩沖液中。

1.2.3 基因組DNA提取與擴(kuò)增 取成魚鰭條，或加工水產(chǎn)品待測(cè)樣品約100 mg，使用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書步驟提取基因組DNA，溶于滅菌去離子水，RNA酶A處理去除RNA污染。使用NanoVue plus紫外分光光度計(jì)（美國(guó)GE）測(cè)定濃度，并調(diào)整DNA濃度在100 ng/μL左右。

定制合成引物序列如表1所示。以2.0 μL基因組DNA為模板，使用Applied Biosystems Veriti 96孔PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher）分別擴(kuò)增大西洋鮭特異性引物、虹鱒特異性引物和鮭鱒通用引物，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋海?）94℃，1 min；（2）94℃，30 s；（3）60℃，30 s；（4）72℃，90 s，返回步驟（2），25個(gè)循環(huán)；（5）72℃，10 min；（6）4℃ 至反應(yīng)終止。

1.2.4 電化學(xué)檢測(cè) 取20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，無(wú)需純化，分別滴加在修飾有生物素的金電極表面，37℃溫育30 min。將DNA修飾電極浸入pH 7.0 Tris-EDTA緩沖液，洗脫5 min，換新的緩沖液重復(fù)洗脫2次。

采用三電極測(cè)試系統(tǒng)，以DNA修飾電極為工作電極，鉑絲（直徑1 mm）為對(duì)電極，Ag/AgCl 為參比電極，20 mL pH 7.0 磷酸緩沖溶液為支持電解質(zhì)，使用283A電化學(xué)工作站（美國(guó)EG&G）測(cè)定循環(huán)伏安曲線，初始電位設(shè)為0 mV，折回電位設(shè)為+ 600 mV，掃描速度設(shè)為50 mV/s，記錄3個(gè)循環(huán)中的第3個(gè)。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)照 基因組DNA提取與擴(kuò)增步驟與1.4相同，PCR反應(yīng)程序中步驟（4）改為35個(gè)循環(huán)。使用含0.5 μg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，在PowerPac電泳儀（美國(guó)BIO-RAD）上電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，90 V，30 min。

2 結(jié)果

2.1 物種特異性序列的篩查和引物設(shè)計(jì)

在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得大西洋鮭（Gene ID：100195613） 和 虹 鱒（Gene ID：100329203）肌紅蛋白（Myoglobin，mb）基因信息，將其與全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)獲得相應(yīng)基因組序列，其中大西洋鮭mb基因位于序列Accession NO：AGKD04001111.1的46 021-54 000堿基（base pair，bp）位置，共計(jì)7 980 bp，虹鱒mb基因位于序列Accession NO：FR908943.1的1-8 040堿基位置，共計(jì)8 040 bp。

序列相似性比對(duì)結(jié)果顯示，兩條序列中長(zhǎng)度為9 736 bp的區(qū)域?yàn)橥葱孕蛄?，同源區(qū)序列一致性（identity）為82.9%，缺失（Gap）比例為10.0%，其中存在3個(gè)序列差異較大的區(qū)域：在虹鱒2 134-2 286 bp區(qū)間，兩個(gè)物種序列長(zhǎng)度相似，但序列一致性僅為37.1%；在虹鱒3 832-3 807 bp區(qū)間，大西洋鮭存在72 bp缺失；在虹鱒5 536-5 537 bp區(qū)間，大西洋鮭存在108 bp插入。因此，物種特異性引物主要在這3段差異序列區(qū)設(shè)計(jì)，大西洋鮭和虹鱒通用引物則在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)，引物序列和修飾信息見表1，引物的位置和序列保守性見圖1-圖3。

表1 引物序列和修飾信息表

圖1 大西洋鮭特異性引物的基因組位置比對(duì)圖

圖2 虹鱒特異性引物的基因組位置比對(duì)圖

圖3 鮭鱒通用引物的基因組位置比對(duì)圖

2.2 物種鑒別檢測(cè)流程設(shè)計(jì)

本研究設(shè)計(jì)的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的電化學(xué)生物傳感檢測(cè)流程如圖4所示：（1）首先對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行DNA提取，后續(xù)PCR反應(yīng)對(duì)模板DNA質(zhì)量要求不高，因而使用各種常規(guī)DNA提取方法如酚-氯仿抽提法、鹽析法及各種市售試劑盒均可；（2）接下來(lái)分別使用3對(duì)引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物帶有錨定分子生物素標(biāo)記，下游引物帶有電化學(xué)指示劑二茂鐵標(biāo)記，若樣品中包含目標(biāo)基因組序列，即可擴(kuò)增得到雙端帶有標(biāo)記的DNA片段，大西洋鮭特異性引物的擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 726 bp，虹鱒為1 627 bp，鮭鱒通用引物的擴(kuò)增長(zhǎng)度為428 bp；（3）然后將各組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別加至修飾有親和素的金電極表面，由親和素充當(dāng)錨定受體，將帶有生物素標(biāo)記的DNA分子穩(wěn)固結(jié)合在電極表面，而未結(jié)合的引物、模板等通過(guò)洗脫反應(yīng)移除；（4）最后，通過(guò)檢測(cè)DNA擴(kuò)增片段另一端標(biāo)記的二茂鐵分子的電化學(xué)信號(hào)，判斷特定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在，鑒別待測(cè)樣品的所屬物種。

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)伏安測(cè)試

大西洋鮭樣品檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。曲線（1）和（3）均呈現(xiàn)明顯的氧化還原峰，表明大西洋鮭特異性引物和鮭鱒通用引物成功擴(kuò)增，樣本中含有大西洋鮭基因組DNA；而曲線（3）無(wú)氧化還原峰，顯示虹鱒特異性引物未能擴(kuò)增，樣本中不含虹鱒基因組DNA。

虹鱒樣品檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，曲線（2）和（3）出現(xiàn)氧化還原峰，而曲線（1）維持未反應(yīng)的平滑狀態(tài)，結(jié)果符合預(yù)期，樣本中含有虹鱒基因組DNA，未檢出大西洋鮭基因組DNA。

圖4 用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的電化學(xué)生物傳感檢測(cè)流程示意圖

圖5 大西洋鮭樣品檢測(cè)的循環(huán)伏安信號(hào)

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究開發(fā)的電化學(xué)生物傳感方法，對(duì)32個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，并使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)，結(jié)果見表2。所有樣品的電化學(xué)檢測(cè)結(jié)果與電泳檢測(cè)結(jié)果均一致。在15例采自不同養(yǎng)殖種群、不同品種的成魚樣品中，檢測(cè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)判定結(jié)果均一致。

圖6 虹鱒樣品檢測(cè)的循環(huán)伏安信號(hào)

表2 電化學(xué)生物傳感方法檢測(cè)大西洋鮭和虹鱒樣品結(jié)果

3 討論

目前的物種DNA鑒定技術(shù)，擴(kuò)增對(duì)象以線粒體DNA為主［4-9］，如細(xì)胞色素C 氧化酶I（Cytochrome oxidase subunit I，COI）、細(xì)胞色素B（Cytochrome b，Cyt b）、D-loop控制區(qū)等。線粒體DNA具有母系遺傳特征，無(wú)法反映父母雙親的遺傳背景，在用于人工育成品種的遺傳分析時(shí)往往導(dǎo)致混亂。而在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，雜交育種是使用較為廣泛的育種技術(shù)，鮭鱒雜交研究由來(lái)已久［13，14］，且有部分品種已推廣養(yǎng)殖，如斑點(diǎn)鱒鮭［15］等。為避免鑒定線粒體基因?qū)﹄s交品種的誤判，本研究選擇核基因mb作為物種鑒定的靶序列，PCR擴(kuò)增結(jié)果同時(shí)包含待測(cè)樣本父母本的基因信息。

mb基因編碼產(chǎn)物是生物體內(nèi)的氧貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［16，17］。作為具有重要生理功能且在基因組內(nèi)僅有唯一拷貝的基因，在物種內(nèi)，mb基因結(jié)構(gòu)和序列都具有較高的保守性［18，19］，在該基因區(qū)設(shè)計(jì)引物，可使物種內(nèi)變異導(dǎo)致的PCR擴(kuò)增假陰性概率顯著降低。在兩物種基因序列的高度差異區(qū)設(shè)計(jì)鑒別引物，則大大提高了引物的特異性，避免引物區(qū)僅有少量堿基差異，在擴(kuò)增中發(fā)生堿基錯(cuò)配而導(dǎo)致假陽(yáng)性擴(kuò)增。

除兩對(duì)物種特異性引物外，本研究還設(shè)計(jì)了一對(duì)鮭鱒通用引物，在大西洋鮭和虹鱒基因組中都能有效擴(kuò)增，用作實(shí)際樣本檢測(cè)中的對(duì)照，指示所有實(shí)驗(yàn)流程正常。若通用引物檢測(cè)無(wú)信號(hào)，提示應(yīng)排查試劑和實(shí)驗(yàn)操作問(wèn)題。

本研究設(shè)計(jì)使用電化學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。與常規(guī)的DNA檢測(cè)手段相比，電化學(xué)檢測(cè)不像聚丙烯酰胺凝膠法、瓊脂糖凝膠法等電泳方法涉及有毒有害試劑操作，既保護(hù)了檢測(cè)人員的健康，也避免了潛在的環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)；又不像熒光標(biāo)記檢測(cè)需要避光，降低了檢測(cè)操作的繁瑣性，因而在DNA分析中呈現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景，如第三代測(cè)序Oxford Nanopore即采取納米孔電信號(hào)檢測(cè)取代熒光檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序［20］。此外，電化學(xué)檢測(cè)裝置成本較低，易于小型化、微陣列化，在實(shí)時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中，電化學(xué)檢測(cè)更具有明顯的優(yōu)勢(shì)［10-12，21］。

通過(guò)在上下游引物5'端分別標(biāo)記生物素和二茂鐵，使擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物同時(shí)帶有兩種標(biāo)記分子，生物素標(biāo)記使PCR產(chǎn)物被修飾有親和素的電極表面所捕獲，二茂鐵標(biāo)記則在電極表面產(chǎn)生可檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。二茂鐵的電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)［21-23］使用循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法、交流阻抗法等均可實(shí)現(xiàn)，本研究使用循環(huán)伏安法。

比較圖5和圖6中的各條循環(huán)伏安曲線，發(fā)現(xiàn)相同鮭鱒通用引物在大西洋鮭和虹鱒中各自擴(kuò)增的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)曲線形狀基本相同，即圖5和圖6中的曲線（3），而不同引物擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的循環(huán)伏安曲線形狀存在一定差異。鮭鱒通用引物擴(kuò)增序列在大西洋鮭和虹鱒參考基因組中僅存在24個(gè)堿基差異，產(chǎn)物的長(zhǎng)度和堿基組成都高度相似，它們的循環(huán)伏安曲線基本重疊，表明在測(cè)試體系中，二茂鐵標(biāo)記產(chǎn)物的電化學(xué)行為穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較高。而兩種物種特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)伏安曲線與前述曲線相比，氧化峰和還原峰的位置均出現(xiàn)了一定程度的偏移，氧化還原峰電位差明顯增大，可能是因?yàn)?，較長(zhǎng)的DNA片段阻礙了遠(yuǎn)端標(biāo)記的二茂鐵分子到電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移；氧化還原峰電流值也有所增大，可能是因?yàn)镻CR反應(yīng)擴(kuò)增效率不同所導(dǎo)致的。以上發(fā)現(xiàn)提示我們，在今后的傳感器設(shè)計(jì)中，可以通過(guò)不同長(zhǎng)度和堿基組成的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)物的電化學(xué)信號(hào)區(qū)分，從而合并反應(yīng)體系，在同一管內(nèi)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，使用同一支電極對(duì)多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步簡(jiǎn)化檢測(cè)流程，降低檢測(cè)成本。

使用本研究開發(fā)的電化學(xué)生物傳感檢測(cè)方法，對(duì)32個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行了物種鑒別。在15例采自不同養(yǎng)殖種群、不同品種的成魚樣品中，檢測(cè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)判定結(jié)果均一致，表明本方法用于物種鑒別的準(zhǔn)確率較高。

在17例市售魚類加工制品檢測(cè)中，有3例樣品檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)稱不一致，包括產(chǎn)地未知的冰鮮三文魚刺身2例，標(biāo)稱產(chǎn)地為挪威的煙熏三文魚1例，可能為虹鱒冒充大西洋鮭。另有標(biāo)稱產(chǎn)地為美國(guó)的三文魚泥1例，大西洋鮭和虹鱒特異性引物檢測(cè)均顯示陰性，而鮭鱒通用引物檢測(cè)呈陽(yáng)性，提示含有其它鮭鱒魚類成分，考慮到市場(chǎng)上“三文魚”名稱使用較為混亂，銀鮭（Oncorhynchus kisutch）、紅鮭（Oncorhynchus nerka）、大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）等原產(chǎn)于太平洋的鮭科物種經(jīng)常被稱為“太平洋三文魚”，推測(cè)該產(chǎn)品中的三文魚成分可能屬于此類。以上結(jié)果提示，市售大西洋鮭產(chǎn)品確實(shí)存在少量冒充或誤標(biāo)物種來(lái)源的問(wèn)題，為保障消費(fèi)者權(quán)益，在水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管中有必要開展物種鑒定檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究利用大西洋鮭和虹鱒mb基因的基因組序列相似性比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)了物種特異性引物，建立了基于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感體系，通過(guò)在上下游引物5'端分別標(biāo)記生物素和二茂鐵分子，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物在電極表面的錨定和循環(huán)伏安信號(hào)檢測(cè)，成功構(gòu)建了用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的電化學(xué)生物傳感檢測(cè)方法。本方法能夠用于成魚、苗種、魚卵、魚肉及其加工制品的物種鑒定，并能夠從混有其他物種DNA的樣品如魚泥中成功檢測(cè)魚肉DNA的物種來(lái)源，在水產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Electrochemical Bio-sensing Method for Identification of Atlantic Salmon and Rainbow Trout

ZHAO Zi-xia1XU Gui-cai1，2LI Jiong-tang1YANG Shi-yong3
Beijing Key Laboratory of Fishery Biotechnology，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；2. Marine Science and Technology College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022；3. College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）

This study aims to develop new method for species identification of aquatic products，in order to distinguish Atlantic salmon（Salmo salar）adulterated by rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）. Based on genomic sequence alignment of Atlantic salmon and rainbow trout，three pairs of polymerase chain reaction（PCR）primers in the genomic region of a nuclear gene myoglobin were designed，which were Atlantic salmon-specific primers，rainbow trout-specific primers，and universal primers for both salmon and trout，respectively. The 5’ ends of forward primers were labeled with biotin，thus the amplification products were able to be captured and anchored on the avidin-modified electrode surfaces. And the 5’ ends of reverse primers were labeled with ferrocene，which made the amplification products electrochemically active and capable to be detected by cyclic voltammetry. The constructed electrochemical bio-sensing system accurately and safely identified whether the samples were from Atlantic salmon or rainbow trout. Moreover，varied samples were applicable，including adult fish，fry，eggs，as well as processed fish products，such as fish paste containing multiple DNA sources. Therefore，the electrochemical bio-sensing detection method established in this study has promising prospects in quality inspection system for aquatic products.

Atlantic salmon；rainbow trout；species identification；cyclic voltammetry；bio-sensing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1067

2016-11-22

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD25B01）

趙紫霞，女，博士，副研究員，研究方向：水產(chǎn)生物技術(shù)；E-mail：zhaozx@cafs.ac.cn