包素珍魏自太,2李恒楠李小東

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江 衢州 324000

加味黃芪建中湯對脾氣虛證肺癌微環(huán)境腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響*

包素珍1魏自太1,2李恒楠1李小東1

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江 衢州 324000

脾氣虛證 黃芪建中湯 肺癌 微環(huán)境 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 小鼠

中晚期非小細(xì)胞肺癌患者中以氣虛為主，臨床也發(fā)現(xiàn)肺癌患者脾氣虛最為多見，“脾氣虛”環(huán)境對肺癌發(fā)展有重要影響，本課題在脾氣虛模型的基礎(chǔ)上，運用加味黃芪建中湯干預(yù)脾氣虛肺癌轉(zhuǎn)移小鼠，觀察中藥干預(yù)前后脾氣虛狀態(tài)下“脾氣虛”變化，研究加味黃芪建中湯干預(yù)脾氣虛肺癌微環(huán)境轉(zhuǎn)移的機(jī)制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物：加味黃芪建中湯：黃芪、桂枝各9g，白芍18g，甘草6g，生姜、浙貝母、大棗各10g，飴糖、白花蛇舌草各30g，仙鶴草12g。經(jīng)水煎、過濾、滅菌，制成含生藥1.00g/ml的藥液；共144g購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部。加味黃芪建中湯灌胃，每日0.4ml/20g。大黃濃縮液：大黃300g（藥物購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部），打粉。按1：6，將大黃水浴負(fù)壓濃縮成300ml大黃液，濃度為1g/ml，大黃液灌胃，每日1ml/20g。

1.2 實驗動物：健康C57BL/6小鼠70只，雌性，體重18～22g，小鼠Lewis肺癌瘤株，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 試劑：大鼠抗小鼠CD68抗體，北京中杉金橋生物工程公司；DAB顯色劑，北京中杉金橋生物工程公司；免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物工程公司。

1.4 造模和分組：脾氣虛模型的建立：本實驗依據(jù)文獻(xiàn)資料，采用大黃濃縮煎劑瀉下敗胃，并結(jié)合勞則氣耗，損耗脾氣的方法造模。70只C57BL/6小鼠，雌性，體重18±2g，在動物實驗中心常規(guī)適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)取20只小鼠在正常環(huán)境下飼養(yǎng)，其余50只小鼠采用苦寒瀉下法造脾氣虛模型（大黃濃縮液灌胃，每只小鼠每次1ml/20g，每日1次），同時每日游泳、間隔1日節(jié)食（下午4：00至第2日早晨8：30），連續(xù)14天。在脾氣虛模型建成后，給正常組10只和脾氣虛模型組50只小鼠接種腫瘤。取傳代后第13天的C57荷瘤小鼠新鮮無壞死Lewis腫瘤組織，制成腫瘤細(xì)胞懸液；腫瘤細(xì)胞濃度用生理鹽水調(diào)整為1× 107個/ml；取上述腫瘤細(xì)胞懸液0.2ml，接種于小鼠右腋部皮下。隨機(jī)將實驗小鼠分為5組：①正常組：生理鹽水灌胃，每日1次，每次0.4ml；②脾氣虛組：生理鹽水灌胃，每日1次，每次0.4ml；③肺癌組：生理鹽水灌胃，每日1次，每次0.4ml；④脾氣虛肺癌組：生理鹽水灌胃，每日1次，每次0.4ml；⑤脾氣虛肺癌黃芪組：中藥加味黃芪建中湯灌胃，每日1次，每次0.4ml。脾氣虛證肺癌模型建立后，各組按以上方法給藥，連續(xù)9天后，進(jìn)食不禁水12h，第10天脫頸椎處死小鼠。

1.5 肺組織轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、腫瘤重量的檢測：在處死小鼠后，剪開小鼠胸腔，分離氣管，取出肺臟，浸入Bouin氏液固定。固定24h后對肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)觀察計數(shù)。肺結(jié)節(jié)抑制率=[1-(給藥組平均肺結(jié)節(jié)/模型組平均肺結(jié)節(jié))]×100%。腫瘤抑制率=[1-(給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)]×100%。在處死小鼠后，剝?nèi)×鰤K，稱重，計算抑瘤率。

1.6 不同組別腫瘤組織中CD68檢測：標(biāo)記小鼠腫瘤組織中CD68，CD68為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的標(biāo)志蛋白之一。本實驗以CD68作為TAM標(biāo)志抗原，檢測不同組別腫瘤組織中TAM的浸潤程度。三組荷瘤小鼠（脾氣虛肺癌組，肺癌組，脾氣虛肺癌黃芪組）處死后，小心剝離腫瘤組織標(biāo)本，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋切片。免疫組織化學(xué)操作為EnVision二步法。

1.7 結(jié)果判定：使用三張切片重復(fù)實驗，低倍鏡(× 100)下選擇CD68陽性最密集區(qū)，然后在高倍鏡下(× 400)計數(shù)5個視野中的CD68(+)細(xì)胞、CD68蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，染色呈在黃褐色或黃色，在巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)，胞漿含清晰的顆粒狀者為陽性。CD68采用陽性細(xì)胞計數(shù)法，觀察lewis肺癌組織切片中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞最密集的區(qū)域，計數(shù)5個區(qū)域在400倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)，并取其平均值即為該組織切片中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法：采用統(tǒng)計軟件包SPSS21.0版統(tǒng)計，計量資料兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素分析；計量資料數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 加味黃芪建中湯對Lewis肺癌小鼠瘤重及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響：見表1。

表1 各組小鼠瘤體重量及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移情況比較（±s）

表1 各組小鼠瘤體重量及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移情況比較（±s）

注：與肺癌組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與脾氣虛肺癌組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

44.90%組別肺癌組脾氣虛肺癌組脾氣虛肺癌黃芪組瘤重（g）2.27±0.91 3.02±0.48#1.69±0.37**瘤抑制率抑制率25.62%肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)3.63±0.74 4.88±0.83#2.00±0.53##*

2.2 各組Lewis小鼠腫瘤組織中CD68蛋白免疫組化的結(jié)果：見表2。lewis肺癌組織切片中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的CD68蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，染色呈黃褐色或黃色，陽性細(xì)胞多彌散在癌巢周圍，脾虛肺癌組相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量最多，肺癌組次之，脾氣虛肺癌黃芪組最少。見圖1。

表2 不同組別小鼠CD68的表達(dá)（±s）

表2 不同組別小鼠CD68的表達(dá)（±s）

注：與脾氣虛肺癌黃芪組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與肺癌組比較，##P＜0.01。

CD68陽性細(xì)胞數(shù)220.20±52.26**##123.00±27.27*100.00±15.87組別脾氣虛肺癌組肺癌組脾氣虛肺癌黃芪組

圖1 各組lewis肺癌組織切片中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的CD68蛋白表達(dá)（×40）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生首先是患者的正氣不足，“邪之所湊，其氣必虛”，而“正氣存內(nèi)，邪不可干”，所以培補(bǔ)正氣為治療腫瘤的重要原則之一。同時，惡性腫瘤雖然局限于某一部位，但其發(fā)生還是轉(zhuǎn)移，均是機(jī)體內(nèi)外多種因素共同作用的結(jié)果，所以說局部病灶與全身的關(guān)系是密不可分的，故防治腫瘤轉(zhuǎn)移時必須樹立整體觀念。依據(jù)“脾氣虛”肺癌的病機(jī)，選擇加味黃芪建中湯擅建中氣。方中，飴糖為君，甘以潤土，土潤則萬物生，白芍酸寒，和營斂陰，津液得通，黃芪甘能補(bǔ)血補(bǔ)氣，則脾胃氣血大壯；桂枝行氣活血，三藥合用，取辛甘化陽之義；白芍、甘草酸甘化陰，能緩攣急而止痛；生姜、大棗辛甘相合，健脾胃而通營衛(wèi)；浙貝母、白花蛇舌草和仙鶴草解毒散結(jié)。全方溫中健脾，清熱解毒、消痛散結(jié)，用治陰陽兩虛而“脾氣虛”肺癌。亦有研究發(fā)現(xiàn)[1]采用黃芪建中湯可明顯改善小鼠的整體情況，有一定的抑瘤作用，可能與上調(diào)caspase3-mRNA的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

本次實驗結(jié)果顯示：肺癌組轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量少于脾氣虛肺癌組，在脾氣虛肺癌組小鼠肺組織表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量最多，結(jié)節(jié)較大。在加味黃芪建中湯干預(yù)的黃芪組則轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量最少，結(jié)節(jié)較小。同時，脾氣虛肺癌組瘤重最大。脾氣虛肺癌黃芪組瘤重最小。表明“脾氣虛”促進(jìn)了腫瘤的增殖生長及在肺內(nèi)的轉(zhuǎn)移，而加味黃芪建中湯則能抑制腫瘤的生長，且也可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

在腫瘤不同部分的巨噬細(xì)胞通過釋放生長因子，細(xì)胞因子，趨化因子，酶等物質(zhì)而扮演不同的角色，入侵領(lǐng)域的巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運動，間質(zhì)及血管周圍地區(qū)的巨噬細(xì)胞促進(jìn)轉(zhuǎn)移，無血管和缺氧壞死區(qū)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞刺激血管生成[2]。CD68為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的標(biāo)志蛋白。本實驗以CD68作為TAM標(biāo)志抗原，檢測不同組別腫瘤組織中TAM的浸潤程度。從實驗結(jié)果分析，脾虛肺癌組相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量最多，腫瘤組相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量次之，肺癌黃芪組腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量最少。脾氣虛肺癌組織TAM（CD68）浸潤密度最高，肺癌組TAM（CD68）浸潤密度次之，脾氣虛肺癌黃芪組TAM浸潤密度最低。說明“脾氣虛”促進(jìn)了腫瘤微環(huán)境中相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤，可能多方面促進(jìn)了腫瘤的生長增殖，轉(zhuǎn)移，而加味黃芪建中湯可能通過抑制腫瘤TAM的浸潤從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

既然腫瘤微環(huán)境在腫瘤的增殖，遷移，黏附，轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，加味黃芪建中湯一方面能夠培補(bǔ)正氣，改善“脾氣虛”的證候，另一方面，其有效成分具有廣泛的抗癌作用，多靶點，多方面發(fā)揮抑制腫瘤的作用，從病證結(jié)合角度闡明脾氣虛對肺癌微環(huán)境變化的影響及與肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，揭示肺癌微環(huán)境脾氣虛的病機(jī)，并通過健脾益氣中藥加味黃芪建中湯對脾氣虛肺癌微環(huán)境的作用機(jī)制研究，說明健脾益氣中藥干預(yù)脾氣虛肺癌的客觀依據(jù)，為中醫(yī)理論研究添磚加瓦。

[1]包素珍,鄭小偉,孫在典,等.黃芪建中湯對脾氣虛證肺癌小鼠caspase-3表達(dá)的影響[J].浙江中醫(yī)雜志,2013,48(3)：116-118.

[2]Lewis CE,Pollard JW.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments[J].Cancer Res, 2006,66(2)：605-612.

2016-12-14

浙江省自然科學(xué)基金資助項目肺癌微環(huán)境脾氣虛病機(jī)及黃芪建中湯干預(yù)機(jī)制研究，編號：LY13H270010