戴舒遠(yuǎn)，趙錫澍，解可波，王霞，戴均貴

新穎糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)抗菌藥物金霉素的糖基化修飾

戴舒遠(yuǎn)，趙錫澍，解可波，王霞，戴均貴

目的發(fā)掘新穎糖基轉(zhuǎn)移酶并對(duì)金霉素進(jìn)行糖基化修飾。

方法對(duì)來(lái)源于木立蘆薈的重組糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行金霉素糖基化功能篩選，發(fā)現(xiàn)重組 AaGT1 能催化金霉素與葡萄糖糖基供體進(jìn)行反應(yīng)。放大反應(yīng)液經(jīng)乙酸乙酯萃取去除未反應(yīng)底物，剩余含糖基化產(chǎn)物的水相部分采用反相半制備 HPLC技術(shù)進(jìn)行分離純化。通過(guò)質(zhì)譜和核磁共振波譜等技術(shù)對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定；對(duì)底物與糖基化產(chǎn)物的水溶性進(jìn)行測(cè)定，并評(píng)價(jià)兩者抑菌活性。

結(jié)果糖基轉(zhuǎn)移酶 AaGT1 催化金霉素獲得兩個(gè)金霉素異構(gòu)體的糖基化產(chǎn)物，異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷和 4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷。異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷的水溶性是鹽酸金霉素水溶性的 3.3 倍；糖基化產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有明顯的抑制活性。

結(jié)論糖基轉(zhuǎn)移酶 AaGT1 對(duì)金霉素能夠進(jìn)行糖基化，產(chǎn)物異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷和 4-差向異金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷均為新化合物，對(duì)底物進(jìn)行糖基化修飾能提高其水溶性。

金霉素； 糖基化； 糖基轉(zhuǎn)移酶； 木立蘆薈

糖基化（glycosylation）是自然界廣泛存在的重要化學(xué)修飾反應(yīng)，很多活性天然產(chǎn)物或藥物均具有糖基。糖基的存在對(duì)其水溶性、毒副作用和藥理活性往往會(huì)產(chǎn)生重要影響[1]。在天然或非天然苷元上引入糖基，進(jìn)而提高化合物的成藥性，為新穎糖苷類藥物的發(fā)現(xiàn)帶來(lái)了希望[2]。因此，糖基化修飾已作為合成活性糖苷類化合物的有效策略而被廣泛應(yīng)用在藥物研究領(lǐng)域。天然糖苷類化合物的糖基是由糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase）催化引入的。糖基轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⒍喾N單糖由供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子上，形成相應(yīng)的糖苷類化合物。糖基轉(zhuǎn)移酶催化的酶法糖基化具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、步驟簡(jiǎn)潔、具有位置和立體選擇性及效率高等優(yōu)點(diǎn)[3]。因此，糖基轉(zhuǎn)移酶在活性化合物的糖基化修飾中具有廣闊的應(yīng)用前景。

金霉素（chlortetracycline）是一種四環(huán)素類抗生素，抗菌譜與其他四環(huán)素類抗生素相似，目前藥物劑型主要是軟膏。臨床上用于治療沙眼、細(xì)菌性結(jié)膜炎、麥粒腫及細(xì)菌性眼瞼炎等疾病的治療。但金霉素水溶性較差且毒副作用大，用藥后可引起諸多不良反應(yīng)[4]，所以金霉素在臨床上應(yīng)用存在諸多限制。正因如此，我們嘗試對(duì)金霉素進(jìn)行糖基化結(jié)構(gòu)修飾以克服上述缺陷，改善其臨床使用效果。

本文通過(guò)對(duì)木立蘆薈（Aloe arborescens）轉(zhuǎn)錄組注釋的 6 個(gè)候選糖基轉(zhuǎn)移酶基因（AaGT1 ～AaGT6）的外源表達(dá)及催化活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中糖基轉(zhuǎn)移酶 AaGT1 可對(duì)金霉素進(jìn)行糖基化反應(yīng)。通過(guò)放大酶促反應(yīng)分離制備得到 2 個(gè)糖基化產(chǎn)物，并對(duì)糖基化產(chǎn)物進(jìn)行了水溶性及抑菌活性測(cè)試。這些結(jié)果為后續(xù)金霉素的糖基化修飾研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體 pET-28a 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；宿主細(xì)胞 Transetta 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 1-14、3K15、3K18 和 8K 高速離心機(jī)為德國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品；培英 HYG-A 恒溫?fù)u床為江蘇太倉(cāng)儀器廠產(chǎn)品；ZX-TJS 無(wú)菌工作臺(tái)為上海整新電子設(shè)備公司產(chǎn)品；SHH-W21-420 三用電熱恒溫水箱為北京長(zhǎng)風(fēng)儀器產(chǎn)品；MLS-3750 S Labo-Autoclave 型全自動(dòng)蒸汽消毒鍋、MDF-382E型超低溫冰箱為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；Bencbtop K冷凍干燥機(jī)為美國(guó) Vir Tis 公司產(chǎn)品；1200 分析型高效液相系統(tǒng)為美國(guó) Agilent 公司產(chǎn)品；Dionex Ultimate 3000 型高效液相色譜儀、LCQ Fleet 離子阱質(zhì)譜儀為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品；分析型色譜柱Shiseido spolar C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）為日本 Shiseido 公司產(chǎn)品；反相半制備色譜柱 YMC Triart C18（250 mm × 10 mm，5 μm）為日本 YMC公司產(chǎn)品；VNS-400、VNS-600 型核磁共振波譜儀為美國(guó) Varian 公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 HPLC 檢測(cè)用色譜級(jí)甲醇、甲酸及供體化合物尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化鈉 10 g，蒸餾水定容至 1 L，使用前 121 ℃ 滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 來(lái)源于蘆薈的糖基轉(zhuǎn)移酶基因 AaGT1 ～AaGT6 連接表達(dá)載體 pET-28a，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主 Transetta 獲得含目的基因的重組工程菌。將重組工程菌轉(zhuǎn)接于含卡那霉素和氯霉素（終濃度分別為 50 和 34 μg/ml）的 50 ml LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)過(guò)夜作為種子液。

將 AaGT1 重組菌的種子液以 1∶100 的比例轉(zhuǎn)接至含卡那霉素和氯霉素（終濃度分別為 50 和34 μg/ml）的 5 L LB 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至 OD600= 0.6。向培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)劑IPTG 至終濃度為 0.15 mmol/L。在 18 ℃，200 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo) 16 h。隨后將菌液于 4 ℃、6000 × g 離心 10 min 后棄上清培養(yǎng)基，并用蒸餾水洗滌菌體 3 次。

1.2.2 重組糖基轉(zhuǎn)移酶 AaGT1 的分離純化 按照 Hi Trap Chelating HP 操作手冊(cè)進(jìn)行，為盡可能保持蛋白活力，整個(gè)純化過(guò)程在 4 ℃ 蛋白層析柜中進(jìn)行，主要步驟如下：

⑴每克 AaGT1 重組菌體用 5 ml 的 binding buffer（含 0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）重懸，加入苯甲基磺酰氟（PMSF，終濃度為 1 mmol/L）和溶菌酶（終濃度為 1 mg/ml），混勻后超聲破碎菌體。

⑵菌體破碎后，于 4 ℃、10 000 × g 條件下離心 60 min，取上清（粗酶液）用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾后上樣于 binding buffer 平衡后的鎳柱（Ni-NTA）進(jìn)行親和層析純化。流速為 1 ml/min，分別用含100、250、500 mmol/L 濃度咪唑的 elution buffer（除咪唑濃度不同外，其他成分與 binding buffer相同）進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液經(jīng)脫鹽后，利用SDS-PAGE 檢測(cè)目的蛋白。

1.2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性篩選 糖基轉(zhuǎn)移酶活性初篩反應(yīng)體系：重組 AaGT1 ～ AaGT6 粗酶液198 μl、50 mmol/L 鹽酸金霉素1 μl、100 mmol/L UDP-Glc 1 μl。在 30 ℃ 水浴條件下，反應(yīng) 12 h 后，加入 400 μl 的甲醇終止反應(yīng)，振蕩混勻，15 000 × g離心 30 min。利用 HPLC-UV/MS 對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性進(jìn)行初步判斷。

HPLC-MS 分析由 Agilent 1200 液相系統(tǒng)串聯(lián) Thermo LCQ Fleet 離子阱質(zhì)譜儀完成，柱后分流比為 2∶1。流動(dòng)相 A 為甲醇，流動(dòng)相 B 為 0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫。梯度條件：A∶B（v/v）1∶9→ 9∶11，30 min；流速 1 ml/ min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 20 μl；在 254 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)。

ESI 源優(yōu)化參數(shù)：鞘氣流速 20（任意單位）；輔助氣流速 5（任意單位）；噴霧電壓 5000 V；毛細(xì)管溫度 350 ℃；碰撞誘導(dǎo)解離電壓 35 V。

1.2.4 金霉素糖基化產(chǎn)物的制備及結(jié)構(gòu)鑒定 分別稱取 28 mg 鹽酸金霉素（溶解于 200 μl DMSO）、64 mg UDP-Glc（溶解于 1 ml 蒸餾水）。將純化的酶液與上述兩者混合均勻，用 pH7.4 的 Tris-HCl將反應(yīng)體系定容至 50 ml，混勻后放入 30 ℃ 水浴鍋中，反應(yīng) 16 h 后以兩倍體積的乙酸乙酯萃取5 次，有機(jī)相減壓蒸干（經(jīng) HPLC-UV 檢測(cè)僅有微量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物）。將殘余水相減壓蒸干后，加入 5 ml甲醇超聲提取 15 min，離心后將上清液進(jìn)一步濃縮至 2 ml，0.22 μm 濾膜過(guò)濾后，使用甲醇/0.1% 甲酸水溶液為流動(dòng)相通過(guò)反相半制備系統(tǒng)對(duì)糖基化產(chǎn)物及底物進(jìn)行分離純化，梯度洗脫條件為甲醇∶0.1% 甲酸水溶液（1∶9 → 1∶1，v/v，30 min）；254 nm 下檢測(cè)，流速 3 ml/min。將糖基化產(chǎn)物及底物流份經(jīng)減壓蒸餾及冷凍干燥后，得到化合物4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（7.2 mg，tR= 14.4 min）、異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（8.0 mg，tR= 17.7 min）、差向異金霉素（4.0 mg，tR= 22.2 min）和異金霉素（4.2 mg，tR= 26.0 min）。

1.2.5 水溶性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 鹽酸金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將鹽酸金霉素分別配成 512、256、128、64、32、16 μg/ml濃度，用于 HPLC 分析，進(jìn)樣體積為 10 μl，每個(gè)濃度重復(fù) 3 次，在 370 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)定吸收峰的面積。然后根據(jù)峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量得出回歸方程：y = 0.0191x – 1.5328（r = 99.93%），y 為峰面積，x 為進(jìn)樣質(zhì)量（ng）。

1.2.5.2 異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將該化合物分別配成 900、600、400、200、100 μg/ml 濃度，用于 HPLC 分析，進(jìn)樣體積為 10 μl，每個(gè)濃度重復(fù) 3 次，在 254 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)定吸收峰的面積。然后根據(jù)峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量得出回歸方程：y = 0.0011x + 0.41（r = 99.89%），y 為峰面積，x 為進(jìn)樣質(zhì)量（ng）。

1.2.5.3 待測(cè)化合物的溶解度測(cè)定 將 200 μl蒸餾水加入到過(guò)量的鹽酸金霉素、異金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷中形成懸濁液，室溫下超聲 1 h。9000 × g 離心 10 min，取 100 μl 上清液，分別用甲醇稀釋至 1、2 ml，用于 HPLC 分析，進(jìn)樣量為10 μl，重復(fù) 3 次，在 370 與 254 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸收峰的面積。根據(jù)回歸方程得出溶解質(zhì)量，然后計(jì)算得出溶解度。

圖 1 AaGT1 催化金霉素糖基化反應(yīng)[A：HPLC-UV 分析空白對(duì)照組（A1）、催化反應(yīng)體組（A2）；B：糖基化產(chǎn)物峰 3a 與2a 以及非酶促反應(yīng)底物峰 3 與 2 對(duì)應(yīng)的 ESI-MS譜圖]Figure 1 Glycosylated chlortetracycline by AaGT1 [A: HPLC-UV analysis of blank control (A1), catalytic reaction (A2); B: ESI-MS spectra of glycosylated products 3a, 2a and non-enzymatic reaction substrates 3, 2]

2 結(jié)果

2.1 蘆薈糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)金霉素糖基化的活性篩選

為獲得能夠?qū)鹈顾剡M(jìn)行糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶，以 UDP-Glc 為供體，金霉素為受體，對(duì)6 個(gè)重組酶的粗酶液進(jìn)行催化活性的篩選。經(jīng)HPLC-UV/MS 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，6 個(gè)重組糖基轉(zhuǎn)移酶中只有 AaGT1（Genbank 序列號(hào) KY293674）對(duì)金霉素表現(xiàn)出較高的糖基化活性（圖 1）。比較底物與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物一級(jí)質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分子量較底物的分子量增加 162，因此推測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為底物金霉素引入一個(gè)葡萄糖基團(tuán)。

從圖 1 的 HPLC-UV/ESI-MS 圖可以看出，金霉素（1）在糖基轉(zhuǎn)移酶 AaGT1 的催化下，出現(xiàn)兩個(gè)分子量增加 162 的糖基化產(chǎn)物峰（2a、3a）和兩個(gè)非酶促反應(yīng)底物峰（2、3），并且底物峰的保留時(shí)間以及紫外吸收光譜均與鹽酸金霉素（1）有差異。非酶促反應(yīng)底物（2、3）的分子量與金霉素一致，說(shuō)明底物可能為金霉素的同分異構(gòu)體。兩個(gè)糖基化產(chǎn)物的紫外吸收光譜與底物的紫外吸收光譜一致，因此推測(cè)兩個(gè)糖基化產(chǎn)物為金霉素同分異構(gòu)體（2、3）的糖基化產(chǎn)物。

2.2 糖基化產(chǎn)物的制備及結(jié)構(gòu)鑒定

為進(jìn)一步確定糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，通過(guò)反相半制備 HPLC 分離純化得到 4 個(gè)化合物，依據(jù)紫外吸收光譜和核磁數(shù)據(jù)[5–7]，4 個(gè)化合物分別鑒定為異金霉素（2）、異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（2a）、4-差向異金霉素（3）、4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（3a）。其中，化合物 2a、3a 為新化合物。

根據(jù)高分辨質(zhì)譜，化合物 2a 的分子式被確定為 C28H33ClN2O13，分子量為 640（m/z 641.1720 [M + H]+，計(jì)算值為 641.1713），相比底物異金霉素的分子量（478）增加了 162；與其底物的1H-NMR 譜圖相比，2a 的1H-NMR 譜圖（表 1）多了 1 個(gè)端基氫 δH5.22、6 個(gè)連氧氫 δH3.17-3.65 的一組葡萄糖質(zhì)子信號(hào)；2a 的13C-NMR譜圖（表 1）比底物多了化學(xué)位移值在 δC60.5、69.4、73.1、76.6、77.2、99.3 的 6 個(gè)連氧碳，由于 δC99.3 是葡萄糖端基碳的典型信號(hào)，因此可判斷化合物 2a 是在異金霉素苷元上引入了一分子葡萄糖的糖基化產(chǎn)物。HMBC 譜可觀察到 H-1'（δH5.22）與 C-10（δC155.0）相關(guān)，表明該葡萄糖基團(tuán)連在苷元的 10-OH上。端基質(zhì)子的偶合常數(shù) J = 7.2 Hz，表明形成的糖苷鍵為 β 構(gòu)型。因此，化合物 2a 的結(jié)構(gòu)被確定為異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷。

與化合物 2a 相似的結(jié)構(gòu)解析過(guò)程，化合物 3a被確定為 4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷。

2.3 金霉素及其糖基化產(chǎn)物可能的轉(zhuǎn)化過(guò)程

根據(jù) HPLC-UV 分析結(jié)果，推測(cè)金霉素在AaGT1 酶反應(yīng)液的作用下可能的轉(zhuǎn)化途徑（圖 2）。由于 C7位含氯原子時(shí)，金霉素在弱堿性條件下，快速水解為異金霉素。異金霉素在水溶液中產(chǎn)生可逆的差向異構(gòu)作用，生成差向異金霉素[8]。兩者在AaGT1 酶的催化作用下，生成糖苷類化合物 2a、3a。我們還觀察到化合物 2a、3a 在含水溶劑中可相互轉(zhuǎn)化。

表 1 化合物 2a 與 3a 核磁共振波譜數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR and13C-NMR data of compounds 2a and 3a

2.4 金霉素與糖基化產(chǎn)物 2a 的水溶性比較

由于葡萄糖分子具有較大極性，苷元上引入葡萄糖基會(huì)增加其水溶性[9]。水溶性測(cè)試結(jié)果表明，糖基化的產(chǎn)物異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（2a）的水溶性為鹽酸金霉素的 3.3 倍（表 2），顯示糖基的引入有增加苷元水溶性的作用。

2.5 抑菌生物活性評(píng)價(jià)

將鹽酸金霉素以及化合物 2、3、2a、3a 進(jìn)行抑制金黃色葡萄球菌的活性篩選，遺憾的是，除鹽酸金霉素外，化合物 2、3、2a、3a 均無(wú)明顯的抑菌活性。

圖 2 金霉素轉(zhuǎn)化成化合物 2a 與 3a 的可能過(guò)程Figure 2 Possible transformation process of chlortetracycline to compounds 2a and 3a

表 2 鹽酸金霉素（1）、異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（2a）的水溶性Table 2 Water solubility of chlortetracycline hydrochloride (1) and iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside (2a)

3 討論

本研究首次利用糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)金霉素進(jìn)行糖基化研究，并獲得了兩個(gè)糖基化產(chǎn)物，異金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷與 4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷，表明酶法糖基化四環(huán)素類是一條可行路線。由于金霉素在酶反應(yīng)液中穩(wěn)定性較差，如何在保持金霉素的穩(wěn)定性和酶的活性基礎(chǔ)上完成金霉素糖基化反應(yīng)，是下一步實(shí)驗(yàn)需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。金霉素異構(gòu)體的糖基化產(chǎn)物有無(wú)除抑菌外的其他藥理活性，需我們進(jìn)一步研究。

[1] Song MC, Kim E, Ban YH, et al. Achievements and impacts of glycosylation reactions involved in natural produst biosynthesis in prokaryotes. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(13):5691-5704.

[2] De Bruyn F, Maertens J, Beauprez J, et al. Biotechnological advances in UDP-sugar based glycosylation of small molecules. Biotechnol Adv, 2015, 33(2):288-302.

[3] Xiao J, Muzashvili TS, Georgiev MI. Advances in the biotechnological glycosylation of valuable flavonoids. Biotechnol Adv, 2014, 32(6): 1145-1156.

[4] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Volume 2, 2005. Beijing: Chemical Industry Press, 2005:541. (in Chinese)國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典. 2005年版二部. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:541.

[5] Ding HX, Huang YC, Ding WY, et al. Studies on the chemistry of aureomycin II. Isoaureomycin and its analogues. Acta Chimica Sinica, 1955, 22(2):142-150. (in Chinese)丁宏勛, 黃耀曾, 丁維鈺, 等. 金微素的化學(xué) II. 異金微素及其同型物. 化學(xué)學(xué)報(bào), 1955, 22(2):142-150.

[6] Casy AF, Yasin A. Stereochemical studies of tetracycline antibiotics and their common impurities by 400 MHz 1H NMR Spectroscopy. Magn Reson Chem, 1985, 23(9):767-770.

[7] Shang Z, Salim AA, Khalil Z, et al. Fungal biotransformation of tetracycline antibiotics. J Org Chem, 2016, 81(15):6186-6194.

[8] Wen YL. The stability of tetracycline antibiotics. Chin Pharm J, 1966, 12(1):35-39. (in Chinese)溫玉麟. 四環(huán)素類抗菌素的穩(wěn)定性. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 1966, 12(1):35-39.

[9] Sun LL, Chen DW, Chen RD, et al. Exploring the aglycon promiscuity of a new glycosyltransferase from Pueraria lobata. Tetrahedron Lett, 2016, 57(13):1518-1521.

Enzymatic glycosylation of antibiotics chlortetracycline by a new glycosyltransferase

DAI Shu-yuan, ZHAO Xi-shu, XIE Ke-bo, WANG Xia, DAI Jun-gui

ObjectiveTo mine novel glycosyltransferase with the ability to glycosylate antibiotics chlortetracycline.

MethodsAfter preliminarly sreening, glycosyltransferase AaGT1 from A. arborescens was found to be capable of glycosylating chlortetracycline. AaGT1 was utilized to catalyze the glycosylation of chlortetracycline with uridine diphosphate glucose. To remove the unreacted chlortetracycline, the reaction solution was extracted with EtOAc for five times. And the rest aqueous phase was dried by removal of water under reduced pressure, then purified by semi-preparative reversed-phase HPLC. The structures of glycosylated products were determined by HRMS and NMR spectroscopic data analysis. In addition, water solubility of glycosylated product and substrate were measured, and their antibacterial activities were evaluated.

ResultsTwo glycosylated products were obtained and identified as iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside and 4-epi-iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside. The solubility of iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside in water was increased by 3.3 times compared with that of chlortetracycline hydrochloride. However, the glycosylated products showed no significant antibacterial activity against Staphylococcus aureus.

ConclusionIso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside, 4-epi-iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside are novel compounds, and glycosylation of drugs may increase their water solubility.

Chlortetracycline; Glycosylation; Glycosyltransferase; Aloe arborescens

DAI Jun-gui, Email: jgdai@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81602999）

100034 北京市第三十五中學(xué)（戴舒遠(yuǎn)、趙錫澍、王霞）；100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所（解可波、戴均貴）

戴均貴，Email：jgdai@imm.ac.cn

2016-12-09

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(3):221-226

Author Affiliations: Beijing No. 35 High School, Beijing 100034, China (DAI Shu-yuan, ZHAO Xi-shu, WANG Xia); Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (XIE Ke-bo, DAI Jun-gui)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):221-226