牛建麗+于永麗+曹艷杰+王猛

1 引 言

色氨酸（Tryptophan，Trp）作為一種生物體必需氨基酸，具有非常重要的生理功能，在蛋白質(zhì)生物合成過程中起著非常重要的作用，也是機(jī)體煙酸、血清素及其它代謝產(chǎn)物的前體。臨床上，色氨酸不僅用于營養(yǎng)輸液，也用于抑郁癥、高血壓及疼痛等病癥的治療[1]。適量攝入富含色氨酸的食物可以改善睡眠質(zhì)量、增強(qiáng)人體的抗氧化水平[2，3]。已報道的色氨酸的測定方法主要有高效液相色譜法[4，5]、電化學(xué)法[6，7]、毛細(xì)管電泳法[8]和熒光法[9～11]等。其中，高效液相色譜法和電化學(xué)法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但高效液相色譜分析中樣品前處理比較耗時、儀器操作相對復(fù)雜，電化學(xué)分析法對電極的制備要求較高。熒光分析法具有簡單快速、方法重現(xiàn)性好的優(yōu)點，隨著各種新的熒光物質(zhì)不斷涌現(xiàn)，熒光分析法得到越來越廣泛的應(yīng)用。

稀土發(fā)光納米粒子是一類性能優(yōu)越的發(fā)光材料，具有發(fā)光強(qiáng)度大、發(fā)射譜線窄、發(fā)光壽命長和Stokes位移大等特點，已被成功用于物質(zhì)的定量分析[12]、癌細(xì)胞成像[13]和靶向治療[14]等研究領(lǐng)域。近年來，基于研究體系的內(nèi)濾效應(yīng)進(jìn)行定量分析的研究有很多報道[15～18]，內(nèi)濾效應(yīng)（Inner filter effect，IFE）是指體系中熒光劑的激發(fā)或發(fā)射光被吸收劑（猝滅劑）吸收，從而導(dǎo)致熒光劑的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象[19]。相比于熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，熒光內(nèi)濾效應(yīng)的發(fā)生不需要熒光體和吸收體發(fā)生化學(xué)結(jié)合，實驗操作更加簡單。與紫外分光光度法相比，利用熒光內(nèi)濾效應(yīng)將吸收體的吸收變化轉(zhuǎn)換為呈指數(shù)變化的熒光體的熒光強(qiáng)度變化，使得待測物的分析具有更高的靈敏度[20]。

本研究采用溶劑熱法合成發(fā)光性能和水溶性良好的YVO4∶Eu納米探針（YVO4∶Eu NPs），由于色氨酸的吸收光譜與YVO4∶Eu NPs的激發(fā)光譜有很大程度的重疊，二者可以發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)，即色氨酸吸收YVO4∶Eu NPs的激發(fā)光能量，導(dǎo)致YVO4∶Eu NPs的熒光強(qiáng)度顯著降低，據(jù)此建立了測定色氨酸含量的分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Cary Eclipse發(fā)光分光光度計（美國瓦里安公司）；PHS3E型pH酸度計（上海雷磁精密科學(xué)儀器有限公司）； UV2100雙光束紫外可見分光光度計（北京瑞麗分析儀器有限公司）；TG16G臺式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）； TECNAI 20型透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。

Y2O3、Eu2O3（北京有研稀土新材料股份有限公司）；原釩酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；聚乙烯亞胺（PEI10000，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）； L色氨酸（LTrp，阿拉丁試劑）；實驗用水為蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 YVO4∶Eu NPs的制備 參照文獻(xiàn)[21]方法制備YVO4∶Eu納米粒子，實驗中對合成條件進(jìn)行了優(yōu)化，具體如下：分別移取濃度均為0.1 mol/L的Y（NO3）3溶液3.75 mL和Eu（NO3）3溶液1.25 mL于錐形瓶中，磁力攪拌下加入4 mL 0.4 g/mL PEI溶液，攪拌均勻，再加入5 mL 0.1 mol/L Na3VO4溶液，然后加入14 mL乙醇，最后調(diào)節(jié)至pH 9.0。在80 ℃水浴中反應(yīng)1 h，然后轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯罐中，將聚四氟乙烯罐放入反應(yīng)釜密封，置于160 ℃烘箱中反應(yīng)20 h。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻到室溫，得到Y(jié)VO4∶Eu 納米粒子的膠體溶液。向以上膠體溶液中加入乙醇，離心分離， 沉淀用乙醇和水洗滌沉淀，在超聲作用下，用10 mL水分散沉淀，即制得YVO4∶Eu NPs溶液。產(chǎn)物具有良好的水溶性和光學(xué)穩(wěn)定性，可以在室溫存放至少6個月，溶液外觀和發(fā)光性能沒有改變。以合成時加入的Y3+和Eu3+的總物質(zhì)的量計，溶液中YVO4∶Eu NPs的濃度為0.05 mol/L，分析應(yīng)用時，以水稀釋至相應(yīng)的濃度。若將YVO4∶Eu納米粒子溶液離心分離，沉淀經(jīng)干燥后可長期保存，使用時超聲分散到水中即可。以羅丹明B為熒光標(biāo)準(zhǔn)物，測得所制備納米粒子的量子產(chǎn)率為17%。

3 結(jié)果與討論

3.1 YVO4∶Eu NPs的TEM表征

可用于生物分析的稀土發(fā)光納米粒子通常應(yīng)滿足以下要求：粒子的粒徑較小且分布均勻、發(fā)光強(qiáng)度大且穩(wěn)定、水溶性和生物相容性好。目前，常用的制備方法主要有水熱法[21]、溶劑熱法[22]、有機(jī)前驅(qū)體熱分解法[23]和惰性氣體保護(hù)下的高溫加熱合成[12]。

其中，熱分解法合成所用有機(jī)試劑有一定的毒性，惰性氣體保護(hù)高溫加熱合成的反應(yīng)條件相對比較苛刻。溶劑熱法反應(yīng)條件溫和、操作簡單易行，與水熱法相比，所制備產(chǎn)物的結(jié)晶度和發(fā)光性能更好。因此，本研究采用溶劑熱法制備YVO4∶Eu 納米粒子。

采用透射電子顯微鏡（TEM）對所制備納米粒子進(jìn)行了表征，結(jié)果見圖1，粒子形狀為類球形，粒度比較均勻， 粒徑在20 nm左右，分散性較好。

3.2 YVO4∶Eu NPs和色氨酸的熒光內(nèi)濾效應(yīng)

由于所制備的YVO4∶Eu 納米粒子表面修飾了PEI，可直接作為熒光探針使用，YVO4∶Eu NPs具有良好的水溶性和光學(xué)穩(wěn)定性。圖2為YVO4∶Eu NPs的激發(fā)光譜（a）和色氨酸的紫外吸收光譜（b），YVO4∶Eu NPs的最大激發(fā)峰位于280 nm，色氨酸的吸收光譜峰值位于278 nm，與YVO4∶Eu NPs的激發(fā)峰和色氨酸的吸收峰有很好的重疊，這表明YVO4∶Eu NPs和色氨酸體系具備發(fā)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)的條件。

向系列相同濃度的YVO4∶Eu NPs溶液中分別加入不同濃度色氨酸溶液，掃描YVO4∶Eu NPs的發(fā)射光譜。由圖3表明，隨著色氨酸濃度的增加，YVO4∶Eu NPs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。這是因為色氨酸和YVO4∶Eu NPs之間發(fā)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)，即色氨酸吸收YVO4∶Eu NPs激發(fā)光的能量，導(dǎo)致YVO4∶Eu NPs發(fā)射的熒光強(qiáng)度顯著降低。這為建立基于YVO4∶Eu NPs測定色氨酸的分析方法奠定了基礎(chǔ)。

3.3.3 反應(yīng)時間的選擇 將YVO4∶Eu NPs和色氨酸溶液旋渦混合后，測定放置不同時間時體系的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果表明，10 min時體系的熒光強(qiáng)度降低幅度達(dá)到最大，且60 min內(nèi)基本不變。這說明色氨酸和YVO4∶Eu NPs之間的熒光內(nèi)濾效應(yīng)可以很快發(fā)生，60 min內(nèi)反應(yīng)體系都很穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本實驗中YVO4∶Eu NPs的制備方法簡單易行，所制備納米探針具有良好的水溶性和光學(xué)穩(wěn)定性。基于YVO4∶Eu NPs和色氨酸的熒光內(nèi)濾效應(yīng)，建立了測定色氨酸含量的方法。本方法具有簡單快速、靈敏準(zhǔn)確的特點。采用本方法對醬油樣品中的色氨酸含量進(jìn)行了測定，回收率良好。本實驗拓展了稀土發(fā)光納米粒子的應(yīng)用范圍。

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