張聞韻, 童 燕, 余建云, 陳鑫鑫, 王安明

(杭州師范大學 材料與化學化工學院，浙江 杭州 310036)

·綜合評述·

銀納米粒子生物催化合成的研究進展

張聞韻, 童 燕, 余建云, 陳鑫鑫, 王安明

(杭州師范大學 材料與化學化工學院，浙江 杭州 310036)

綜述了銀納米粒子生物催化合成的研究進展，重點闡述了以微生物(細菌、真菌、酵母和鏈霉菌)、植物浸取液(多酚類化合物和植物蛋白質(zhì))和酶(硝酸還原酶、辣根過氧化物酶和磷酸酶)等為催化劑或還原劑合成納米銀生物的方法，并對其未來發(fā)展進行了展望。參考文獻51篇。

銀納米粒子; 生物合成; 酵母菌; 酶; 植物浸取物; 交聯(lián)酶聚集體； 綜述

銀納米粒子同其他納米材料相同，處在原子簇和宏觀物體交界的過渡區(qū)域，具有表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應，近年來在多個領域的應用日益受到人們的重視。(1)抗菌應用方面，銀離子和含銀化合物可以殺死或抑制細菌、病毒、藻類和真菌，有對抗疾病的效果，又被稱為親生物金屬。當銀的粒徑達到納米級時,由于呈現(xiàn)出表面效應和量子效應,其抗菌性能將增大數(shù)千倍。因此納米銀在醫(yī)學領域的應用已經(jīng)成為研究的熱點。(2)環(huán)保應用方面，貴金屬納米顆粒由于表面等離基元共振[1]，能有效地吸收可見光，被廣泛運用于室內(nèi)污染控制。(3)納米銀粒子可以應用于表面增強拉曼散射技術(shù)(SERS)。(4)銀納米粒子在生物催化領域也有應用，本課題組[2]曾將納米銀粒子與酶蛋白共同組裝在二氧化硅載體表面，借助銀與蛋白質(zhì)所含氨基酸中氨基之間的作用，并用紅外光譜驗證了銀納米粒子對酶蛋白的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，同時，實驗結(jié)果證實銀的介入有效富集了酶催化的底物，增強了酶的催化活性。

傳統(tǒng)的納米銀合成方法主要包括物理法和化學法[3]。物理法原理比較簡單，是將大塊的單質(zhì)銀變成納米級的銀粒子。常用的制備方法有物理粉碎法、蒸發(fā)冷凝法、濺射法、霧化法、機械球磨法等[4]。物理法制備的納米銀質(zhì)量好、雜質(zhì)少，但所得納米銀粉末粒徑較大，分布不均勻。因此，物理法一般只適用于尺寸、形狀及性能要求不是太高的生產(chǎn)和制備[5]。除此之外，物理法對儀器和設備的要求較高，所用的設備昂貴，生產(chǎn)成本高且條件不易控制。化學制備納米銀的原理主要是使用還原劑將Ag1+還原為納米銀顆粒[6-7]。主要有液相化學還原法、光化學還原法[8]、電化學還原法、溶膠-凝膠法、微波輔助法[9]、微乳法[10]等。以魯志強等[11]報道的液相化學還原法為例，以聚乙烯醇(PVA)作分散劑，硼氫化鈉為還原劑，硝酸銀為前驅(qū)體，制得平均粒徑120 nm的納米粉。此外，隨著科技的發(fā)展，納米材料的化學制備方法也在不斷改進。江桂斌課題組[12]發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定存在的納米硫化銀(Ag2S-NPs)在環(huán)境濃度Fe3+作用下，明顯地轉(zhuǎn)化為AgNPs。光照下，Ag2S-NPs通過Fe3+還原為Fe2+時水溶液中生成的羥基自由基的氧化作用，釋放大量銀離子；而釋放的銀離子由于Fe2+的還原性，又逐漸轉(zhuǎn)化為AgNPs，引起銀離子濃度持續(xù)下降。這種在Fe3+作用下生成AgNPs的方式，為AgNPs的合成開辟了新的解決途徑，但是這種新型的AgNPs制備方法效率不高，納米銀粒子的分散效果也無進一步的優(yōu)化，因此該成果僅處于起步階段，現(xiàn)在依然使用傳統(tǒng)的化學方法合成納米銀粒子。然而想要用化學方法合成粒徑較小、性能較好的納米顆粒，很難避免以下缺陷：(a)使用有毒溶劑；(b)較多有害的副產(chǎn)物；(c)使用過量的溶解度較小的金屬前驅(qū)體；(d)為了得到穩(wěn)定的納米銀粒子需要加入穩(wěn)定劑、保護劑[5]，例如，硼氫化鈉等毒性較大的還原劑或覆蓋劑，限制了它在生物醫(yī)學中的應用，且不符合綠色化學的發(fā)展理念[13-15]。

隨著納米銀的應用被逐漸推廣，如何回收重新制備、如何更加低能高效地合成納米銀并將其投入工業(yè)生產(chǎn)是目前納米銀行業(yè)的重要研究問題。由于物理方法和化學方法存在耗能高或產(chǎn)生對環(huán)境有一定危害的副產(chǎn)物等大量弊端，與可持續(xù)發(fā)展理念相違背，因此生物合成方法應運而生[15-16]。生物合成法是采用生物材料或生物體天然合成納米微粒，無需高壓、高能耗、高溫或有毒化學品[18]。該方法簡單、容易控制、成本低、不污染環(huán)境[19-20]，且與化學還原法制得的納米銀相比，生物合成的納米顆粒更加穩(wěn)定，且方法更為安全、低毒，越來越受到研究者的青睞，成為近幾年的研究焦點[21-22]。

生物合成納米銀的方法有兩種： 細胞內(nèi)合成法和細胞外合成法。細胞內(nèi)生物合成法，主要原理是細胞內(nèi)有一些酶可以引起金屬離子的還原，其機制尚未明確。主要涉及兩個過程，生物合成納米粒子以及納米粒子的純化。該合成方法純化過程極為復雜且成本較高。細胞外生物合成法是將細菌細胞從培養(yǎng)基中分離出來，使用上層清液來合成納米粒子。雖然胞外生物合成法的回收提取過程簡單廉價，但對于納米粒子的大限形狀有一定的限制，一般為10 nm～6 μm，該限制對納米銀粒子的制備和純化并不會有太大影響。

1 微生物介導催化合成納米銀

1.1 細菌介導催化合成納米銀

細菌是首次被報道可以合成納米銀的微生物體系。細菌擁有易處理和遺傳操作等優(yōu)良的特點，被認為是最有效的環(huán)保型納米工廠[18]。截止目前，大腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌屬、節(jié)細菌屬、芽孢桿菌和不動桿菌等原核生物制備納米銀的合成方法已被報道[23]。

然而金屬銀自古以來就有廣泛的抗菌作用，對細菌有較大的毒性，如何保證細菌在高濃度銀離子的環(huán)境中良好的存活下來成為細菌合成納米銀的一大難題。研究發(fā)現(xiàn)，Azospirillum固氮螺菌，在高濃度的金屬離子中能較好的存活，并能較好的生物還原金屬離子。在此基礎上其原理得以證實，Azospirillum固氮螺菌能促使金屬離子的絡合失活，再加上其細胞壁的抗?jié)B性及生物還原性，外排系統(tǒng)的耐藥性等一系列作用，減弱了環(huán)境的毒性，進而增強細菌對銀離子毒性的抵抗能力，在高濃度的金屬離子環(huán)境中依然保證還原的效率,這為細菌合成納米銀粒子提供了重要的突破口。針對這一特性， Kupryashina等[24]使用Azospirillum固氮螺菌作為還原劑，得到10～80 nm的銀微粒。為進一步證實其真正作用于銀離子還原過程的物質(zhì)為Mn-過氧化物酶，通過進一步實驗，提取純化Azospirillum固氮螺菌中的Mn-過氧化物酶，將其加入實驗中，于室溫反應12 h，成功合成粒徑為9～40 nm的較為穩(wěn)定的納米銀粒子(圖1)，經(jīng)表征發(fā)現(xiàn)，在純化的酶參與后制得的納米銀其穩(wěn)定性大大增強，在10 d內(nèi)不發(fā)生聚集或絮凝。Mn-過氧化物酶含有氧化還原酶血紅素，能催化許多芳香族、雜環(huán)化合物和有機物質(zhì)進行氧化分解。Mn-過氧化酶的催化活性主要取決于酶中的Mn2+， Mn2+能在底物上獨立作用， Mn-過氧化酶作為一個經(jīng)典的過氧化酶，在反應中會形成過氧化氫，因此Kupryashina等猜測納米銀的還原與過氧化氫有較為密切的關系。

圖1 Azospirillum固氮螺菌內(nèi)Mn-過氧化物酶 催化合成銀納米粒子的TEM圖Figure 1 TEM of silver nanoparticles synthesized by Mn-dependent peroxidase from Azospirillum

表皮葡萄球菌能在細胞內(nèi)生物合成納米銀，且合成的納米銀在反應完成后，能夠均勻地分布在整個細胞質(zhì)和細胞壁外表面，大大簡化了納米銀粒子的純化步驟，并且促進了細胞組分的回收利用。葡萄菌是通過“排毒”的途徑合成納米銀粒子。這種途徑巧妙地避開了金屬粒子的毒性，并捕獲它們，通過微生物中的硝酸還原酶及糖在細胞質(zhì)和細胞壁的部位進行銀離子的還原，經(jīng)研究證實，硝酸還原酶對金屬離子的還原是有效的，生化試驗表明，表皮葡萄球菌(ATCC 12228)在硝酸還原酶試驗中顯示為弱陽性。

Amin等[25]嘗試了以AgNO3溶液為銀源，在細胞內(nèi)成功合成納米銀離子，將其較為均勻地分散于細胞的整個細胞質(zhì)和細胞壁的外表面(圖2)，使用凝膠電泳技術(shù)分離出納米銀粒子，所得的納米粒子大小均勻，平均分布在40 nm以下。表征后發(fā)現(xiàn)用生物方法合成的納米銀粒子在表面有一層天然的保護層，與化學合成的納米銀粒子相比，具有更好的抗強光性、抗聚集性和低毒性，性能更為優(yōu)越，應用空間也更為廣泛。

圖2 在表皮葡萄球菌的細胞內(nèi)合成銀納米的TEM圖Figure 2 TEM images of intracellular biosynthesis of silver nanoparticles in Staphylococcus epidermidis

圖3 產(chǎn)堿菌還原硝酸銀合成AgNPs的SEM圖Figure 3 FE-TEM images of AgNPs by Variovorax guangxiensis THG-SQL3

Guangxiensis產(chǎn)堿菌THG-SQL3是一種促進植物生長的菌種，易從土壤中分離得到，它還能降解苯丙氨酸、對苯二甲酸二甲酯和多種除草劑等有害物質(zhì)。Du等[26]使用Guangxiensis產(chǎn)堿菌 THG-SQL3還原Ag+，于28 ℃反應24 h胞外合成納米銀粒子，高速離心分離出納米銀粒子，其徑粒在10～40 nm之間且呈不規(guī)則的球形(圖3)。該納米銀粒子對多種病原體包括黃色葡萄球菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌等都具有非常好的抗菌活性，由于其原料取材方便、綠色，在未來的生物合成納米銀領域具有很好的發(fā)展前景。

Mb是由甲烷氧化菌向胞外分泌的與銅結(jié)合的小肽，Mb除與銅結(jié)合外也能與金、鐵、鎳、鋅、鈷、鈣和汞等金屬結(jié)合。Mb能夠?qū)u(III)還原成Au(0)形成納米金，Mb起到雙重作用，既為還原劑又為保護劑。同時，Mb介導合成的納米金在大小和形態(tài)上與其他方法相比有著明顯的優(yōu)勢，這種優(yōu)勢同樣可以運用于納米銀的合成。范洪臣等[27]以硝酸銀為前體物，使用甲烷氧化菌一步制得納米銀，其中甲烷氧化菌素(Mb)為還原劑，將Ag+還原為Ag，得到納米銀粒子(AgNPs)，其中Mb吸附在形成的AgNPs表面起到保護劑作用，避免AgNPs聚集沉淀。在此研究成果基礎上，該團隊提出其反應機制(圖4)。

圖4 甲烷氧化菌素(Mb)還原Ag+的反應機制Figure 4 Proposed mechanism of the formation of Ag+ by Mb

1.2 真菌介導催化合成納米銀

近年來有不少生物法合成AgNPs的報道，微生物材料是目前最常見的生物還原材料，但是采用細菌合成的納米材料大多數(shù)分布在菌體細胞內(nèi)部，給納米顆粒的下游純化加工帶來了一定的困難，從而限制了其應用。真菌具有較高的金屬離子耐受性，能高效分泌大量的胞外酶和蛋白質(zhì)作為還原劑和包覆劑，進行細胞外合成納米顆粒，使得胞外合成成為可能。同時真菌的擴大培養(yǎng)較為快捷且其下游的分離純化步驟較為簡便[28]，因此利用真菌合成納米銀具有廣闊的發(fā)展前景[29]。

目前，經(jīng)報道成功合成納米銀粒子的真菌已有酵母菌株MKY3、白色念珠菌、白念珠菌、布拉酵母菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌等單細胞真菌[30]。

圖5 真菌生物合成納米顆粒的假設模型Figure 5 Hypothetical model of nanoparticles biosynthesis by Fungus

圖6 裂褶菌制備納米銀的SEM圖Figure 6 SEM images of extra cellular silver nanoparticles produced by S.commune

Dhillon等[18]對目前納米粒子綠色合成方法的綜述中，提出了真菌合成納米顆粒的假想模型，認為真菌合成納米銀主要分為四步：第一，金屬離子與細胞壁中的酶之間的靜電相互作用；第二，酶將M+還原到M0狀態(tài)；第三，細胞內(nèi)合成納米粒子；第四，真菌胞外合成納米顆粒(圖5)。裂褶菌(Schizophyllum commune)是一種蘑菇菌(mushroom fungus)菌中分泌的生物酶和蛋白質(zhì)可作為合成納米銀的還原劑和包覆劑，在氨基酸、多糖和維生素以及其他雜環(huán)化合物的輔助下，將銀離子還原為銀單質(zhì)后聚合生成納米銀粒子，且其所生成的納米銀粒子均勻地粘附在細胞壁上，通過過濾和離心即可獲得較為純凈的納米銀粒子。Arun等[31]使用該種方法，成功合成較高產(chǎn)率的納米銀粒子(圖6)。

寄存在寄主植物的組織內(nèi)，且對寄主的生命并不造成危害的真菌稱為內(nèi)生真菌。Balakumaran等[32]從柑橘葉中分離內(nèi)生真菌G.mangiferae(圖7)，使用G.mangiferae合成銀納米粒子，反應12 h即可得到粒徑為8～20 nm的球形納米粒子。該方法具有高度的生物相容性，能廣泛適用，在生物、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等行業(yè)具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

植物病原真菌Macrophominaphaseolina(Tassi)Goid是一種較為優(yōu)良的生物還原試劑。真菌的菌絲墊能承受壓力、攪拌或其他生物反應條件，且真菌胞外分泌的還原性蛋白在合成納米銀中能避免不必要的細胞干擾，因此能在納米銀的合成中直接使用。Macrophominaphaseolina(Tassi)Goid能分泌胞外還原酶如萘醌和蒽醌類物質(zhì)，能將Ag+還原為Ag0。由于能產(chǎn)生大批量相對較純的還原酶，真菌介導法是特別有利的大規(guī)模的合成納米顆粒的高效生物方法。

圖7 內(nèi)生真菌G.mangiferae還原納米銀粒子的SEM圖Figure 7 SEM images of silver nanoparticles synthesized from G.mangiferae

Chowdhury等[33]使用植物病原真菌Macrophominaphaseolina的無細胞濾液合成納米銀粒子。反應24 h通過簡單過濾便可得到粒徑為5～40 nm的納米銀粒子(圖8)。其中85-kDa蛋白質(zhì)作為覆蓋劑并負責合成納米銀。使用該方法合成的納米銀粒子對人體和植物病原菌具有多重耐藥的抗菌活性，對微生物的生長具有較好的抑制效果，在生物、醫(yī)用領域具有較為良好的發(fā)展前景。

1.3 酵母介導催化合成納米銀

作為世界上最廣泛應用的微生物，酵母菌在食品加工等領域被廣泛應用，但合成納米粒子的報道卻鮮有人知。Eugenio等[30]從白蟻腸道中分離出酵母，首次用酵母菌在多種光譜技術(shù)的輔助下胞外成功合成納米銀粒子，且是粒徑在2～10 nm間的球形的納米銀粒子(圖9)。由于該方法制得的納米粒子具有較大的比表面積，在催化工業(yè)具有較為強大的潛在發(fā)展。除此之外，他們還對所獲得的納米銀粒子進行了抗菌測試，結(jié)果表明，該納米銀粒子具有強強的殺菌性能，對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌的抗菌性能良好?？梢?，使用酵母菌合成的納米銀粒子在工業(yè)生物領域，特別是在微生物工業(yè)領域具有較好的發(fā)展前景。

圖8 植物病原真菌M. phaseolina介導還原納米銀 的電子顯微照片F(xiàn)igure 8 Electron micrographs of silver nanoparticles with M. phaseolina

圖9 酵母菌株體外合成納米銀粒子的HR-TEM圖Figure 9 HR-TEM of the nanoparticles biosynthesized by SNPP2

1.4 鏈霉菌介導催化合成納米銀

鏈霉菌是一種較為重要的真菌。75%的天然抗生素產(chǎn)自于土壤中鏈霉菌屬，以至于生物能夠適應土壤中重金屬及酸性的環(huán)境。除此之外，鏈霉菌屬的多種次生代謝產(chǎn)物也具有獨特的潛在能力，可廣泛應用于如抗生素、免疫抑制劑等其他生物活性化合物的制備。開發(fā)鏈霉菌并將其運用于納米技術(shù)近年來廣受重視。

Desai等[34]用鏈霉菌sp. GUT 21的上層清液中的二代代謝產(chǎn)物作為還原劑，在熱水中制備納米銀粒子，得到粒徑在23～48 nm的球形納米銀粒子(圖10)。鏈霉菌提取物作為覆蓋劑和穩(wěn)定劑在高溫高壓過程中能夠防止納米銀的進一步聚集和團聚，得到分散性良好的納米銀粒子。通過抗菌性測試，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌(MTCC 9537)、克雷白氏桿菌(MTCC109)、綠濃桿菌(MTCC1688)、金黃色釀膿葡萄球菌(MTCC 96)等都具有良好的抗菌作用。

圖10 鏈霉菌sp.GUT 21介導還原納米 銀粒子的AFM圖Figure 10 AFM image of biosynthesised AgNPs from Streptomyces sp.GUT 21

2 植物浸取液合成納米銀

作為新興的制備方法，生物還原法采用的生物源中，植物是非常理想的合成納米粒子的材料。植物由于其次生代謝物具有強還原電位，且在還原金屬離子時可同時作為穩(wěn)定劑和還原劑[35]。利用植物的浸取液為還原劑還原Ag+溶液得到納米粒子，既能還原Ag+得到納米粒子，又能保護環(huán)境，成為近幾年的研究熱點[36]。另外，相對于真菌和細菌，植物對于金屬毒性不太敏感，無需培養(yǎng)，解除了無菌條件的限制，是一種新興的生物合成納米粒子材料[35]。與物理和化學方法相比，由植物合成納米粒子的速率更快，且其本身可作為一種覆蓋劑，使得所產(chǎn)生的納米粒子是更穩(wěn)定[37]。植物中的多種植物化學物質(zhì)在金屬銀離子的環(huán)境中可作為合成納米銀的還原劑，例如萜類化合物、黃酮類、苯酚衍生物、植物酶(氫化酶、還原酶、醌類)及其衍生物等。由于植物合成納米金屬是在細胞內(nèi)合成的，而細胞內(nèi)固有的并發(fā)癥等原因，使得顆粒的分離變得困難，植物浸取液便很好的解決了這個問題。已發(fā)現(xiàn)的用來制備納米銀粒子的植物有很多，金錢草[38]、印楝葉[39]、蒼耳子[40]、播娘蒿[41]、丁癸草[42]、綠茶[43]、普洱茶[43]、西瓜[44]、夾竹桃[45]等植物提取液都可制備出納米銀。從植物中尋找高效、廉價、低毒的天然還原劑成為目前抗氧化劑發(fā)展的一個必然趨勢。

2.1 多酚類化合物還原納米銀粒子

蒼耳子屬菊科，俗稱蒼耳，在印度是一種常見的雜草。研究顯示，該植物的化學成分多樣，如生物堿、黃酮類、萜類、單寧、茶多酚、鞣質(zhì)、皂苷類、醌類、蛋白質(zhì)和糖類。Kumar等[40]對蒼耳葉提取物進行了研究，發(fā)現(xiàn)其有較高含量的單寧等多酚類化合物，具有潛在的快速合成納米銀粒子的功能。該團隊采用生物還原法，用蒼耳子水提取物為原料，以其中的單寧等多酚類化合物為還原劑，以浸取液中的蛋白質(zhì)分子為穩(wěn)定劑，在無任何儀器的支持或外部能源供應(加熱和攪拌)的情況下，通過光誘導過程在40 s內(nèi)快速高效地把Ag+從AgNO3溶液中還原為Ag，得到納米銀粒子。他們在此基礎上提出了反應機理(圖11)。當反應混合物暴露在陽光下，單寧分子吸收了光子的能量，其中n組參與反應的(R-OH)并且通過釋放的O-H中的H+，將Ag+生物還原得到Ag。

圖11 蒼耳子水提取物還原合成納米銀的機理Figure 11 The schematic representation of synthesis silver nanoparticle using aqueous extract of Xanthium strumarium

圖12 蒼耳子水提取物還原合成納米銀的AFM圖Figure 12 AFM images of biosynthesized AgNPs using aqueous extract of Xanthium strumarium

圖13 綠茶浸取液還原合成納米銀的SEM圖Figure 13 TEM of nano silver powder with green tea

圖14 夾竹桃葉水提取物還原合成納米的SEM圖Figure 14 SEM images of silver nanoparticles using aqueous leaf extract of Thevetia peruviana Juss

他們對合成工藝進行了優(yōu)化，得出最佳條件，得到粒徑為12～34 nm的球形納米銀(圖12)。

綠茶是指釆取茶樹新葉，未經(jīng)發(fā)酵，經(jīng)殺青、揉掙、干燥等工藝制成的茶，沖泡后茶湯較多的保存了鮮茶葉較多的天然物質(zhì)。綠茶浸泡后，可以用水作溶劑萃取它的活性物質(zhì)。其主要活性成分為茶多酚，占茶葉干質(zhì)量的20～35%。茶葉中水溶性有效成分主要是黃焼醇、黃燒雙醇、生物堿、粉酸、茶黃素、茶紅素和氨基酸等。

由于茶葉中的茶多酚有極強的抗氧化性，以茶葉浸取液中的茶多酚及黃酮類化合物為還原劑，在反應中可同時起還原和分散作用。王迎春等[43]采用綠茶提取液生物合成納米銀，制得球形的納米銀粒子，平均粒徑在32.4 nm。制備的最佳條件是AgNO3濃度為0.08 mol·L-1，綠茶與水的配比為1 g/80 mL，不添加任何表面活性劑，于40 ℃反應2 h，快速得到徑粒大約為30 nm的納米銀粒子(圖13)。

黃花夾竹桃，是一種常綠觀賞植物，雙子葉的灌木。該植物原產(chǎn)于美國中部和南部，常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)。黃花夾竹桃葉存在酚類、蛋白質(zhì)、黃酮醇苷。之前使用T.夾竹桃乳膠合成銀納米粒子已被報道。Oluwaniyi等[45]以植物介導法用黃花夾竹桃葉水提取物快速合成納米銀粒子，得到平均粒徑在18.1 nm的球形納米銀粒子(圖14)，確定了夾竹桃作為一個潛在合成納米銀的有效功能，且該納米銀粒子對真菌病原體和細菌具有抑制作用。

他們發(fā)現(xiàn)夾竹桃葉中的黃酮苷多酚基團具有較強的還原性能，并對其還原銀離子的機理做出了大膽猜測：可能是黃酮苷多酚類物質(zhì)還原了Ag+從而得到納米銀粒子，糖苷中的羥基和羰基在納米銀的還原中作為還原劑和穩(wěn)定劑(圖15)。

圖15 黃酮苷多酚類物質(zhì)還原Ag+的機理Figure 15 Possible bioreduction mechanism of Ag+reduced by flavanone glucoside

圖16 播娘蒿浸取液還原合成納米銀粒子的TEM圖Figure 16 TEM images of the synthesized silver nanoparticles in different scales

圖17 利用紅豆杉愈傷組織合成的納米銀粒子的SEM圖Figure 17 TEM image of AgNPs synthesized using callus extracts from T. yunnanensis and AgNO3

播娘蒿索菲亞(播娘蒿)是一年生雙子葉植物屬十字花科(十字花科)，它的種子在民間是常用的藥物，用于治療咽喉疾病。這種植物的種子含有多種次生代謝產(chǎn)物，如強心苷、黃酮類、內(nèi)酯類、脂類、硫苷、木脂素和香豆素。Khatami等[41]以播娘蒿sophia種子提取液來合成納米銀，得到一種有效的納米銀粒子合成方法。在該種子提取液中，存在各種水溶性代謝產(chǎn)物(如生物堿、酚類化合物、萜類化合物)和輔酶，使得該浸取液具有還原納米粒子的能力。該團隊得到粒徑在1～35 nm的球形納米銀粒子，且經(jīng)表征其均勻度高、穩(wěn)定性較強(圖16)。

納米技術(shù)的進展及其應用已經(jīng)擴展到不同的生物領域。然而，在使用藥物植物及其愈傷組織培養(yǎng)來合成納米粒子的方法還比較新穎需要進一步研究。據(jù)報道，木瓜、海馬齒及苜蓿植物愈傷組織已應用于納米銀的綠色合成。

紅豆杉愈傷組織提取物中含有次生代謝產(chǎn)物包括紫杉烷類化合物、木脂素、多糖、酚類化合物等。其中植物的多糖和酚類化合物可作還原劑和包覆劑綠色合成納米銀顆粒。Xia等[46]用云南紅豆杉愈傷組織進行綠色合成納米銀粒子，得到粒徑為6.8～27.2 nm的球形納米銀粒子(圖17)。

近年來，各種藥用植物材料、微生物、酶、農(nóng)業(yè)廢棄物和食品廢棄物的綜合利用已發(fā)生了革命性的發(fā)展。西瓜是一種最為豐富的食用水果，西瓜紅色的果肉可以食用，但外皮是沒有商業(yè)價值的廢物。然而，西瓜皮是多種生物活性物質(zhì)，富含纖維素、瓜氨酸、果膠、蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素，將西瓜皮作為納米銀的合成方法回收利用，是一種值得推廣的方法。

Patra等[44]回收利用農(nóng)業(yè)廢棄物——西瓜皮(一種新型的生物性垃圾)，利用西瓜皮提取液來合成納米銀粒子，是一種合成納米粒子的低成本的開發(fā)方法。其中西瓜皮中富含黃酮類化合物，酚類化合物、番茄紅素、瓜氨酸等，由于具有這些物質(zhì)，西瓜皮提取液可充當還原劑、穩(wěn)定劑和覆蓋劑用于合成納米銀粒子。所得的納米銀粒子，在光波長為425 nm處有表面等離子體共振，其平均粒徑為109.97 nm。

2.2 植物蛋白質(zhì)還原合成納米銀粒子

大葉山螞蝗是一種重要的草藥的藥用植物，屬蝶形花科，有較大的醫(yī)用價值，其中含有豐富的黃酮類、生物堿、有機酸、紫檀堿。Thirunavoukkarasu等[38]通過大葉山螞蝗的提取物合成納米銀顆粒。以金錢草的水合提取物為原料，還原AgNO3溶液中的Ag+粒子，快速合成多晶結(jié)構(gòu)的納米銀顆粒，其尺寸在18～39 nm，該納米銀粒子穩(wěn)定性極強，在多個星期后仍然不發(fā)生凝聚。在表征過程中，觀察到紫外可見光譜中約300 nm處存在一吸收帶，并證實這條吸收帶是由于在蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸殘基的電子激發(fā)產(chǎn)生的。因此推測出可能是大葉山螞蝗葉中的生物合成產(chǎn)物或還原輔助因子在合成過程中起到了還原納米銀粒子的作用。

與微生物相似，植物能夠在受污染的土壤或水源中凈化重金屬離子，甚至可以將其誘導在植物的相關部位中超累積。而在植物內(nèi)部的絡合金屬離子能與一個合適的生物配位體發(fā)生氧化還原反應，有一個高價態(tài)還原為一個低價態(tài)。這就為生物還原納米銀粒子提供了一種新的合成方式。其中，由于植物蛋白質(zhì)中的羰基化合物具有很強的結(jié)合金屬能力，因此植物提取液在作為還原劑的同時還可以作為封端劑，保護納米粒子防止其團聚。

印楝葉是一種在例如印度這種熱帶國家被廣泛使用的植物。印楝葉的主要成分為苦楝素，印楝素，印楝寧，油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸等。Nazeruddin等[39]使用印楝葉提取液作為還原劑，在不添加任何表面活性劑或者外部能量的條件下，室溫反應1～2 h細胞外快速合成納米銀，得到球形、非均勻的分散型納米粒子，平均粒徑為11.5 nm(圖18)。經(jīng)檢測，該納米銀粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性良好，可用于增強靶向給藥治療效果且副作用最小。

法國薔薇是一種使用廣泛的醫(yī)用植物，具有抗菌和治療風濕寧的作用。該植物浸取液中的羰基能夠除去芳香族化合物(例如苯)生成納米粒子，通過納米銀粒子表面有機化合物的檢測進一步證實了銀離子的還原機制。LuisLópez-Miranda等[47]使用法國薔薇的植物浸取液作為還原劑和穩(wěn)定劑，在常溫下以硝酸銀為銀源，能夠快速合成納米銀粒子。該納米銀粒子粒徑為5～40 nm，呈面心立方體，平均粒徑為12 nm(圖19)，且對大腸桿菌等有較好的抗菌活性。

圖18 印楝葉提取液合成的納米銀的TEM圖Figure 18 TEM image for silver showing size of nanoparticles using Azadirachta indica leaf extract

3 酶催化合成

體外酶催化反應是目前被廣泛認可的替代傳統(tǒng)(非生物)的復雜天然產(chǎn)物和有機小分子的合成方法，在銀納米粒子合成中也不例外。使用可溶性形式的純化酶，不僅產(chǎn)生廢物，還限制了酶的再利用。此外，在純化制得的納米銀中，可溶性酶無可避免成為其中的雜質(zhì)。固定化酶的使用就恰好避開了這個問題，它不僅可以使酶重復使用，并且可以減少納米粒子的下游步驟，做到高效的分離，高效的利用。

圖19 a)法國薔薇浸取液還原合成的納米銀的SEM圖； c)法國薔薇浸取液還原合成的納米銀的TEM圖; d)納米銀晶面的HR-TEM圖Figure 19 Analysis of electron microscopy of AgNps synthesized with Tamarix gallica extract: a) SEM image; c) TEM micrograph; d) HR-TEM micrograph showing the crystal planes of silver

3.1 硝酸還原酶

尖孢鐮刀菌細胞提取液可以合成納米銀粒子,主要原因是含其有NADH-dependent硝酸還原酶，因此可從尖孢鐮刀菌提取物中提取出純的NADH-dependent硝酸還原酶還原AgNO3溶液中的Ag+來合成納米銀粒子。交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)實質(zhì)上就是將酶沉積，在可溶的游離酶中加入鹽或者有機溶劑，用戊二醛交聯(lián)形成酶聚集體。由于能進行亞基交聯(lián)，CLEAs在固定化酶的方式中能形成一種穩(wěn)定的多聚體酶的四級結(jié)構(gòu)。與載體結(jié)合的固定化技術(shù)相比，CLEAs具有極高的時空效率，這就很好的避免了固體載體對活性的稀釋。

Talekar等[48]使用穩(wěn)定的CLEAs固定化NADH-dependent硝酸還原酶，使用硫酸銨促進8 mmol·L-1NADH-dependent硝酸還原酶進行交聯(lián)聚合，反應4 h形成聚集體，該固定化酶具有93%的活性回收率，具有可重用性和熱穩(wěn)定性。且由于CLEAs的粒子的尺寸遠大于納米顆粒，只需要低速離心或者簡單過濾就可以簡單的將CLEAs粒子從反應混合物中分離離心，整個過程操作簡單低耗。最終得到球形的納米銀粒子，其粒徑在10～20 nm(圖20)。在此基礎上還成功地進行了循環(huán)四個周期的納米銀粒子批量生產(chǎn)。

圖20 使用CLEAs固定化酶合成納米銀的TEM圖Figure 20 TEM image of silver nanoparticles synthesized with CLEAs

圖21 辣根過氧化酶催化沉積納米銀機理Figure 21 The mechanism of enzyme-catalyzed deposition of silver nanoparticles

圖22 辣根過氧化氫促使酶沉積的生長機制示意圖Figure 22 Schematic sketch displaying the growth mechanism of the silver EGNP

圖23 用不同起始DNA濃度制備納米銀的SEM圖Figure 23 SEM images of silver EGNPs grown from different starting DNA concentrations

3.2 辣根過氧化物酶(HRP)

酶催化銀沉積法是常見的酶催化合成納米銀的方法。Conzuelo等[49]使用H2O2溶液為底物，對苯二酚(HQ)為氧化還原介質(zhì)，硝酸銀為銀源，在檸檬酸鹽緩沖液的緩沖作用下，使用辣根過氧化物酶催化沉積納米銀(圖21)。辣根過氧化物酶是由納米探針所獲得的一種專門設計的增強性試劑。誘導銀沉積的效率較高，其優(yōu)點是反應快速及具有高靈敏度。

沙漠玫瑰銀納米粒子由單一的純銀結(jié)晶板構(gòu)成。Schneidewind等[50]以SERS為基底，使用辣根過氧化酶催化沉積納米銀，得到沙漠玫瑰形態(tài)的納米銀粒子。具體操作步驟如下，經(jīng)過初步的基板清洗和準備，第一步，將一個使用氨基修飾的單鏈DNA綁定到襯底上。第二步，辣根過氧化物酶(HRP)作用并結(jié)合到DNA上。第三步，通過酶的催化反應，銀沉積被激活，進而促進銀的生長(圖22)。

在該酶的附近，一個氧原子被從過氧化氫中分離出來，與辣根過氧化物酶的血紅素組相連接，從而改變分子內(nèi)的鐵原子的氧化態(tài)。在這個過程中，電子給體釋放電子以還原生成銀粒子。

通過證實，沉積的納米銀無其他雜質(zhì)，為純銀物質(zhì)。在反應1～5 min內(nèi)便可觀察到彼此連接、相當致密的銀納米粒子陣列，而在進一步生長的過程中，生成的納米銀粒子可作為種子，在酶催化和納米銀粒子作為“晶種”的共同作用下繼續(xù)生成納米銀粒子。該沉積制備納米銀的方法快速高效，在DNA濃度為1 μm的條件下，反應不到5 min，便可獲得致密的銀納米粒子的薄膜(圖23)。

3.3 磷酸酶

堿性磷酸酶(AP)以3-吲哚磷酸鹽為底物，將Ag+還原為Ag0的納米銀，并將納米銀從溶液中剝離并沉積，可使用陽極溶出伏安法完成較為靈敏的相應測定。該方法還可作為酶傳感器，檢測核酸自溶素基因、人類病原體肺炎鏈球菌的基因組的致病因素等方面。Fanjul-Bolado等[51]以為堿性磷酸酶的電化學底物，成功用堿性磷酸酶催化沉積Ag+還原為納米銀粒子，并提出了該酶促反應的機理(圖24)。在堿性磷酸酶的存在下，3-吲哚磷酸鹽3-位發(fā)生水解，生成一種吲哚中間體。在中間體兩兩聚合的過程中，Ag+被還原為Ag0。

LimoniaAcidissima是一種落葉直立林木，俗稱木蘋果或像蘋果，原產(chǎn)于印度、巴基斯坦、斯里蘭卡和南洋，它具有廣泛的生物活性，例如抗糖尿病、保肝活性和抗真菌活性。Pawar等[52]從LimoniaAcidissima分離出紫色酸性磷酸酶作為還原劑和穩(wěn)定劑，用酶催化法合成銀納米粒子，作為一種新合成銀納米粒子的方法。其中，脫輔基酶蛋白作為還原劑和穩(wěn)定劑，得到粒徑為25～45 nm的納米銀粒子(圖25)。

圖24 使用3-吲哚磷酸鹽堿性磷酸酶還原納米銀的酶促反應機理Figure 24 Enzymatic reaction in the presence of alkaline phosphatase using 3-indoxyl phosphate

圖25 酸性磷酸酶催化還原納米銀粒子的SEM圖Figure 25 TEM image of silver/silver oxide nanoparticles

納米材料的生物合成屬于交叉學科研究，既追求納米技術(shù)的實用性、前沿性，又融合了生物技術(shù)的嚴謹性、多樣性。與傳統(tǒng)的物理、化學合成方法相比較，生物合成方法低能耗、無毒環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展。本文主要闡述了三種新型的生物合成納米銀的方式。其合成過程主要利用了生物自身的物質(zhì)，如酶、蛋白質(zhì)、植物提取液或愈傷組織等，通過氧化還原反應，還原銀離子生成相應的納米銀粒子。隨著納米金屬粒子的合成和生物技術(shù)的緊密結(jié)合，納米材料的生物合成將不僅僅局限于基礎的生物提取物的使用，如何高效地提取生物合成有效成分進行新型生物納米材料的合成將是今后熱門的研究要點。隨著納米材料的廣泛應用以及可持續(xù)發(fā)展理念的深入貫徹，納米材料的生物合成也必將在未來的新型材料制備方面發(fā)揮重要的作用。

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《合成化學》約稿函

尊敬的各位專家學者：

《合成化學》自1993年創(chuàng)刊以來，在各位專家學者的支持下得到了快速發(fā)展。于2008年和2011年兩次入選"中文核心期刊要目總覽(化學類)"。2003年以來被連續(xù)收錄為"中國科技論文統(tǒng)計源期刊"(中國科技核心期刊)。2003年度在"CA收錄千種表"中名列第710名(中國入選科技期刊的第39名)。1999年至今被"中國科學文獻計量評價研究中心"認證為《中國科學引文數(shù)據(jù)庫》來源期刊(CSCD)。2014年入選《中國學術(shù)期刊影響因子年報》統(tǒng)計源期刊。

為了進一步提升《合成化學》的學術(shù)質(zhì)量和影響力，特向各位專家學者約稿。編輯部將采取以下鼓勵性措施：

1、對于學術(shù)質(zhì)量較高的研究論文進行網(wǎng)絡優(yōu)先出版，并全額免除版面費。

2、對于排隊出版的快遞論文、研究簡報、制藥技術(shù)及綜合評述類文章，版面費統(tǒng)一降低為：1000元/篇(即超出4頁的部分不再收取費用)。

3、以上措施適用于2016年6月1日起所投稿件，未盡事宜，可來電來函咨詢。

本次約稿是《合成化學》建刊以來的首次大膽嘗試，在實際操作過程中可能會存在欠妥之處，請各位專家學者諒解并不吝賜教！誠盼各位專家學者踴躍投稿！

投稿網(wǎng)址： http://hchxcioc.com， Tel. 028-85255007， E-mail: hchx@cioc.ac.cn

《合成化學》編輯部

Research Progress in Biocatalytic Synthesis of Ag Nanoparticles

ZHANG Wen-yun, TONG Yan, YU Jian-yun, CHEN Xin-xin, WANG An-ming*

(College of Materials, Chemistry and Chemical Engineering, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

The research progress on the synthesis of silver nanoparticles was reviewed with 51 references. The biosynthesis of silver nanoparticles using microorganisms(Bacteria, Fungi, Yeast and Streptomyces), plant extracts(Polyphenols and Plant Proteins) and enzymes(Nitrate reductase, horseradish peroxidase and phosphatase) as catalysts or reducing agents were described in detail. Its future development is prospected.

silver nanoparticle; biosynthesis; yeast; enzyme; plant extract; cross-linked enzyme aggregate; review

2016-12-21;

2017-03-28

國家自然基金資助項目(21576062)； 教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助(IRT1231)； 浙江省自然科學基金資助項目(Y13B060058)； 杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關專項(20120232B13)； 杭州師范大學“本科生創(chuàng)新能力提升工程”項目(cx2016094)； 杭州師范大學教學2016年改革項目

張聞韻(1996-)，女，漢族，浙江臺州人，本科生，主要從事金屬納米粒子生物合成的研究。

王安明,副研究員，碩士生導師， E-mail： waming@hznu.edu.cn

Q814.9； O614.122

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.06.16317