鄒志兵

(廣西民族大學 相思湖學院，廣西 南寧 530008)

● 運動人體科學

低氧訓練狀態(tài)下大鼠心肌組織細胞凋亡與血管新生的表達

鄒志兵

(廣西民族大學 相思湖學院，廣西 南寧 530008)

目的：研究低氧訓練狀態(tài)下心肌組織細胞凋亡和血管新生的情況。方法：將60只健康雄性SD大鼠，隨機分為6組,運動組采用負荷跑臺訓練8w，一周訓練6d，運動量從最初的10 m/min、時間為15 min增加到第8周的速度為25 m/min、時間為50 min，每周逢雙在海拔1500 m 的低氧環(huán)境下進行低氧訓練，低氧濃度從最初的1500 m海拔高度增加到訓練結束的3600 m海拔高度。結束訓練后，采用戊巴比妥鈉麻醉后取材。采用HE染色、TUNEL法進行細胞凋亡檢測，Bcl-2、Bax和CD34的表達采用蛋白免疫組織化學方法進行檢測，毛細血管的生成情況使用顯微圖象分析。結果：1)低氧對照組心肌組織細胞開始出現(xiàn)凋亡，血管生成沒有；2)運動組心肌組織細胞有凋亡發(fā)生，血管生成也開始出現(xiàn)；3)低氧訓練組與其它組別在凋亡方面沒有顯著性差異(p≥0.05)，但在血管新生方面表現(xiàn)出很大的差異性(p≤0.05)。以上情況提示低氧復合運動不會加重心肌組織細胞凋亡，但會促進血管新生。

低氧訓練；細胞凋亡；血管新生

細胞凋亡是細胞在一定的生理和病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命，最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其它細胞吞噬的過程。在心臟的生理和病理發(fā)展過程中心肌細胞凋亡有很重要的作用。心肌細胞凋亡的因素影響有很多，如鈣超載、自由基、DNA損傷、缺氧缺血、運動等。

血管新生是心肌組織的一種機體保護反映，心肌缺血狀態(tài)得到改善，心肌組織能源物質和氧氣的交換得以擴大，心臟的工作能力得到增強。血管新生的影響因素有很多，如腫瘤、低氧、缺血、運動等，這些過程都能誘發(fā)新的血管生成。

低氧訓練既受運動負荷缺氧的影響、又受環(huán)境缺氧的刺激，其對心肌細胞凋亡和血管新生的情況如何，目前尚無文獻報道。鑒于此，通過本實驗觀察低氧訓練狀態(tài)下大鼠心肌組織細胞凋亡和血管新生的表達情況，探討兩者之間的關聯(lián)和分子機制，為低氧訓練適應機理提供實驗依據(jù)和參考。

1 研究方法

1.1 研究對象、分組及處理方法

將60只體重大約為200 g的雄性健康SD大鼠隨機分為六組：A為對照組、B為低氧組、C為運動組、D為低住高練組、E為高住低練組、F為高住高練低練組，每個組別均為10只(見表1)。

1.2 運動訓練方案

使用動物跑臺，進行遞增負荷訓練，持續(xù)8個星期，每星期訓練6天。

1.3 低氧情況

低氧艙中氧含量的變化采用氧氣監(jiān)測儀實時監(jiān)測，所有低氧組大鼠居住在低氧艙中，低氧濃度從第1周的1500 m海拔高度升至第8周的3600 m海拔高度，每周升高300 m。

表1 SD大鼠各組處理方法

表2 大鼠運動訓練方案(速度×持續(xù)時間)

1.4 標本制作

實驗結束后，取大鼠整心按房間隔、室間隔的路線切開，常規(guī)脫水、透明、進蠟、石蠟包埋。

1.5 實驗方法和檢測指標

1.5.1 HE染色

將大鼠心臟標本按照常規(guī)方法進行石臘包埋、切片。再按常規(guī)方法脫臘、染色、封片。

1.5.2 Bax、Bcl-2和CD34檢測

采用試劑盒檢測 Bax、Bcl-2和CD34蛋白表達情況。采用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)測定陽性產物的表達。

1.5.3 細胞調亡檢測

采用原位TUNEL細胞凋亡試劑盒進行細胞凋亡檢測。方法：標本切片常規(guī)脫臘至水，由專業(yè)人員嚴格按照試劑盒說明書操作。采用普通光學顯微鏡進行觀察，陽性凋亡細胞的細胞核染色呈棕黃色或棕褐色，細胞核DNA碎片有部分溢出，陽性染色也存在部分胞漿；沒有凋亡細胞的細胞核被蘇木素染成藍色，形態(tài)大小均勻，核相對較大。在光學顯微鏡(×400)隨機觀察每張切片的6個視野，大約500個細胞的數(shù)量。采用Simple PCI顯微圖像分析軟件測試每100個細胞中的平均陽性凋亡細胞數(shù)來計算凋亡指數(shù)。

1.5.4 微血管密度的計數(shù)

按照Feldser[1]報告的方法進行結果判斷，用血管數(shù)目的平均數(shù)來表示。先在低倍鏡(×40)下掃描整個視野的區(qū)域，選擇高陽性物質表達密度區(qū)作為代表，然后在高倍鏡(×200)下計數(shù)被抗CD34抗體染成棕色的血管數(shù)目，把單個存在的陽性表達物視為一個微血管。

1.5.5 微血管灰度水平和表達面積的測試

免疫組化陽性產物的灰度和面積采用Simple PCI圖象分析系統(tǒng)進行分析。具體操作：每張切片在10×40倍鏡下選取不相重疊的3個代表性視野，測量陽性產物的面積和灰度值以及所選區(qū)域的平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差表示，采用方差分析來確定各組間的顯著性差異水平。顯著性水平標準為α=0.05，p≤0.05具有顯著性差異，p≤0.01具有非常顯著性差異。

2 結果

2.1 大鼠心肌組織細胞的HE染色結果

常氧組大鼠心肌細胞結構完整，沒有出現(xiàn)異常改變(如圖1A)。低氧組和常氧運動組大鼠心肌細胞結構開始有變化，大鼠核染色質固縮，集聚于核膜周邊，細胞體變小(如圖1B)。低氧運動組心肌細胞未見明顯腫脹，間隙也不是很大，沒有出現(xiàn)與鄰近細胞脫離的現(xiàn)象，凋亡特征與低氧組和運動組相比較，不是很明顯(如圖1中C)。

圖1 大鼠心肌組織細胞HE染色結果(×40)

2.2 大鼠心肌組織細胞TUNEL結果

如表3可知，所有實驗組大鼠心肌組織檢測結果之間無顯著性差異。低氧對照組、運動組和低氧運動組大鼠心肌組織細胞凋亡檢測結果顯著高于對照組(p<0.01)，其余各組之間比較無顯著性差異。

表3 各組大鼠心肌組織細胞凋亡指數(shù)(PI)檢測結果

2.3 大鼠心肌組織Bax、Bcl-2和CD34免疫組織化學染色結果

2.3.1 Bax

由表3、4可知，所有試驗組大鼠與常氧對照組比較，心肌組織Bax的檢測結果有顯著性差異，其余各組之間相互比較無顯著性差異。

2.3.2 Bcl-2

由表3、4可知，所有試驗組大鼠與常氧對照組比較，心肌組織Bcl-2的檢測結果有顯著性差異，其余各組之間相互比較無顯著性差異。

表4 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2蛋白表達結果

2.3.3 大鼠心肌組織CD34免疫組織化學結果

CD34免疫組織化學染色陽性表達呈棕黃色,著色比較鮮明，紫色顯示的是細胞核。微血管的形態(tài)各種各樣，有的新生血管開始成形，有管腔出現(xiàn)(圖2A)，有的只是不清晰的條狀或點狀(圖2B)。不同的低氧訓練模式，血管的數(shù)量也有不同的表達。低氧組與常氧組變化不是很明顯(圖2A)，運動組與常氧組、低氧組比較開始出現(xiàn)差異(圖2B)。三種低氧訓練組與前面幾組相比較，開始有大量血管新生生成，表現(xiàn)很明顯(圖2C)。

2.3.4 大鼠心肌組織微血管顯微圖象觀察分析結果

圖2 大鼠心肌組織CD34免疫組織化學染色(×40)

表5 心肌組織血管新生免疫組織化學圖像分析結果

3 分析討論

3.1 低氧對心肌組織細胞凋亡和血管新生的表達

目前關于低氧與心肌細胞凋亡的研究，國內外已較為廣泛。細胞低氧的程度、時間決定了細胞是否走向凋亡或適應[2]。許多研究顯示,冠狀動脈梗阻2 h 即可引起大鼠心肌細胞凋亡；缺血45 min 后再灌注l h 可加劇細胞凋亡，提示單純缺血和缺血后再灌注均可誘發(fā)細胞凋亡[3]。Tanaka等研究培養(yǎng)的新生鼠心肌細胞，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在低氧12 h 即可出現(xiàn)，并隨低氧時間延長逐漸加重。本實驗研究結果說明隨著低氧時間的延長，心肌組織細胞凋亡開始增加，與前人研究結果基本一致。

關于低氧與血管新生，說法不一。鄒志兵[4]等在低氧訓練促進心肌組織微血管新生免疫組化研究表明，只是低氧處理大鼠心肌組織微血管密度不會增加，低氧中見到的毛細血管密度的增加不是由于血管新生，而是因為肌纖維橫斷面減少所致。國內有學者觀察大鼠在模擬5000 m 高原短期時間內不見有血管新生，但是隨著時間的延長，毛細血管開始大量出現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，單純低氧組鮮見有毛細血管新生，但是有血管樣結構，不具有功能性的血管。產生這些現(xiàn)象的原因可能與研究對象、低氧模式、低氧程度及低氧時的其它影響因素有關。

3.2 運動對心肌組織細胞凋亡和血管新生的表達

在運動過程中，心臟對一般的負荷缺氧會有適應，不會造成損害，這與心臟本身自身的應激有關，但這種適應是有條件和限度的，在運動過量或者是超負荷狀態(tài)下，尤其是力竭狀態(tài)下，心肌細胞的防御能力有限，會造成細胞凋亡。袁海平等[5]報道，運動后心肌細胞凋亡隨著運動強度的加大，凋亡率也開始升高，SOD活性顯著降低，而MDA含量顯著升高。提示：運動可誘導心肌細胞凋亡，而運動后心肌細胞抗氧化能力下降，可能是凋亡發(fā)生的機制之一。常蕓、郭勇力[6,7]等研究發(fā)現(xiàn)，中等強度運動組心肌細胞凋亡數(shù)與對照組相比，無顯著性差異。且凋亡調控基因bcl-2mRNA表達明顯增加，抑制心肌細胞凋亡。多數(shù)專家研究表明，大強度、過度訓練和力竭運動均引起心肌細胞凋亡，對心肌造成嚴重損傷；而中小強度的耐力訓練則可減少心肌細胞凋亡，對心肌有保護作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞與對照組相比較，凋亡較明顯，說明運動強度還是比較大的。

Tagarakis等[8]研究認為,運動可使心肌毛細血管密度顯著增加。鄒志兵等[9]研究認為，心肌對運動的刺激較易發(fā)生血管生成。大量文獻也表明,適宜的運動可以導致心肌組織中毛細血管數(shù)量增多。張小俊等[10]用HE染色用墨汁灌注的方法得出運動可以使老年大鼠毛細血管增生。分析其可能原因是有一部分毛細血管通過“動脈化”途徑轉變成動脈,從而無法觀察到血管新生的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)運動訓練組心肌組織血管生成開始增加，較不運動組和低氧組有顯著性差異。

3.3 低氧運動對細胞凋亡和血管新生的表達

低氧可以誘導心肌細胞凋亡，訓練亦可誘導心肌細胞凋亡，是否低氧訓練將誘導更為嚴重的心肌細胞凋亡呢？這需要通過一系列實驗來說明。林喜秀等[11]研究認為，低氧訓練能使心肌細胞凋亡加劇。但本次實驗結果認為，與對照組相比，細胞凋亡具有顯著性差異，但低氧結合運動，并沒有使細胞凋亡有明顯的變化，低氧訓練抑制了心肌組織細胞凋亡，這可能與不同的運動強度、不同的低氧濃度、以及常氧低氧不同的組合有關。

鄭瀾[12]等在低氧訓練促進心肌組織微血管體視學研究中表明，低氧結合運動，可以產生豐富的毛細血管，但單純的運動或者是低氧，這種現(xiàn)象不會發(fā)生。曾凡星[13]等研究經過4周的每天12 h 的海拔4000 m 慢性間歇低氧訓練的大鼠，毛細血管開始增多，產生心臟的適應性變化。毛杉杉等觀察到急性低氧力竭運動可引起心肌毛細血管新生，但屬于暫時性現(xiàn)象。鄒志兵[14]等發(fā)現(xiàn)每天在海拔3600 m慢性間歇低氧訓練心肌組織的微血管生成明顯。本研究結果也發(fā)現(xiàn)，低氧訓練發(fā)現(xiàn)有大量的毛細血管生成，與以上各位專家研究的實驗結果相一致。

4 結論

4.1 低氧能引起心肌細胞凋亡，但是不能促進血管新生。

4.2 運動能引起心肌細胞凋亡，凋亡的程度與運動強度、運動時間高度相關；運動能使心肌組織毛細血管數(shù)量增加。

4.3 低氧復合運動，不會加重心肌組織的細胞凋亡，但能顯著增加毛細血管密度。

[1] Feldser D,Agani F,Lyer N, et al. Reciprocal positive regulation hypoxia inducible factor 1 a and insulin-like growth 2.[J].Cancer Res, 2004, 3915—3918.

[2] 林喜秀，周桔，羅志強，等.低氧訓練與低氧大鼠心肌細胞凋亡及凋亡因子的表達[J].中國組織工程研究，2013,11:1951—1958.

[3] 邢維新.運動訓練與心肌細胞凋亡研究的新進展[J].綿陽師范學院學報,2011,30(2):127—130.

[4] 鄒志兵，鄭瀾.低氧訓練促進大鼠新肌組織血管生成免疫組化研究[J].山東體育學院學院，2011,25(9):59—62.

[5] 袁海平,劉學.大鼠不同強度運動對心肌細胞凋亡及其抗氧化能力的影響[J].體育科學,2002,22(1):107—109.

[6] 常蕓,袁箭峰,祁永梅,等.運動心臟重塑與微損傷發(fā)生中的細胞凋亡現(xiàn)象[J].中國運動醫(yī)學雜志,2003,22(4):344—349.

[7] 郭勇力,劉霞,張文峰,等.不同強度運動對大鼠心肌細胞凋亡的影響[J].中國臨床康復,2004,8(9):1732—1733.

[8] Tagarakis C, Bloch W, Hartmang N,et al. Test osterone -propionate Impairs the Response of the Cardia Capillary Bed to Exercise[J].Med Sci Sports Exe,2003,32(5):946—953.

[9] 鄒志兵.低氧訓練時心肌組織細胞低氧誘導因子1α與凋亡相關蛋白的表達[J].中國組織工程研究，2015,12(10)：8305—8310.

[10] 張小俊,李付強,等.缺氧條件下心肌組織的形態(tài)學改變及缺氧誘導因子-1在心臟內的表達[J].中國老年學雜志，2013,10(23)：4231—4237.

[11] 林喜秀，瞿樹林，等.低氧訓練與低氧大鼠心肌細胞凋亡及凋亡因子的表達[J].中國組織工程研究，2013,03(12):1951—1958.

[12] 鄭瀾,陸愛云,周志宏.低氧訓練促進大鼠新肌組織血管生成的體視學研究[J].體育科學，2005,25(9):59—62.

[13] 葉鳴,曾凡星.高住低訓在運動實踐中的應用[J].首都體育學院學報,2006,6(4):52—57.

[14] 鄒志兵,鄭瀾.低氧訓練對大鼠心肌組織微血管生成的影響[J].西安體育學院學報，2010,3(2)：194—197.

Expression of Hypoxic Training to Myocardial Apoptosis and Angiogenesis in Rats

ZOU Zhi-bing

(Xiangsi Lake College, Guangxi University Nationnalities , Nanning 530008，China)

Objective: To study the effects of Hypoxic Training to Myocardial Apoptosis and Angiogenesis in Rats. Methods: 60 male SD rats were randomly divided into six groups. 8 weeks progressive treadmill exercise program were designed with intensity starts from 10m/min for 15min at the first week to 26m/min for 50min in the last week and hypoxia degree from 1500m at the first week to 3600m in the last week. The protein expression of CD34, Bcl-2, Bax in the cardiomyocytes were analysis with HE staining, TUNEL, and immunity histochemistry. Microscopic image analysis capillary density, optical density level, express area. Results: 1) when simple hypoxic myocardial tissue apoptosis is exsited, but angiogenesis is not happened. 2) the move group reduced myocardial tissue Bcl-2 expression, Bax expression change is not obvious, the Bcl-2/Bax ratio decreased, promote apoptosis, expression of CD34 positive things began to emerge. 3) apoptosis in hypoxic exercise group compared with the low oxygen groups, sports group difference is not very big, but show great differences in terms of angiogenesis. Prompt low oxygen compound movement doesn't increase the apoptosis of myocardial cells, but will promote new blood vessels.

hypoxic training; apoptosis; angiogenesis

廣西教育廳科研項目“低氧訓練對大鼠心肌組織細胞凋亡和血管新生的研究”(KY2015YB499)

2016-08-17

鄒志兵(1978—)，男，廣西南寧人，副教授。研究方向：低氧訓練的生理機制。

G804.7

A

1671-1300(2017)01-0098-06