崔明星，詹新立，劉沖，鄧?yán)瑁艽合?，劉?huì)江

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453100；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

雷帕霉素聯(lián)合阿霉素對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

崔明星1，詹新立2，劉沖2，鄧?yán)?，熊春翔2，劉會(huì)江2

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453100；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

目的 探討雷帕霉素聯(lián)合阿霉素對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞(以下稱骨肉瘤細(xì)胞)增殖的影響及其作用機(jī)制。方法 取對數(shù)生長期骨肉瘤細(xì)胞，分別加入不同濃度的阿霉素(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L)和雷帕霉素(20、50、100 nmol/L)單獨(dú)及聯(lián)合作用，采用MTT法檢測作用48 h的細(xì)胞增殖抑制率，并計(jì)算兩藥相互作用指數(shù)(CDI)，評價(jià)兩藥相互作用性質(zhì)。結(jié)果以100 nmol/L雷帕霉素與0.5 mg/L 阿霉素聯(lián)合作用后的細(xì)胞增殖抑制率最高，此時(shí)CDI<0.7，兩種藥物表現(xiàn)為顯著協(xié)同作用。將對數(shù)生長期的骨肉瘤細(xì)胞分為五組，阿霉素組、雷帕霉素組分別加入0.5 mg/L阿霉素、100 nmol/L雷帕霉素，聯(lián)合用藥組加入0.5 mg/L阿霉素和100 nmol/L雷帕霉素，DMSO溶媒組加入等量DMSO，空白對照組不予處理。采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力，連續(xù)記錄5天。采用Real-time PCR法檢測各組處理48 h缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2) mRNA 相對表達(dá)量。結(jié)果 各組作用第1、2天細(xì)胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。作用第3～5天，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖能力均明顯低于空白對照組、DMSO溶媒組、阿霉素組及雷帕霉素組(P均<0.05)。聯(lián)合用藥組HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于空白對照組、DMSO溶媒組、阿霉素組、雷帕霉素組(P均<0.05)。結(jié)論 雷帕霉素聯(lián)合阿霉素可以協(xié)同抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖；降低HIF-1α、VEGF、MMP-2表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

骨肉瘤；細(xì)胞增殖；雷帕霉素；阿霉素；藥物敏感性

骨肉瘤是一種好發(fā)于長骨干骺端的原發(fā)性惡性腫瘤，在青少年人群中多發(fā)。骨肉瘤發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，患者的5年生存率為60%～75%[1]，超過30%的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；诎⒚顾氐穆?lián)合化療方案為目前骨肉瘤的主要治療方法，但阿霉素的耐藥問題卻大大降低了其臨床效果。研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可特異性阻斷mTOR信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用[2,3]。但關(guān)于雷帕霉素聯(lián)合阿霉素對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究鮮見報(bào)道。為此，我們于2012年9月～2014年3月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63(以下稱骨肉瘤細(xì)胞)購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。主要試劑及儀器：DMEM高糖培養(yǎng)液、阿霉素購自美國Gibco公司，雷帕霉素購自美國Gene Operation公司，二甲亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與Real-time PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。7500型實(shí)時(shí)熒光定量分析系統(tǒng)購于美國ABI公司。

1.2 雷帕霉素與阿霉素的聯(lián)合作用觀察

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 將骨肉瘤細(xì)胞置于含10%滅活胎牛血清、10 000 U/mL青霉素和10 000 mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長情況，2～3天更換一次培養(yǎng)液。將對數(shù)期生長的骨肉瘤細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h。待細(xì)胞貼壁后，分別加入0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L阿霉素與20、50、100 nmol/L雷帕霉素單獨(dú)及聯(lián)合作用，每孔終體積為200 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 雷帕霉素和阿霉素濃度篩選 藥物作用48 h，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm波長處測定各孔光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(樣品組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。結(jié)果顯示，在相同阿霉素濃度下，隨著雷帕霉素濃度的升高，兩藥聯(lián)合應(yīng)用后骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制率呈升高趨勢(P均<0.05)。以100 nmol/L雷帕霉素與0.5 mg/L 阿霉素聯(lián)合作用后對骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制率最高(上述濃度用于以下研究)。見表1。

表1 骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)阿霉素、雷帕霉素單獨(dú)與聯(lián)合作用后的細(xì)胞增殖抑制率

1.2.3 藥物作用性質(zhì)判斷 采用相互作用指數(shù)(CDI)評價(jià)兩藥相互作用性質(zhì)。CDI=AB/(A×B)。AB為阿霉素和雷帕霉素聯(lián)合作用時(shí)與空白對照細(xì)胞OD值的比值；A、B為阿霉素或雷帕霉素單獨(dú)作用時(shí)與空白對照細(xì)胞OD值的比值。CDI<1說明兩藥具有協(xié)同作用，CDI<0.7說明兩藥協(xié)同作用非常顯著，CDI=1說明兩藥具有相加作用，CDI>1說明兩藥具有拮抗作用。結(jié)果顯示，阿霉素濃度<0.5 mg/L時(shí)，兩藥聯(lián)合作用后CDI<1；其中100 nmol/L雷帕霉素與0.5 mg/L 阿霉素聯(lián)合作用后CDI<0.7。阿霉素濃度>0.5 mg/L時(shí)，兩藥聯(lián)合作用后CDI>1。見表2。

1.3 阿霉素聯(lián)合雷帕霉素對骨肉瘤細(xì)胞增殖影響的觀察

1.3.1 細(xì)胞分組及干預(yù) 將對數(shù)期生長的骨肉瘤

表2 骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)阿霉素、雷帕霉素聯(lián)合作用后的CDI

細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL， 將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、 DMSO 溶媒組、阿霉素組、雷帕霉素組以及聯(lián)合用藥組。阿霉素組、雷帕霉素組分別加入0.5 mg/L阿霉素、100 nmol/L雷帕霉素，聯(lián)合用藥組加入0.5 mg/L阿霉素和100 nmol/L雷帕霉素，DMSO溶媒組加入等量DMSO，空白對照組不予處理。每孔終體積為200 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.2 相關(guān)指標(biāo)檢測

1.3.2.1 細(xì)胞增殖能力 取各組處理48 h的細(xì)胞，采用MTT法檢測各組全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm波長處的OD值，代表細(xì)胞增殖能力。連續(xù)記錄5天。

1.3.2.2 缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2) mRNA 相對表達(dá)量 采用Real-time PCR法。取各組處理48 h的細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度及純度合格，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用7500型實(shí)時(shí)熒光定量分析系統(tǒng)，以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。引物序列:HIF-1α上游引物：5′-TGCACAGGCCACATTCACG-3′，下游引物：5′-GTTCACAAATCAGCACCAA-

GC-3′；VEGF上游引物：5′-TGCTGTGGACTTGAGTTG-

GG-3′，下游引物：5′-GGCTGGGTTTGTCGGTGTT-3′；MMP-2上游引物：5′-TACAGGATCATTGGCTACACAC-

C-3′，下游引物：5′-GGTCACATCGCTCCAGACT-3′；β-actin 上游引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCT法計(jì)算HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 隨著作用時(shí)間的延長,各組細(xì)胞增殖能力逐漸升高。各組作用第1、2天細(xì)胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。作用第3～5天，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖能力均明顯低于空白對照組、DMSO溶媒組、阿霉素組及雷帕霉素組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞增殖能力比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與DMSO溶媒組比較，#P<0.05；與阿霉素組比較，△P<0.05；與雷帕霉素組比較，▽P<0.05。

2.2 各組HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA 相對表達(dá)量比較 阿霉素組、雷帕霉素組及聯(lián)合用藥組HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量均低于空白對照組及DMSO溶媒組，但聯(lián)合用藥組降低更明顯(P均<0.05)。見表4。

表4 各組HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與DMSO溶媒組比較，#P<0.05；與阿霉素組比較，△P<0.05；與雷帕霉素組比較，▽P<0.05。

3 討論

雷帕霉素是36元環(huán)含氮三烯大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，廣泛用于器官移植術(shù)后的抗排斥反應(yīng)。雷帕霉素通過抑制mTOR蛋白的激酶活性，發(fā)揮抗菌、免疫抑制和抗腫瘤作用。mTOR是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。在細(xì)胞中，mTOR以mTORC1和mTORC2的催化亞基形式存在，其活性調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，受多種調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白參與，其中最主要的是PI3K/Akt/mTOR和Akt/TSC1-TSC2/mTOR/S6K通路。

近年研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可通過對腫瘤細(xì)胞mTOR通路的作用，發(fā)揮抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用[4～6]。Campone等[7]建立了一個(gè)對阿霉素耐藥的、以Akt通路為主要存活機(jī)制的B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型，通過雷帕霉素抑制Akt活性，使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)對阿霉素的敏感性。徐國才等[8]報(bào)道，雷帕霉素通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬，促進(jìn)其凋亡發(fā)生，進(jìn)而提高對順鉑的敏感性。雷帕霉素聯(lián)合順鉑作用于喉癌Hep-2細(xì)胞時(shí)，可明顯提高其細(xì)胞凋亡率，表明二者存在明顯的協(xié)同作用[9]。本研究結(jié)果顯示，在相同阿霉素濃度下，隨著雷帕霉素濃度的升高，兩藥聯(lián)合應(yīng)用后骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制率呈升高趨勢；以100 nmol/L雷帕霉素與0.5 mg/L 阿霉素聯(lián)合作用后對骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制率最高，此時(shí)CDI<0.7，兩種藥物表現(xiàn)為顯著協(xié)同作用。表明雷帕霉素可增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用。

HIF-1α被認(rèn)為是腫瘤缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的中心啟動(dòng)因子，是惟一可以決定HIF-1活性的氧調(diào)節(jié)亞基，通過直接或者間接調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對缺氧產(chǎn)生生理適應(yīng)，并參與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，抑制HIF-1α表達(dá)可明顯抑制乳腺癌原發(fā)灶的生長，并減少轉(zhuǎn)移到肺組織的腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞可以合成、分泌VEGF，在腫瘤組織中的表達(dá)水平高于正常組織。研究表明，抑制VEGF表達(dá)可以對腫瘤新生血管、淋巴管的形成以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生明顯的抑制作用[11～14]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一種幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中各種蛋白成分的酶，可破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。Park等[15]報(bào)道，通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路可下調(diào)MMP-2基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。本研究結(jié)果顯示，各組作用第3～5天，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖能力及HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于空白對照組、DMSO溶媒組、阿霉素組、雷帕霉素組。說明雷帕霉素聯(lián)合阿霉素可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，雷帕霉素可增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性；抑制HIF-1α、VEGF、MMP-2表達(dá)可能是其作用機(jī)制。mTOR信號(hào)通路在體內(nèi)廣泛存在，雷帕霉素聯(lián)合阿霉素提高骨肉瘤細(xì)胞靶向特異性的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究的不足是未從細(xì)胞周期及蛋白水平等方面進(jìn)行深入研究。

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Effects of Rapamycin and Adriamycin on proliferation of osteosarcoma MG-63 cells

CUIMingxing1,ZHANXinli,LIUChong,DENGLi,XIONGChunxiang,LIUHuijiang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China)

Objective To investigate the effects of Rapamycin (RAPA) and Adriamycin (ADM) on proliferation of osteosarcoma MG-63 cells and their mechanisms. Methods Human osteosarcoma MG-63 cells in logarithmic growth phase was treated with ADM solution of different concentrations (0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L) and RAPA solution of different concentrations (20, 50, 100 nmol/L) alone or in combination. Then the cell inhibition rate was determined by MTT after 48 hours, and Coefficient of drug interaction (CDI) was calculated to evaluate the nature of the interaction between the two drugs. The cell inhibition rate was the highest when MG-63 cells were treated with 100 nmol/L RAPA combined with 0.5 mg/L ADM. At this moment, CDI was less than 0.7 and the two drugs showed a significant synergistic effect. According to the optimal combination concentration, we randomly divided MG-63 cells in logarithmic growth phase into five groups: ADM group (treated with 0.5 mg/L ADM), RAPA group (treated with 100 nmol/L RAPA), the combination group (treated with 0.5 mg/L ADM and 100 nmol/L RAPA), DMSO solvent group (treated with the same concentration of DMSO) and the blank control group (without any treatment). The cell proliferation ability was detected by MTT for 5 days. The expression levels of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) mRNA were analyzed by real-time PCR at 48 h. Results There was no significant difference in cell proliferation ability among these groups on day 1 and 2 (allP>0.05). The cell proliferation ability of the combination group was lower than those of the blank control group, DMSO solvent group, ADM group and RAPA group on day 3-5 (allP<0.05). The relative expression of HIF-1α, VEGF and MMP-2 mRNA in the combination group was significantly lower than that in the blank control group, DMSO solvent group, ADM group and RAPA group (allP<0.05). Conclusion RAPA combined with ADM may synergistically inhibit the proliferation of human osteosarcoma MG-63 cells by decreasing the expression of HIF-1α, VEGF, MMP-2 mRNA.

osteosarcoma; cell proliferation; Rapamycin; Adriamycin; drug sensitivity

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA05314、2014GXNSFAA118173)；廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(YB2014073)。

崔明星(1988-)，男，住院醫(yī)師，研究方向?yàn)楣峭饪萍膊〉脑\斷與治療。E-mail： cuimingxing1226@163.com

詹新立(1968-)，男，主任醫(yī)師、教授、博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榧怪强萍膊〉脑\斷與治療。E-mail： 3cstar@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.003

R738.1

A

1002-266X(2017)16-0008-04

2016-06-30)