殷海松，張仁寬，白曉磊，鄭宇，王敏*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津 300350)

強(qiáng)化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵及胞內(nèi)ATP濃度的影響

殷海松1,2，張仁寬1，白曉磊1，鄭宇1，王敏1*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津 300350)

溶氧對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵有顯著影響，但是目前溶氧對醋酸發(fā)酵影響的機(jī)理尚不十分清楚，文章通過提高攪拌轉(zhuǎn)速，探討強(qiáng)化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵影響的機(jī)理。研究結(jié)果顯示：攪拌轉(zhuǎn)速從500 r/min增加到700 r/min后，胞內(nèi)ATP濃度提高了302%；乙醇氧化偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶ADH，ALDH和ATPase 酶活性分別提高了40%，60%和56%。當(dāng)發(fā)酵28 h時(shí)，轉(zhuǎn)速700 r/min與500 r/min相比菌體濃度提高了37%，產(chǎn)酸量提高了150%，單位菌體產(chǎn)酸提高了84%。由此可知，巴氏醋桿菌菌體生長和醋化乙醇過程中需要消耗大量的溶氧，尤其在16～28 h產(chǎn)酸高峰期對溶氧的消耗更大。提高攪拌轉(zhuǎn)速強(qiáng)化供氧可顯著提高巴氏醋桿菌乙醇氧化偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶的活性，強(qiáng)化乙醇氧化產(chǎn)酸和乙醇呼吸鏈途徑產(chǎn)能，為巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸提供更多的能量，滿足菌體快速生長和適應(yīng)高酸生存環(huán)境對能量的需求，提高菌體對醋酸的耐受性，從而提高菌體濃度和產(chǎn)酸速率。

巴氏醋桿菌；供氧；轉(zhuǎn)速；醋酸；ATP濃度

食醋是一種常見的酸味調(diào)味品，醋酸是其主要組分。醋酸菌是能將乙醇氧化成醋酸的一類微生物的總稱，其中Acetobacter屬由于具有很強(qiáng)的乙醇氧化能力，被廣泛應(yīng)用于食醋發(fā)酵[1-3]。醋酸對普通微生物具有較強(qiáng)的毒性，醋酸菌具有特殊的機(jī)制，能夠耐受較高濃度的醋酸。在醋酸發(fā)酵過程中，胞內(nèi)能量的高低對菌體的醋酸耐受性有重要影響。Nakano S等研究表明，醋酸分子的泵出機(jī)制和ATP依賴型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如AatA和ClpB均與菌體的能量代謝直接相關(guān)[4-7]，因此，能量供應(yīng)對于保障巴氏醋酸桿菌在高酸環(huán)境下的正常代謝非常重要[8]。所以，強(qiáng)化ATP的供應(yīng)是提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和抵御不良生存環(huán)境的重要手段[9-11]。醋酸菌是好氧菌，在其醋酸發(fā)酵過程中需要消耗大量的溶氧，醋酸發(fā)酵過程的耗氧主要由菌體生長耗氧和乙醇的醋化耗氧兩部分組成，因此在醋酸發(fā)酵過程中必須不斷供氧[12]。在有氧的條件下，微生物主要通過氧化磷酸化途徑產(chǎn)生ATP[13]。在醋酸發(fā)酵過程中，菌體需要有氧呼吸來提供抵御高酸環(huán)境的能量[14]。巴氏醋桿菌有氧呼吸產(chǎn)能途徑主要有乙醇呼吸鏈產(chǎn)能途徑和TCA循環(huán)偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能途徑。

本文通過提高攪拌轉(zhuǎn)速，探討強(qiáng)化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵影響的機(jī)理，研究成果將有助于通過控制氧氣的供應(yīng)控制胞內(nèi)ATP濃度，指導(dǎo)醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化與調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)AC2005，由中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)保藏(保藏編號：CGMCC3089)。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏15，碳酸鈣20，瓊脂17，pH自然，121 ℃滅菌20 min，冷卻至60 ℃左右，加入無水乙醇至28，搖勻后分裝斜面。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏15，pH自然，121 ℃滅菌20 min，接種前加入無水乙醇至28。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨5，天冬氨酸0.2，pH自然，121 ℃滅菌20 min，接種前加入無水乙醇至56。

1.1.3 試劑

無水葡萄糖(分析純) 天津福晨化學(xué)試劑廠；蛋白胨生化試劑 英國Oxiod公司；酵母膏生化試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；天冬氨酸生化試劑 美國Biotopped進(jìn)口分裝。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1250紫外/可見分光光度計(jì) 日本島津公司；HYG-W1搖床 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；YJ-875S醫(yī)用超凈臺 蘇州凈化設(shè)備廠；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀 Thermo 公司；TGL-16B 高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Multifors Bacteria四聯(lián)平行發(fā)酵罐 瑞士INFORS公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

1.3.1.1 種子培養(yǎng)

將斜面保藏的菌種接種1環(huán)至盛有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中，置于30 ℃搖床中，在180 r/min下震蕩培養(yǎng)約27 h，當(dāng)OD610=1.38±0.12時(shí)，轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中。

1.3.1.2 四聯(lián)平行發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

將OD610=1.38±0.12的種子液以10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L四聯(lián)平行發(fā)酵罐，700 mL裝液量)中，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速分別為500，600，700 r/min，通氣量0.7 vvm條件下培養(yǎng)，檢測發(fā)酵過程菌體濃度和醋酸濃度，當(dāng)發(fā)酵液中酒精濃度低于0.5%(V/V)時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 提高攪拌轉(zhuǎn)速對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵的影響

按10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制四聯(lián)平行發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速500，600，700 r/min，進(jìn)行醋酸發(fā)酵，檢測發(fā)酵過程中菌體和醋酸濃度。

1.3.3 提高攪拌轉(zhuǎn)速對巴氏醋桿菌乙醇呼吸鏈途徑產(chǎn)能的強(qiáng)化及對關(guān)鍵酶活性的影響

按10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制四聯(lián)平行發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速500，600，700 r/min，進(jìn)行醋酸發(fā)酵。收集菌體，分析其胞內(nèi)ATP濃度和乙醇呼吸鏈關(guān)鍵酶ADH，ALDH和ATPase酶活性。

1.3.4 分析檢測方法

1.3.4.1 菌體干重

將發(fā)酵液于6000 r/min離心10 min，除去上清液，將菌體細(xì)胞置于干燥箱中，37 ℃恒溫烘干至恒重，稱量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體干重。

1.3.4.2 醋酸濃度

酸堿滴定法：取1 mL發(fā)酵液于250 mL三角瓶中，加入蒸餾水15 mL，以酚酞作指示劑，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液將發(fā)酵液滴定至粉紅色，測得總酸含量。

1.3.4.3 ADH和ALDH酶活的測定

參照Wood法[15]，取Mcllains緩沖液0.5 mL，10% Triton X-100溶液0.1 mL，1 mol/L乙醇(乙醛)溶液0.1 mL，發(fā)酵液0.2 mL，0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液0.1 mL，置于25 mL比色管中，25 ℃下保溫5 min，然后加入硫酸鐵-Dupanol溶液0.5 mL，加入3.5 mL蒸餾水混合后，在25 ℃條件下放置20 min(同時(shí)做空白對照)，在660 nm下測定吸光度值。

1.3.4.4 ATPase 酶活測定方法

透性細(xì)胞制備：25 mL培養(yǎng)液冷凍離心，加75 mmol的Tris-HCl buffer(pH 7.0，含10 mmol/L MgSO4)，加入甲苯，之后在預(yù)冷的乙醇中(-80 ℃)進(jìn)行2次循環(huán)冷凍，之后30 ℃解凍。離心收集，之后在1 mL的75 mmol/L的Tris-HCl buffer(pH 7.0，含10 mmol/L MgSO4)中重懸，在預(yù)冷的乙醇中冷凍，-70 ℃保存待測。

ATPase酶活測定參考Matsumoto等[16]的方法。0.1 mL ATP(30 mmol/L)+0.4 mL反應(yīng)液(3.75 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2)置于試管中，30 ℃保溫5 min，加入透性細(xì)胞懸浮液0.5 mL，再保溫30 min，加入0.2 mL 三氯乙酸(20%，W/V)中止反應(yīng)，6000×g離心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL硫酸亞鐵-鉬酸銨。反應(yīng)10 min，顏色變藍(lán)后，在660 nm處測吸光值。根據(jù)磷(Pi)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出其含量，酶的活性單位為μmol(Pi)/[g (cells)·min]。

1.3.4.5 菌體胞內(nèi)ATP濃度的測定

收集菌體，用空培養(yǎng)基洗滌3次，利用BacTiter-GloTM微生物細(xì)胞活性檢測試劑盒(G8230)(Promega公司)測定菌體胞內(nèi)ATP濃度，檢測方法參照說明書。

1.3.4.6 溶解氧濃度的測定

采用溶解氧電極測定發(fā)酵過程的溶解氧濃度(DO)。電極的標(biāo)定程序：室溫、1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下飽和亞硫酸鈉溶液中的溶解氧濃度(DO)標(biāo)定為零點(diǎn)；滅菌后、接種前， pH自然，溫度30 ℃，在一定氧分壓及通氣量下，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速增加到某一數(shù)值后，再增加攪拌轉(zhuǎn)速溶解氧濃度不再發(fā)生變化下的DO值標(biāo)定為100%。文中測定的DO為相對值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)共設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，圖中的數(shù)據(jù)為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖表生成采用Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性分析采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P≤0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵的影響

在恒定通氣量的條件下，增大攪拌轉(zhuǎn)速可以提高KLa，強(qiáng)化供氧，是發(fā)酵過程中提高溶氧的重要手段[17，18]。

圖1 接種前不同攪拌轉(zhuǎn)速條件下的溶氧變化曲線

由圖1可知，DO電極校正后、接種前，通氣量0.7 vvm條件下，提高攪拌轉(zhuǎn)速能提高氧氣的溶解，提高發(fā)酵液的溶氧濃度。醋酸發(fā)酵過程中不同攪拌轉(zhuǎn)速條件下的溶氧變化曲線見圖2。不同攪拌轉(zhuǎn)速對巴氏醋桿菌菌體生長、產(chǎn)酸、單位菌體產(chǎn)酸的影響見圖3。

圖2 醋酸發(fā)酵過程中不同攪拌轉(zhuǎn)速條件下的溶氧變化曲線

圖3 攪拌轉(zhuǎn)速對巴氏醋桿菌菌體生長(a)、產(chǎn)酸(b)和單位菌體產(chǎn)酸(c)的影響

由圖2和圖3可知，在醋酸發(fā)酵中前期菌體快速生長，發(fā)酵液溶氧濃度快速下降；發(fā)酵16 h時(shí)，溶氧濃度下降到3%左右，菌體進(jìn)入產(chǎn)酸高峰期，低溶氧水平維持一段時(shí)間；發(fā)酵28 h后，攪拌轉(zhuǎn)速700 r/min和600 r/min時(shí)菌體生長和產(chǎn)酸進(jìn)入尾聲，耗氧量迅速下降，發(fā)酵液溶氧濃度快速上升。攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min時(shí)，由于供氧不足醋酸發(fā)酵周期延長，發(fā)酵28 h后溶氧水平仍維持較低水平。結(jié)果表明：巴氏醋桿菌菌體生長和醋化乙醇過程中需要消耗大量的溶氧，尤其在16～28 h產(chǎn)酸高峰期對溶氧的需求更大，因此提高攪拌轉(zhuǎn)速增加供氧，能顯著促進(jìn)菌體生長、產(chǎn)酸和單位菌體產(chǎn)酸。發(fā)酵28 h時(shí)，700 r/min時(shí)的巴氏醋桿菌菌體濃度比500 r/min時(shí)的菌體濃度提高了37%，菌體產(chǎn)酸提高了150%，單位菌體產(chǎn)酸提高了84%。推測原因是在醋酸發(fā)酵過程中增加供氧可能促進(jìn)葡萄糖氧化和TCA循環(huán)偶聯(lián)呼吸鏈途徑產(chǎn)能，尤其是乙醇氧化和乙醇呼吸鏈途徑產(chǎn)能，為巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸提供更多的能量。

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對巴氏醋桿菌胞內(nèi)ATP濃度及產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶活性的影響

提高攪拌轉(zhuǎn)速強(qiáng)化供氧對巴氏醋桿菌胞內(nèi)ATP濃度的影響見圖4。

圖4 攪拌轉(zhuǎn)速對巴氏醋桿菌胞內(nèi)ATP濃度的影響

由圖4可知，與攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min時(shí)相比，600，和700 r/min時(shí)胞內(nèi)ATP濃度分別提高了91%和302%。結(jié)果表明：提高轉(zhuǎn)速強(qiáng)化供氧能顯著提高巴氏醋桿菌菌體產(chǎn)能，尤其在發(fā)酵16～28 h的產(chǎn)酸高峰期影響更顯著。推測其原因是在發(fā)酵過程中強(qiáng)化供氧能促進(jìn)菌體TCA循環(huán)偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能和乙醇氧化偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能。尤其是在發(fā)酵16～28 h的產(chǎn)酸高峰期，更多的乙醇氧化脫氫，電子通過乙醇呼吸鏈，經(jīng)輔酶PQQ、血紅素c，進(jìn)而經(jīng)輔酶Q把電子傳遞到末端氧化酶，最終傳遞給電子受體氧，產(chǎn)生大量的能量ATP[19-21]，見圖5。

進(jìn)一步分析菌體乙醇氧化偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶活性(見圖6)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵16 h時(shí)，與攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min時(shí)相比，700 r/min時(shí)胞內(nèi)ADH，ALDH和ATPase 酶活性分別提高了40%，60%和56%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：提高轉(zhuǎn)速強(qiáng)化供氧可顯著提高巴氏醋桿菌乙醇氧化偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶的活性，強(qiáng)化乙醇氧化產(chǎn)酸和乙醇呼吸鏈途徑產(chǎn)能，為巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸提供更多的能量，滿足菌體快速生長和適應(yīng)高酸生存環(huán)境對能量的需求，提高菌體對醋酸的耐受性[22]，從而提高菌體濃度和產(chǎn)酸速率，有助于通過調(diào)控能量代謝來指導(dǎo)醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化與調(diào)控。

圖6 攪拌轉(zhuǎn)速對巴氏醋桿菌乙醇呼吸鏈產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶活性的影響

3 結(jié)論

本文通過提高攪拌轉(zhuǎn)速，探討強(qiáng)化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵影響的機(jī)理。研究結(jié)果顯示：巴氏醋桿菌菌體生長和醋化乙醇過程中需要消耗大量的溶氧，尤其在16～28 h產(chǎn)酸高峰期對溶氧的消耗更大。攪拌轉(zhuǎn)速從500 r/min增加到 700 r/min后，胞內(nèi)ATP濃度提高了302%；乙醇氧化偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶ADH，ALDH和ATPase 酶活性分別提高了40%，60%和56%。提高攪拌轉(zhuǎn)速強(qiáng)化供氧可顯著提高巴氏醋桿菌乙醇氧化偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶的活性，強(qiáng)化乙醇氧化產(chǎn)酸和乙醇呼吸鏈途徑產(chǎn)能，為巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸提供更多的能量，滿足菌體快速生長和適應(yīng)高酸生存環(huán)境對能量的需求，提高菌體對醋酸的耐受性，從而提高菌體濃度和產(chǎn)酸速率。發(fā)酵28 h時(shí)，700 r/min時(shí)的菌體濃度比轉(zhuǎn)速為500 r/min時(shí)提高了37%，菌體產(chǎn)酸提高了150%，單位菌體產(chǎn)酸提高了84%。通過控制氧氣的供應(yīng)控制胞內(nèi)ATP濃度，為醋酸發(fā)酵代謝調(diào)控提供一個(gè)新的手段。

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Effects of Strengthening Oxygen Supply on Acetic Acid Fermentation and ATP Concentration ofAcetobacterpasteurianus

YIN Hai-song1,2, ZHANG Ren-kuan1, BAI Xiao-lei1, ZHENG Yu1, WANG Min1*

(1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457，China；2.School of Bioengineering，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China)

The effects of dissolved oxygen on acetic acid fermentation ofAcetobacterpasteurianusis significant. But the mechanism of effects of dissolved oxygen on acetic acid fermentation is not very clear.By improving the agitation speed, the mechanism of effects of strengthening oxygen supply on acetic acid fermentation ofAcetobacterpasteurianusis researched in this paper. The experimental results show that the intracellular ATP concentration is increased by 302% and the enzyme activities of ADH,ALDH and ATPase in alcohol respiratory chain energy metabolism are increased by 40%,60% and 56% respectively when the agitation speed increases from 500 r/min to 700 r/min.Moreover,compared with the agitation speed of 500 r/min to 700 r/min, the bacteria concentration, acetic acid concentration and acetic acid production of unit cell are increased by 37%, 150% and 84% respectively when fermentation time is 28 h.From this we can know that large amount of dissolved oxygen is consumed in the process of bacterial growth and acetic acid production ofAcetobacterpasteurianus, especially when the acetic acid production reaches the maximum in 16～28 h.When strengthening the oxygen supply by increasing the agitation speed, the enzyme activities of key enzymes in alcohol respiratory chain energy metabolism ofAcetobacterpasteurianusare significantly improved. Also the acid production of ethanol oxidation and the energy production by alcohol respiratory chain are strengthened. Therefore, it can provide more energy for bacterial growth and acetic acid production ofAcetobacterpasteurianus,it also meets the energy needs for the rapid growth of bacteria and adapts to the high acetic acid living environment, and it improves the tolerance of bacteria to acetic acid.So the bacteria concentration and acetic acid production rate are increased.

Acetobacterpasteurianus; oxygen supply; agitation speed; acetic acid; ATP concentration

2017-01-03 *通訊作者

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)課題(2013AA102106)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31201406)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(13JCQNJC10000)

殷海松(1980-)，男，河北任丘人，副教授，博士，研究方向：食品發(fā)酵技術(shù)； 王敏(1971-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品發(fā)酵微生物功能分析與發(fā)酵技術(shù)等。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.002

1000-9973(2017)06-0005-05