畢 靜

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南京 211168)

β-葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究及在大麥醋中的應(yīng)用

畢 靜

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南京 211168)

為了解決大麥醋容易形成霧濁而影響產(chǎn)品外觀的問(wèn)題，通過(guò)研究β-葡聚糖酶最適pH值范圍、最適作用溫度范圍、溫度穩(wěn)定性和金屬離子對(duì)酶穩(wěn)定性的影響等酶學(xué)性質(zhì)，確定β-葡聚糖酶在大麥醋生產(chǎn)中的應(yīng)用方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：β-葡聚糖酶最適pH 值在4.5～5.5，最適作用溫度為55～60 ℃，Cu2+和Fe2+離子對(duì)酶活有明顯的抑制作用，在大麥醋生產(chǎn)中以在糖化階段加入為最佳，加入量為原料的0.01%，所得的大麥醋風(fēng)味和外觀均佳。

大麥醋；β-葡聚糖酶；酶學(xué)性質(zhì)；工藝條件

大麥屬禾本科植物，在我國(guó)已有幾千年的種植歷史，是主要的糧食和飼料作物之一，大麥的種植總面積和總產(chǎn)量?jī)H次于小麥、水稻、玉米。最新研究表明：大麥醋可促使肝臟正常化活動(dòng)，還可預(yù)防心血管類(lèi)的生活習(xí)慣病[1]。

我國(guó)傳統(tǒng)大麥醋采用大麥蒸一斗，炒一斗，攤冷，加入麥曲末8兩，拌勻放入罐內(nèi)，燒滾開(kāi)水40斤(晾冷)倒入，用薄紗布覆蓋罐口，置向陽(yáng)處日曬，21天成醋。

現(xiàn)代大麥醋的制作是利用酶制劑，將大麥經(jīng)粉碎、蒸煮、糖化，然后添加酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，再在醋酸菌的作用下進(jìn)行醋酸發(fā)酵而釀成醋[2]。

經(jīng)測(cè)定，普通大麥中β-葡聚糖含量占大麥干物質(zhì)的5.0%～8.5%，它是由β-1，3和β-1，4葡萄糖苷鍵將單葡萄糖分子通過(guò)直鏈隨機(jī)排列組成，主要存在大麥的胚乳細(xì)胞壁中。β-葡聚糖的水溶液具有粘性，且粘度隨著β-葡聚糖分子量及含量的增高而增大，由于在大麥醋的生產(chǎn)過(guò)程中不被分解而殘留在成品中，會(huì)使成品醋形成霧濁而影響產(chǎn)品外觀[3]。

β-葡聚糖酶是一類(lèi)能水解β-葡聚糖的多種酶的總稱(chēng)，作為添加劑已廣泛應(yīng)用在食品釀造工業(yè)中，如果通過(guò)添加β-葡聚糖酶，能夠分解β-葡聚糖，就會(huì)降低大麥醋β-葡聚糖的含量，從而解決了成品醋容易形成霧濁而影響產(chǎn)品外觀的問(wèn)題。

本文通過(guò)研究β-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，根據(jù)其特性以確定β-葡聚糖酶在大麥醋生產(chǎn)中的應(yīng)用并驗(yàn)證其方法，從而解決大麥醋成品的外觀質(zhì)量問(wèn)題[4-7]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大麥 市售；β-葡聚糖酶(酶活≥4000 U/g) 江蘇博立公司；葡萄糖、葡聚糖、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、β-葡聚糖、DNS試劑(均為分析純) 市售。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS21.6電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療器械五廠；FA2004電子分析天平 上海光學(xué)儀器一廠；UV765型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；吸管、移液管、試管 市售。

1.3 方法

1.3.1 β-葡聚糖酶活力的測(cè)定

在(40±0.2) ℃，pH 5.0條件下，在1 min內(nèi)水解β-葡聚糖底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg葡萄糖的還原糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以U/g (U/mL)表示[8]。

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于試管中，混勻，見(jiàn)表1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

續(xù) 表

將試管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)7 min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10 mL，混勻。用10 mm比色杯，以空白管(對(duì)照液)調(diào)儀器零點(diǎn)，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。

吸取待測(cè)酶液0.50 mL，加入pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0 mL，在(40±0.2) ℃水浴中預(yù)熱5 min，同時(shí)將1% β-葡聚糖溶液置同一溫度水浴中預(yù)熱5 min，加入0.5 mL 1% β-葡聚糖溶液，同時(shí)在空白管中加入3 mL DNS試劑，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10 min，取出，加入3 mL DNS試劑，于空白管中加入0.5 mL 1%葡聚糖溶液，搖勻，同時(shí)放入沸水浴中，待水浴中水重新沸騰時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)7 min，取出，迅速冷卻至室溫，各加入10 mL蒸餾水，混勻，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550 nm下，用10 mm比色杯，分別測(cè)樣品管中樣液的吸光度，通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。

按照下式計(jì)算樣品的β-葡聚糖酶的活力：

式中：X1為β-葡聚糖酶活力，U/g；A為根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得(或從回歸方程計(jì)算出)的還原糖生成量，μg；V為樣品提取時(shí)加入水的量，mL；N為樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；0.5為參與反應(yīng)的酶量，mL；W為樣品重量，g；10為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.3.2 最適pH值范圍的確定

分別在pH值為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的緩沖溶液體系中測(cè)β-葡聚糖酶酶活，以pH值為5.0的酶活力為相對(duì)酶活力100% 計(jì)，計(jì)算β-葡聚糖酶的相對(duì)酶活力[9-11]。

1.3.3 最適作用溫度范圍的確定

在pH值5.0下，分別在30，35，40，45，50，55，60，65，70，75 ℃溫度下測(cè)β-葡聚糖酶酶活，以60 ℃的酶活力為相對(duì)酶活力100% 計(jì)，計(jì)算β-葡聚糖酶的相對(duì)酶活力[12,13]。

1.3.4 溫度穩(wěn)定性

在pH值5.0下，分別在35，45，55，65，75 ℃下將β-葡聚糖酶酶液保溫，每隔15 min取出一部分測(cè)酶活，以原酶液酶活力為相對(duì)酶活力100%計(jì)，計(jì)算β-葡聚糖酶在不同溫度下保溫后的相對(duì)酶活力。

1.3.5 金屬離子對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

在酶活力測(cè)定的反應(yīng)液中分別定量加入1 mmol/L濃度的Na+，K+，Ca2+，Cu2+，F(xiàn)e2+，Zn2+等金屬離子溶液, 測(cè)定β-葡聚糖酶活力，以原酶液酶活力為相對(duì)酶活力100%計(jì)，計(jì)算β-葡聚糖酶加入金屬離子溶液后的相對(duì)酶活力。

1.3.6 大麥醋生產(chǎn)工藝流程

大麥→粉碎→蒸煮→糖化→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→貯存→過(guò)濾→成品。

↑ ↑

淀粉酶 糖化酶、β-葡聚糖酶

通過(guò)對(duì)β-葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，確定在大麥醋生產(chǎn)中的加入方式，同時(shí)以不加β-葡聚糖酶作為對(duì)照，做3個(gè)重復(fù)，確定加入β-葡聚糖酶對(duì)大麥醋質(zhì)量有何影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡聚糖酶最適pH值范圍

最適pH值范圍指酶在一定的pH值范圍內(nèi)具有較高的相對(duì)酶活。

圖1 pH值對(duì)β-葡聚糖酶活性的影響

由圖1可知，β-葡聚糖酶最適pH 值在4.5～5.5范圍內(nèi)，而在pH 值4.0～6.5范圍內(nèi)適合使用，說(shuō)明β-葡聚糖酶適合在酸性環(huán)境中使用。

2.2 最適作用溫度范圍

圖2 溫度對(duì)β-葡聚糖酶活性的影響

由圖2可知，β-葡聚糖酶適用溫度范圍較廣，在55～60 ℃溫度范圍內(nèi)，相對(duì)酶活最高；而在40～70 ℃溫度范圍內(nèi)，也有比較適合的相對(duì)酶活。

2.3 溫度的穩(wěn)定性

圖3 β-葡聚糖酶的溫度穩(wěn)定性

由圖3可知，β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性較好，在65 ℃下保溫60 min，相對(duì)酶活仍有73%，而當(dāng)溫度達(dá)到75 ℃時(shí)酶活下降較快，保溫60 min后，相對(duì)酶活只剩余46%。

2.4 金屬離子對(duì)酶活的影響

表2 金屬離子對(duì)β-葡聚糖酶活性的影響

由表2可知，Cu2+和Fe2+離子對(duì)酶活有明顯的抑制作用，Zn2+離子有輕微的抑制作用，而Na+，K+和Ca2+等其他離子對(duì)酶活的影響較小，這可能與重金屬離子更容易使蛋白質(zhì)變性有關(guān)。因此，在使用β-葡聚糖酶時(shí)要避免使用銅或鐵等金屬容器，或是要做好防腐處理。

2.5 大麥醋中添加β-葡聚糖酶的工藝

根據(jù)上述β-葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)合大麥醋生產(chǎn)工藝，確定在糖化階段將β-葡聚糖酶和糖化酶同時(shí)加入，加入量為原料的0.01%，通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大麥醋的檢測(cè)結(jié)果

由表3可知，二者在理化指標(biāo)上無(wú)差別，但在感官特性上，添加β-葡聚糖酶的大麥醋呈透明狀，而原工藝生產(chǎn)的大麥醋微許霧濁，說(shuō)明添加β-葡聚糖酶能有效地改善大麥醋的外觀質(zhì)量，達(dá)到了預(yù)期的效果。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)β-葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，β-葡聚糖酶最適pH 值在4.5～5.5，最適作用溫度55～60 ℃，Cu2+和Fe2+離子對(duì)酶活有明顯的抑制作用，在大麥醋生產(chǎn)中以在糖化階段加入為最佳，加入量為原料的0.01%，所得的大麥醋風(fēng)味和外觀均佳。

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Study on Enzymatic Property of β-glucanase and Its Application in Barley Vinegar

BI Jing

(Jiangsu Vocational Institute of Commerce, Nanjing 211168, China)

In order to solve the problems that barley vinegar is easy to form haze and affects the appearance of the product, the effect of optimal pH range, optimal temperature range, temperature stability, metal ions of β-glucanase on the enzyme stability is researched to determine the application methods of β-glucanase in barley vinegar production. The experimental results show that the optimal pH value, the optimal temperature of β-glucanase is 4.5～5.5, 55～60 ℃ respectively, Cu2+and Fe2+ions have significant inhibitory effect on the enzyme activity. The best addition time of β-glucanase in the production of barley vinegar is in the saccharification stage, with the additive amount of 0.01% of the raw material, the obtained barley vinegar has good flavor and appearance.

barley vinegar; β-glucanase; enzymatic property; process conditions

2017-01-15

畢靜(1964-)，女，高級(jí)工程師，研究方向：食品工程。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.011

1000-9973(2017)06-0054-03