徐寶寶，姜陽(yáng)，2，王金丹，李昔琪，何媛媛，阮青青，柳鵬程，高國(guó)輝，金龍金

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325015）

外源性17β-雌二醇促進(jìn)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖

徐寶寶1，姜陽(yáng)1，2，王金丹1，李昔琪1，何媛媛1，阮青青1，柳鵬程1，高國(guó)輝1，金龍金1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325015）

目的：研究外源性雌激素是否對(duì)乳腺癌中人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生作用。方法：分別以乳腺癌細(xì)胞SKBR3和MCF-7為材料，選擇17β-雌二醇（E2）為外源雌激素，配制10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的6種濃度培養(yǎng)環(huán)境，每種濃度培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置24、48、72 h 3個(gè)梯度。檢測(cè)HER2、ERα等標(biāo)志物表達(dá)水平變化，分析E2對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞增殖能力及侵襲性的影響。結(jié)果：在MCF-7中處理組HER2、ERα的轉(zhuǎn)錄水平都明顯高于陰性對(duì)照組。在SKBR3細(xì)胞中僅HER2轉(zhuǎn)錄水平明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。在蛋白水平SKBR3中HER2蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05）；而在MCF-7中，ERα蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，HER2幾乎檢測(cè)不到。在細(xì)胞增殖方面，MCF-7和SKBR3均隨著E2濃度的上升細(xì)胞增殖率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而在侵襲性方面，MCF-7的侵襲性在72 h時(shí)較空白對(duì)照組增強(qiáng)（P＜0.05），SKBR3侵襲性在24 h和48 h時(shí)較空白對(duì)照組增強(qiáng)（P＜0.05），但是自身隨濃度變化的規(guī)律不明顯。結(jié)論：外源性雌激素對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖有促進(jìn)作用。

17β-E2；受體，表皮生長(zhǎng)因子；受體，雌激素；基因表達(dá)；乳腺腫瘤；細(xì)胞增殖；腫瘤侵潤(rùn)

乳腺癌中人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）過(guò)表達(dá)一直被認(rèn)為是惡性程度高預(yù)后差的標(biāo)志[1-2]。研究表明，雌激素作為配體通過(guò)與各種特異性雌激素受體（estrogen receptor，ER）結(jié)合后傳遞細(xì)胞信號(hào)行使功能使乳腺癌發(fā)病率明顯增加[3-4]。因此，乳腺癌的臨床檢測(cè)主要以患者ER、HER2等表達(dá)水平作為病理診斷重要指標(biāo)[5-7]。臨床數(shù)據(jù)表明血清和尿液中雌激素代謝量隨著腫瘤細(xì)胞代謝失衡產(chǎn)生一定的變化[8-9]。腫瘤細(xì)胞代謝失衡后雌激素含量的變化是否會(huì)間接影響HER2陽(yáng)性浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲鮮少受到關(guān)注。本研究通過(guò)建立不同濃度、不同培養(yǎng)時(shí)間的17β-雌二醇（E2）培養(yǎng)環(huán)境，模仿自然環(huán)境下外源環(huán)境雌激素的存在狀態(tài)與含量，選定腫瘤標(biāo)志物ERα、HER2為觀察指標(biāo)，利用Real time qPCR技術(shù)檢測(cè)不同環(huán)境雌激素條件下乳腺癌細(xì)胞ERα、HER2的mRNA表達(dá)水平變化，利用Western blot法測(cè)定HER2、ERα蛋白表達(dá)水平變化，同時(shí)利用CCK-8法測(cè)定不同環(huán)境雌激素條件下乳腺癌細(xì)胞增殖速率的變化、Transwell法測(cè)定細(xì)胞侵襲能力的變化。通過(guò)比較分析HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞受環(huán)境雌激素影響后其細(xì)胞生物學(xué)特性。

1 材料和方法

1.1 材料 HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株SKBR3、ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，E2、二甲基亞楓（DMSO）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，ReverTra Ace qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green Real time PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于日本Toyobo公司，HER2 antibody、ERα antibody、β-actin antibody、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司，Trizol（總RNA抽提試劑）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成：HER2-F 5’-GCCAGTCCCG AGACCCACCTGGACATGCTC-3’，HER2-R 5’-GGTGTCTATC GATGTGAGAGCCAGC-3’，ERα-F 5’-ACCAACCAGTGCACCA TTG-3’，ERα-R 5’-CATTCTCCCTCCTCTTCGG-3’，β-actin-F 5’-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3’，β-actin-R 5’-CTGGTGC CTGGGGCG-3’。

1.2.2 配制6種不同濃度E2的細(xì)胞培養(yǎng)液：以DMSO為溶劑，配制2×10-2mol/L的E2貯存液。依次稀釋獲得2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8、2×10-9mol/L分裝溶液。然后加對(duì)應(yīng)的稀釋液1 μL到2 mL含有2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，達(dá)到各自的工作濃度為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L。

1.2.3 Real time qPCR法分析不同濃度E2不同處理時(shí)間條件下2種乳腺癌細(xì)胞中HER2、ERα mRNA水平的變化：調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，分別加入含10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L濃度E2的2%胎牛血清培養(yǎng)液中，以含等體積DMSO的2%胎牛血清培養(yǎng)液為陰性對(duì)照和不含DMSO的2%胎牛血清培養(yǎng)液為空白對(duì)照，分別培養(yǎng)24、48、72 h。每種處理濃度、每種處理時(shí)間設(shè)3個(gè)復(fù)孔。抽提總RNA，測(cè)定總RNA濃度。依反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)獲得cDNA（SKBR3和MCF-7 2種細(xì)胞，獲得6種處理濃度，3個(gè)時(shí)間梯度，3個(gè)獨(dú)立復(fù)孔的樣品共126個(gè)樣品）。以每個(gè)樣品cDNA為模板，分別用β-actin、HER2、ERα引物完成Real time qPCR，步驟為95 ℃預(yù)變性60 s，然后設(shè)置40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95 ℃ 15 s、60 ℃ 35 s、72 ℃45 s。每個(gè)數(shù)據(jù)CT值經(jīng)過(guò)公式計(jì)算：ΔCt=Ct（目標(biāo)基因）-Ct（內(nèi)參基因），計(jì)算2-ΔCt，分析每個(gè)樣品的HER2、ERα轉(zhuǎn)錄水平的變化，作柱狀圖分析，以濃度為橫坐標(biāo)，2-ΔCt為縱坐標(biāo)。獨(dú)立重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4 Western blot法分析E2不同處理?xiàng)l件下2種乳腺癌細(xì)胞中HER2、ERα蛋白水平的變化：調(diào)SKBR3細(xì)胞密度為2×106個(gè)/孔，加入到90 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，分別加入經(jīng)2%胎牛血清培養(yǎng)液稀釋的下列濃度的E2溶液：10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L和經(jīng)20%胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋的等體積的DMSO，并設(shè)置陰性對(duì)照，置37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72 h。抽提各個(gè)處理樣品的總蛋白，獲得54個(gè)樣品，重復(fù)3次，用酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm波長(zhǎng)下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，BCA法測(cè)定總蛋白含量。將總蛋白用細(xì)胞裂解液稀釋到統(tǒng)一濃度。Western blot法分析不同濃度E2不同處理時(shí)間條件下對(duì)乳腺癌細(xì)胞中HER2、ERα蛋白水平的變化。MCF-7細(xì)胞處理方式同SKBR3細(xì)胞。

1.2.5 CCK-8法測(cè)定E2不同處理?xiàng)l件下2種乳腺癌細(xì)胞增殖率的變化：在96孔板中加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞5×103個(gè)/孔（100 μL/孔），37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)基，同上1.2.3法E2濃度培養(yǎng)液處理，每孔加100 μL，對(duì)照組（只加含20%胎牛血清培養(yǎng)液100 μL），調(diào)零組（無(wú)細(xì)胞、只加含20%胎牛血清培養(yǎng)液100 μL），每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)2、4、6、24、48、72 h。每孔加入10 μL的CCK-8，37 ℃孵育2 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 450 nm處測(cè)量各孔的吸光值。對(duì)各實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、調(diào)零組OD值進(jìn)行G檢驗(yàn)，根據(jù)選定的P值（本次為0.95）和測(cè)量次數(shù) n（本次為5），查格拉布斯表，橫豎相交得臨界值G95（5）=1.627，比較計(jì)算值Gi和臨界值G95（5），若Gi＞G95（5），可以判斷測(cè)量值Gi為異常值，將它從5個(gè)測(cè)量數(shù)據(jù)中剔除；如果Gi＜G95（5），不是異常值，則不剔除，計(jì)算每組剩余數(shù)據(jù)的平均OD值。細(xì)胞的增殖率=[（實(shí)驗(yàn)組平均OD值-調(diào)零組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值-調(diào)零組平均OD值）-1]×100%。SKBR3細(xì)胞處理方式同MCF-7細(xì)胞。獨(dú)立重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 Transwell法測(cè)定不同方法處理的2種乳腺癌細(xì)胞侵襲性變化：將12-Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板，在上室加入300 μL預(yù)溫的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，室溫下靜置30 min，使基質(zhì)膠再水化，吸去剩余培養(yǎng)液。收集待處理細(xì)胞，用PBS洗1～2次，分別用含有各個(gè)濃度E2的BSA無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，含等體積DMSO的BSA無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基和不添加任何試劑的BSA無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×106個(gè)/mL。取上述3種細(xì)胞懸液200 μL（控制細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×105個(gè)）加入12-Transwell小室，并做好標(biāo)記。24孔板下室加入500 μL含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基（SKBR3：含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，MCF-7：含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基）。37 ℃培養(yǎng)一定時(shí)間（SKBR3：24、48 h，MCF-7：72 h）。細(xì)胞穿過(guò)膜后，侵襲性弱的MCF-7細(xì)胞株可附著在膜的下室側(cè)面，0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞，用ddH2O洗2次，每次10 min。在光學(xué)倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)即可。侵襲性高的SKBR3細(xì)胞株，0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞，用ddH2O洗2次，每次10 min。染色后用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來(lái)，洗脫液在酶標(biāo)儀上570 nm測(cè)其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。獨(dú)立重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Real time qPCR法分析不同處理?xiàng)l件下2種乳腺癌細(xì)胞中HER2、ERα mRNA水平的變化 MCF-7細(xì)胞在6種濃度E2分別處理24、48、72 h后，ERα mRNA表達(dá)量都上調(diào)，在10-9mol/L濃度時(shí)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1A-C；HER2的mRNA表達(dá)量在72 h均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），在10-6mol/L濃度時(shí)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1D-F。SKBR3細(xì)胞用6種濃度E2分別處理24、48、72 h后，HER2的mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)，且在處理48 h時(shí)隨著濃度升高逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2D-F；對(duì)于ERα在處理72 h的10-8、10-7、10-6mol/L濃度處理的樣本，E2處理后ERα mRNA表達(dá)量下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2A-C。

2.2 Western blot法分析不同處理?xiàng)l件下2種乳腺癌細(xì)胞中HER2、ERα蛋白水平的變化 不同濃度E2處理后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)均檢測(cè)不到HER2蛋白的表達(dá)，而ERα的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但與空白對(duì)照比較ERα蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3A-C。不同濃度E2處理后，SKBR3細(xì)胞內(nèi)HER2蛋白表達(dá)與空白對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖4A-C。

2.3 CCK-8法測(cè)定不同處理?xiàng)l件下2種乳腺癌細(xì)胞增殖率的變化 MCF-7細(xì)胞的增殖率隨著E2濃度增加而增加，且藥物作用2、4、6、24、48、72 h的各時(shí)段內(nèi)，高濃度E2對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖具有顯著性促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖5A-F。而在SKBR3細(xì)胞中，E2多種情況下均表現(xiàn)出促進(jìn)增殖的作用，且增殖率隨著E2濃度增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖6A-F。在同一時(shí)間段，高濃度E2對(duì)SKBR3細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而低濃度E2（10-10mol/L）對(duì)SKBR3細(xì)胞增殖在某些時(shí)間段具有一定的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6A-F。

2.4 Transwell法測(cè)定不同方法處理的SKBR3和MCF-7細(xì)胞侵襲性的變化 SKBR3細(xì)胞經(jīng)不同濃度的E2分別培養(yǎng)24、48 h，其侵襲性有明顯變化。與空白對(duì)照相比，處理24 h時(shí)SKBR3細(xì)胞侵襲性受到E2 6種濃度梯度刺激侵襲性明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖7A。經(jīng)不同濃度的E2培養(yǎng)48 h后，與空白對(duì)照比較，10-10、10-8、10-7、10-6mol/L濃度的侵襲性顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中高濃度（10-6mol/L）和低濃度（10-10mol/L）E2對(duì)SKBR3細(xì)胞的侵襲性促進(jìn)作用相對(duì)較強(qiáng)，見(jiàn)圖7B。不同濃度的E2處理MCF-7細(xì)胞后在72 h時(shí)表現(xiàn)出侵襲性增強(qiáng)的特點(diǎn)，與空白對(duì)照比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖8。

圖1 E2不同處理?xiàng)l件下MCF-7細(xì)胞中HER2、ERα mRNA水平的變化

圖2 E2不同處理?xiàng)l件下SKBR3細(xì)胞中HER2、ERα mRNA水平的變化

圖3 E2不同處理?xiàng)l件下MCF-7細(xì)胞中HER2、ERα蛋白水平的變化

圖4 E2不同處理?xiàng)l件下SKBR3細(xì)胞中HER2、ERα蛋白水平的變化

圖5 不同濃度E2不同處理時(shí)間條件下對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖率的影響

3 討論

經(jīng)典的雌激素核受體觀點(diǎn)認(rèn)為，在細(xì)胞核內(nèi)含有以ERα和ERβ為主的ER，2種受體可以形成異源二聚體，該異源二聚體與雌激素形成復(fù)合物后可以結(jié)合到靶基因DNA序列上調(diào)節(jié)各種未知的雌激素效應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄水平，從而完成雌激素的配體功能[10-12]，而雌激素本身并不調(diào)控ER的表達(dá)水平。隨著G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupledreceptor，GPCR）的發(fā)現(xiàn)，雌激素的調(diào)節(jié)功能被認(rèn)為既可以在細(xì)胞核內(nèi)也可以在細(xì)胞膜完成[13-14]。目前，ER的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有多種，如ER活化MAPK/ERK途徑等[15-16]。有研究認(rèn)為HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞可以依賴(lài)于PI3K/MAPK信號(hào)途徑?jīng)Q定是否表達(dá)各種HER家族成員[17]。目前，HER2基因是否是ERα和ERβ的異源二聚體與雌激素結(jié)合后形成的復(fù)合物作用的靶基因尚不清楚。

圖6 不同濃度E2不同處理時(shí)間條件下對(duì)SKBR3細(xì)胞增殖率的影響

圖7 不同E2環(huán)境下SKBR3細(xì)胞的侵襲性變化

圖8 不同E2環(huán)境下MCF-7細(xì)胞的侵襲性變化

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度外源性E2對(duì)HER2、ERα表達(dá)水平的影響基本不同，而且變化規(guī)律也十分不一致。在MCF-7中，其ERα和HER2的轉(zhuǎn)錄水平多數(shù)處理?xiàng)l件下均顯著上調(diào)。在相同處理時(shí)間下，ERα蛋白表達(dá)量在不同濃度處理?xiàng)l件下均呈下降趨勢(shì)，這與其轉(zhuǎn)錄水平受到的影響相反，但HER2蛋白基本檢測(cè)不到。在SKBR3中，HER2轉(zhuǎn)錄水平受雌激素的影響在24、48、72 h時(shí)均明顯上調(diào)，在48、72 h時(shí)隨濃度升高有明顯上升傾向。但是在各種處理?xiàng)l件下ERα的轉(zhuǎn)錄水平基本都低于陰性對(duì)照，這與在MCF-7內(nèi)的作用相反。在蛋白水平，HER2蛋白表達(dá)在24、48 h均顯著升高，而ERα蛋白在不同的濃度和時(shí)間刺激下，幾乎也檢測(cè)不出。比較2種細(xì)胞的處理結(jié)果，SKBR3本身即為HER2陽(yáng)性ERα陰性，在雌激素的影響下其陽(yáng)性腫瘤標(biāo)志物HER2受影響較大。相反，MCF-7本身即為ERα陽(yáng)性HER2陰性，在雌激素的影響下HER2轉(zhuǎn)錄水平卻也受到影響但其分子機(jī)制尚未知。ZHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)ER-α36可以在ERα陽(yáng)性HER2陰性乳腺癌細(xì)胞中激活MAPK信號(hào)通路。而另有研究認(rèn)為MAPK信號(hào)通路存在一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)，其中HER2可以促進(jìn)ERK5激活，而MEKK2可以通過(guò)調(diào)控HER2促進(jìn)ERK5激活[19-20]。因此，對(duì)于不同的乳腺癌細(xì)胞亞型，外源性雌激素影響HER2表達(dá)或功能可能依賴(lài)于MAPK信號(hào)通路存在。

在細(xì)胞水平，不同外源雌激素刺激條件對(duì)MCF-7和SKBR3的影響均明顯。2、4、6 h內(nèi)，SKBR3隨外源雌激素濃度的增加促進(jìn)細(xì)胞增殖的幅度加大。在24、48 h時(shí)細(xì)胞增殖率增長(zhǎng)幅度略低，到72 h時(shí)，細(xì)胞增殖率的上升幅度又有增加?？偟膩?lái)看，相同處理時(shí)間條件下，隨著雌激素濃度的上升細(xì)胞增殖率上升的趨勢(shì)保持不變。而MCF-7細(xì)胞在2、4 h時(shí)隨著濃度增加細(xì)胞增殖率增加。6 h時(shí)，所有濃度均表現(xiàn)出促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。而在長(zhǎng)時(shí)間作用下，在同一時(shí)間處理?xiàng)l件下，細(xì)胞增殖率隨著雌激素濃度的變化而上升的規(guī)律十分明顯。但是，在各個(gè)時(shí)間段細(xì)胞增殖效果有明顯差異。比較2種不同類(lèi)型的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和SKBR3，MCF-7受雌激素的影響十分明顯。MCF-7本身屬于ER陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞，ER表達(dá)水平應(yīng)該比ER陰性的SKBR3的表達(dá)量高，所以受雌激素作用的能力要強(qiáng)。分析認(rèn)為，MCF-7增殖率變化較大有兩個(gè)方面的影響。首先，多種細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境對(duì)MCF-7影響較大。比較MCF-7的長(zhǎng)時(shí)間處理和短時(shí)間處理具有相似的規(guī)律。當(dāng)MCF-7細(xì)胞置于96孔板培養(yǎng)時(shí)，一般均在無(wú)雌激素條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁狀態(tài)時(shí)添加更換含雌激素的培養(yǎng)基，細(xì)胞在處于貼壁狀態(tài)的初始階段是否具有較強(qiáng)的增殖能力有待研究。此外，在所有的處理結(jié)果中，雌激素的溶劑DMSO一般認(rèn)為是對(duì)細(xì)胞低毒性，但是，比較MCF-7和SKBR3，DMSO對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用更明顯，是否DMSO在MCF-7中對(duì)ER的干擾作用更大有待更進(jìn)一步的研究。腫瘤細(xì)胞的侵襲力與臨床癌癥的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移有很大的關(guān)系。雌激素對(duì)SKBR3和MCF-7細(xì)胞侵襲性的影響區(qū)別較大。MCF-7的侵襲性在不同濃度和不同時(shí)間均不明顯，HER2陽(yáng)性的SKBR3侵襲性受影響程度較大，但是自身隨濃度變化的規(guī)律不明顯。

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（本文編輯：吳彬）

Exogenous 17β-estradiol promote the invasion and proliferation of HER2 positive breast cancer cells

XU Baobao1, JIANG Yang1,2, WANG Jindan1, LI Xiqi1, HE Yuanyuan1, RUAN Qingqing1, LIU Pengcheng1, GAO Guohui1, JIN Longjin1. 1.Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Oncology, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate the correlation between exogenous estrogens (EEs) and the development risk of HER2 positive breast cancer cells. Methods: We treated HER2-positive and ERα-negative cells SKBR3, ERα-positive and HER2-negative cells MCF-7 with 17β-estradiol. The six different concentrations of 17β-estradiol were 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10mol/L. For each concentration condition, there were three time dose such as 24 h, 48 h, 72 h. The expression levels of HER2 and ERα were observed as the key positive marker. And then cell invasion and cell proliferation of breast cancer cells were analysed for MCF-7 and SKBR3 under 17β-estradiol treatment. Results: It showed that the transcriptional levels of HER2 and ERα were upregulated in MCF7 cells under all 18 different conditions. However, only the transcriptional levels of HER2 was upregulated in all 18 different conditions in HER2-positive and ERα-negative SKBR3. At protein expression levels, HER2 in SKBR3 cells and ERα in MCF-7 cells were expressed apparently after the breast cancer cells were stimulated by 17β-estradiol under all different conditions. Simultaneously,the proliferation of MCF-7 and SKBR3 were promoted obviously. With the higher concentration of 17β-estradiol treatment the proliferative activity of these two breast cancer cells were promoted much more obviously. As for the invasion of the breast cancer cells, MCF-7 was increased after 72 h, and SKBR3 was increased after 24 h and 48 h. Whereas the invasion of SKBR3 and MCF-7 were not up or down regulated evidently with the change of concentrations and time. Conclusion: In a word, the expression levels of HER2 in HER2 positive breastcancer cells SKBR3 are upregulated under different 17β-estradiol treatment conditions. Furthermore, the invasion and proliferation of HER2 positive breast cancer cells SKBR3 are promoted under exogenous estrogens 17β-estradiol treatment.

17β-estradiol; receptor, epidermal growth factor; receptor, estrogen; gene expression; breast neoplasms; cell proliferation; neoplasm invasiveness

Q291

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.004

2016-09-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81572580）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2110623）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目（2012KYA128）。

徐寶寶（1988-），男，陜西渭南人，碩士生。

金龍金，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：ggh1227@126.com。