劉玉娟，蔡秋娥， 張潔云,朱秀云,張明霞，陳獻(xiàn)雄

(1.深圳市第三人民醫(yī)院a.婦產(chǎn)科，b.研究所，廣東深圳 518112；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，廣東深圳 518060)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

結(jié)核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg細(xì)胞的表達(dá)*

劉玉娟1a，蔡秋娥1a， 張潔云1b,朱秀云1b,張明霞1b，陳獻(xiàn)雄2

(1.深圳市第三人民醫(yī)院a.婦產(chǎn)科，b.研究所，廣東深圳 518112；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，廣東深圳 518060)

目的 了解結(jié)核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg細(xì)胞免疫應(yīng)答情況，探討其在結(jié)核性盆腔炎發(fā)病中的作用。方法 采用胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分別檢測46例結(jié)核性盆腔炎患者治療前外周血TH17和Treg細(xì)胞的表達(dá)水平，以健康育齡期婦女25例作為對照，并對28例患者抗結(jié)核治療3個(gè)月和6個(gè)月后TH17/Treg細(xì)胞的變化情況進(jìn)行隨訪檢測。結(jié)果 結(jié)核性盆腔炎患者外周血TH17細(xì)胞的百分比為(3.26±1.30)%，明顯低于對照組(4.92±1.71)%(P<0.01)，Treg細(xì)胞的百分比為(5.18±1.53)%，明顯高于對照組(3.26±1.10)%(P<0.01)；結(jié)核性盆腔炎患者治療6個(gè)月后TH17細(xì)胞表達(dá)水平(4.67±1.75)%明顯高于治療前(3.26±1.30)%及治療3個(gè)月(3.70±1.06)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；治療6個(gè)月后Treg細(xì)胞表達(dá)水平為(3.93±0.94)%，明顯低于治療前(5.18±1.53)%及治療3個(gè)月(4.94±1.51)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；治療6個(gè)月后Treg細(xì)胞仍高于對照組(P<0.05)；治療前TH17/Treg細(xì)胞的比值較對照組明顯降低(P<0.01)，治療3個(gè)月后升高不明顯，治療6個(gè)月后TH17/Treg細(xì)胞的比值(1.18±0.34)%較治療3個(gè)月(0.77±0.21)%和治療前(0.55±0.13)%升高明顯(P均<0.01)，但仍未恢復(fù)至正常水平(P<0.01)。 結(jié)論 TH17/Treg細(xì)胞參與了結(jié)核性盆腔炎患者的免疫應(yīng)答，并存在TH17/Treg的失衡狀態(tài)。

結(jié)核性盆腔炎；TH17細(xì)胞； Treg細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

近年來不孕癥及不良妊娠結(jié)局中盆腔結(jié)核發(fā)病率明顯增高，由于臨床癥狀不典型和缺乏高敏感性及特異性的實(shí)驗(yàn)室檢測方法，使得臨床早期確診率極低[1]。而檢測結(jié)核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg在免疫應(yīng)答中的作用可為臨床早期診治提供新的依據(jù)。結(jié)核菌感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫以CD4+T細(xì)胞為主，其在清除體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌過程中具有重要的作用。以往的抗結(jié)核免疫研究多側(cè)重于CD4+T細(xì)胞TH1/TH2亞群[2]，近年來通過對TH17和Treg細(xì)胞在肺結(jié)核中的研究發(fā)現(xiàn)，TH17在結(jié)核免疫中起保護(hù)作用， Treg細(xì)胞則抑制結(jié)核免疫的發(fā)生[3-4]，但國內(nèi)外有關(guān)其在結(jié)核性盆腔炎中的臨床意義的報(bào)道少見。本研究通過檢測結(jié)核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg表達(dá)水平，探討TH17/Treg在結(jié)核性盆腔炎免疫及發(fā)病中的作用，報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2013年3月至2014年12月在深圳市第三人民醫(yī)院住院的結(jié)核性盆腔炎患者46例，年齡(32.4±5.0)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)腹腔鏡手術(shù)中見到粟粒樣結(jié)核結(jié)節(jié)、結(jié)核球或者干烙樣壞死，宮腔狹窄、瘢痕粘連甚至實(shí)變; (2)組織活檢發(fā)現(xiàn)結(jié)核特征性病理改變; (3)結(jié)核分枝桿菌抗酸染色、PCR法或者結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性。上述任何一項(xiàng)結(jié)果陽性，即可確診為結(jié)核性盆腔炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并HIV感染，滅活血清反應(yīng)素試驗(yàn)(USR)陽性，支原體、衣原體、淋球菌感染及內(nèi)外科嚴(yán)重合并癥，盆腔包塊性質(zhì)不明、腹腔鏡檢查腹膜有廣泛粘連者。以同期在本院就診的健康育齡期女性作為對照組，年齡(28.7±6.1)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 結(jié)核性盆腔炎患者治療方案及隨訪 采用異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺四聯(lián)藥物聯(lián)合，強(qiáng)化治療3個(gè)月，異煙肼、利福平、乙胺丁醇三聯(lián)鞏固治療9個(gè)月。治愈標(biāo)準(zhǔn)：規(guī)范治療1個(gè)療程，停藥動(dòng)態(tài)觀察1年，患者月經(jīng)量正常，無明顯痛經(jīng)，無盆腔包塊?；颊卟∏檗D(zhuǎn)歸：46例結(jié)核性盆腔炎患者隨訪至6個(gè)月時(shí)，失訪5例，肝功能損害8例，腎功能損害3例，藥物過敏1例，白細(xì)胞減少1例，其余28例經(jīng)過規(guī)范抗結(jié)核治療后治愈，隨訪至抗結(jié)核治療3個(gè)月、6個(gè)月，觀察其外周血TH17/Treg水平變化。

1.3 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液LymphoprepTM(10771-500ML)、佛波酯PMA(P1585-10MG)、離子霉素Ionomycin(C2230-50UG)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Brefeldin A(20350-15-6)均購自美國Sigma-Aldrich公司，小鼠抗人單克隆抗體CD3-APC(345767)、CD8-PerCP(345774)、Foxp3-PE(560046)、IL-17-Alexa Fluor?700(560613)，F(xiàn)ACS Lysing Solution溶血素(349202)、FACS Permeabilizing Solution破膜劑(554722)、Foxp3 Staining Buffer Set固定破膜劑(560409)均購自美國BD Biosciences公司。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)，ALLEGRA X-15R離心機(jī)(美國Beckman公司), CantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.4 胞內(nèi)流式細(xì)胞技術(shù)檢測TH17/Treg細(xì)胞表達(dá)

1.4.1 標(biāo)本前處理 收集結(jié)核性盆腔炎患者及健康育齡期女性空腹靜脈血5 mL，肝素鋰抗凝，取全血250 μL與750 μL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基充分混勻，加入終濃度分別為50 ng/mL PMA、1 μg/mL離子霉素Ionomycin，震蕩混勻后置于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下溫育1 h，在培養(yǎng)體系中加入阻斷因子Brefeldin A(終濃度10 μg/mL)，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下溫育5 h。

1.4.2 流式分析 取經(jīng)上述刺激后的血標(biāo)本，加入1×FACS Lysing Solution溶血素3 mL，置于4 ℃溶血5 min，1 500 r/min離心5 min，去上清；加入預(yù)冷PBS 3 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入Permeabilizing Solution試劑A 200 μL，置于4 ℃固定20 min，預(yù)冷PBS洗滌1次；加入1×Permeabilizing Solution試劑B 100 μL，重懸細(xì)胞，分別加入CD3-APC/CD8-PerCP/Foxp3-PE/IL-17-Alexa Fluor?700小鼠抗人單克隆抗體各5 μL，4 ℃避光溫育1 h，預(yù)冷PBS洗滌1次，離心棄上清，加入200 μL PBS重懸，用BD canto Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測，Diva軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，共收集106個(gè)細(xì)胞。采用CD3+CD8-細(xì)胞反圈門方法反映CD4+T 輔助細(xì)胞亞群的情況，根據(jù)FSC和SSC圈出淋巴細(xì)胞，然后根據(jù)CD3和CD8圈出CD3+CD8-細(xì)胞，以此代表CD4+T 輔助細(xì)胞亞群，并進(jìn)一步分析該群細(xì)胞IL-17/Foxp3表達(dá)的情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。計(jì)量資料多組樣本間比較用方差分析，兩組樣本間采用兩樣本的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg細(xì)胞表達(dá)水平 經(jīng)非特異性刺激后結(jié)核性盆腔炎患者TH17細(xì)胞比例為(3.26±1.30)%，對照組為(4.92±1.71)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.091，P<0.01)；此外，結(jié)核性盆腔炎患者Treg細(xì)胞比例為(5.18±1.53)%，明顯高于對照組的(3.26±1.10)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.577，P<0.01)。見圖1。

注：A，結(jié)核性盆腔炎患者;B,健康人對照組。

圖1 結(jié)核性盆腔炎患者和健康人對照外周血TH17細(xì)胞流式檢測結(jié)果

2.2 抗結(jié)核治療3、6個(gè)月后TH17/Treg細(xì)胞的變化情況 與治療前比較，治療3個(gè)月后TH17細(xì)胞及Treg細(xì)胞升高不明顯，但治療6個(gè)月后明顯升高(P<0.01)。此外，與治療前比較，治療3個(gè)月TH17/Treg比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療6個(gè)月與治療前及治療3個(gè)月相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。見表1。

表1 抗結(jié)核治療3、6個(gè)月TH17/Treg細(xì)胞的變化情況

注：與對照組比較，a，P<0.05；與治療前組比較，b，P<0.05；與治療3個(gè)月組比較，c，P<0.05。

3 討論

本研究檢測了結(jié)核性盆腔炎患者外周血TH17的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)患者TH17細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組，說明TH17細(xì)胞除了在肺結(jié)核患者體內(nèi)受到抑制外，在結(jié)核性盆腔炎患者體內(nèi)同樣受到抑制[5]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TH17細(xì)胞減少的數(shù)量與結(jié)核感染嚴(yán)重性成正比[6]。本研究通過對28例患者抗結(jié)核治療的隨訪發(fā)現(xiàn)，隨著療程的增加，TH17細(xì)胞呈逐漸上升的趨勢，抗結(jié)核治療3個(gè)月變化不明顯，治療6個(gè)月后TH17細(xì)胞基本恢復(fù)到正常水平，從另一個(gè)角度說明TH17細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中起到一定的保護(hù)作用。Treg細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在結(jié)核患者中起免疫抑制作用，其一方面通過抑制TH1細(xì)胞免疫反應(yīng),導(dǎo)致IFN-γ、IL-2分泌的減少,削弱機(jī)體免疫系統(tǒng)對感染結(jié)核分枝桿菌的清除,使結(jié)核感染慢性化[7]，另一方面通過抑制TH2細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致Treg對TH1 細(xì)胞的免疫抑制強(qiáng)于TH2細(xì)胞,從而致使結(jié)核患者的免疫失衡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核性盆腔炎患者Treg表達(dá)水平明顯高于對照者，治療3個(gè)月后，Treg細(xì)胞有一定程度的下降，繼續(xù)治療6個(gè)月時(shí)，Treg細(xì)胞明顯下降，但尚未下降至健康者水平。此外，本實(shí)驗(yàn)中檢測到的Treg細(xì)胞為PMA刺激后Foxp3+的細(xì)胞，檢測結(jié)果高于肺結(jié)核外周血未刺激的CD4+CD25+Foxp3+水平[2]，但低于張影等[9]在肺結(jié)核外周血中直接檢測的CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞水平，且抗結(jié)核治療后該群Treg細(xì)胞的一直處于較高水平。因此我們推測PMA刺激后的Treg細(xì)胞可能無法反映患者體內(nèi)天然Treg細(xì)胞的狀況，但TH17細(xì)胞的數(shù)量和抗結(jié)核治療的變化情況與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。治療前患者TH17/Treg的比值明顯降低，有效治療后逐漸升高，TH17/Treg失衡現(xiàn)象得到明顯改善。結(jié)果提示結(jié)核病的發(fā)生不僅與傳統(tǒng)的TH1/TH2細(xì)胞的失衡有關(guān)，TH17/Treg失衡在結(jié)核感染中同樣發(fā)揮著重要作用，數(shù)量過高、功能過強(qiáng)的Treg細(xì)胞不僅抑制了TH1 細(xì)胞的抗結(jié)核作用。更重要的是抑制和削弱了TH17細(xì)胞的保護(hù)性細(xì)胞免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致結(jié)核病的進(jìn)展。

[1]中國防癆協(xié)會臨床專業(yè)委員會. 結(jié)核病臨床診治進(jìn)展年度報(bào)告(2012 年)(第一部分結(jié)核病臨床診斷)[J].中國防癆雜志，2013，35(6): 405-426.

[2]Sabio Y García CA, Yokobori N, Basile JI,etal. C5aR contributes to the weak TH1 profile induced by an outbreak strain ofMycobacterium[J]. Tuberculosis(Edinb), 2017, 103:16-23.

[3]Balboa L, Kviatcovsky D, Schierloh P,etal. Monocyte-derived dendritic cells early exposed toMycobacteriumtuberculosisinduce an enhanced T helper 17 response and transfer mycobacterial antigens[J]. Int J Med Microbiol,2016, 306(7):541-553.

[4]Chen X, Zhou B, Li M,etal. CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells suppressMycobacteriumtuberculosisimmunity in patients with active disease[J]. Clin Immunol, 2007,123(1):50-59.

[5]Mourik BC, Lubberts E, de Steenwinkel JEM,etal. Interactions between type 1 interferons and the TH17 response in tuberculosis: lessons learned from autoimmune diseases[J]. Front Immunol,2017,8:294.

[6]Chen X, Zhang M,Liao M,etal. Reduced TH17 response in patients with tuberculosis correlates with IL-6R expression on CD4+T Cells[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,181(7):734-742.

[7]童新燈,李美忠,周伯平,等. CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在小鼠肺結(jié)核發(fā)生中的作用[J]. 中華傳染病雜志, 2009, 27(12)： 715-720

[8]陳心春,周伯平,鄧群益,等.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對肺結(jié)核患者特異細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用[J].中國防癆雜志,2008,30(3):165-169.

[9]張影,陸堅(jiān),侯志平,等. 肺結(jié)核患者療程中外周血輔助性和調(diào)節(jié)T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)研究[J]. 中國防癆雜志,2013,35(6):427-432.

(本文編輯：許曉蒙)

Analysis on TH17/Treg cells in patients with pelvic tuberculousis

LIUYu-juan1a,CAIQiu-e1a,ZHANGJie-yun1b,ZHUXiu-yun1b,ZHANGMing-xia1b,CHENXian-xiong2

(1a.DepartmentofObstetricsandGynecology, 1b.ResearchInstitute,TheThirdPeople′sHospitalofShenzhen,Shenzhen518112,Guangdong; 2.LaboratoryCenter,ShenzhenUniversitySchoolofMedicine,Shenzhen518060,Guangdong,China)

Objective To investigate the cellular immunologic response of TH17/Treg cells in the peripheral blood of pelvic tuberculosis patients and explore their roles in the pathogenesis of pelvic tuberculosis. Methods The intracellular flow cytometry was performed to evaluate the expressions of TH17 and Treg cells in 46 pelvic tuberculosis patients and 25 healthy controls in childbearing age. Twenty-eight of the 46 pelvic tuberculosis patients were followed up to monitor the variation of the TH17/Treg cells after 3 months and 6 months of anti-tuberculosis treatment. Results The percentage of TH17 cells in the peripheral blood of pelvic tuberculosis patients was (3.26±1.30)% which was significantly lower than that of healthy controls [(4.92±1.71)%,P<0.01]. The percentage of Treg cells in the patients was (5.18±1.53)% which was significantly higher than that of healthy controls [(3.26±1.10)%,P<0.01]. The percentage of TH17 cells in the pelvic tuberculosis patients after 6 months of treatment was (4.67±1.75)% which was significantly higher than that in the patients before treatment and after 3 months treatment [(3.26±1.30)%,P<0.01 and (3.70±1.06)%,P<0.01, respectively]. The percentage of Treg cells in pelvic tuberculosis patient after 6 months of treatment was (3.93±0.94)% which was significantly lower than that in the patients before treatment and after 3 months of treatment [(5.18±1.53)%,P<0.01 and (4.94±1.51)%,P<0.01, respectively]. The percentage of Treg cells in the patients after 6 months of treatment was still significantly higher than that of controls (P<0.05). The TH17/Treg ratio before treatment was significantly lower than that of healthy controls (P<0.01), and the TH17/Treg ratio was increased after 3 months of treatment but it did not show significant difference compared with that before treatment. The TH17/Treg ratio after 6 months of treatment (1.18±0.34)% was significantly increased in contrast to those after 3 months of treatment and before treatment [(0.77±0.21)%,P<0.01 and (0.55±0.13)%,P<0.01, respectively]. The TH17/Treg ratio could not rise to the normal level even after 6 months of treatment. Conclusion Both the TH17 and Treg cells may involve in the immunologic responses of pelvic tuberculosis patients and the imbalance of TH17/Treg cells may remain persistently.

pelvic tuberculosis; TH17 cell; Treg cell; flow cytometry

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81172732)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030313879)；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20150402111430653)。

劉玉娟,1971年生，女，副主任醫(yī)師，大學(xué)本科，主要從事婦產(chǎn)科感染性疾病的研究。

陳獻(xiàn)雄，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士，E-mail：gzcxx@szu.edu.cn。

R52；R711.33

A

2017-02-12)