李 歡 焦峰軍 白 鋒

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，甘肅 蘭州 730030)

Toll樣受體2對人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用

李 歡 焦峰軍1白 鋒

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，甘肅 蘭州 730030)

目的 探討Toll樣受體(TLR2)調(diào)控Notch1信號通路對人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。方法 從正常主動脈瓣組織及主動脈瓣狹窄病人的主動脈瓣組織中分離出主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測200 ng/ml的TLR2激活物脂多糖(LPS)干預(yù)細(xì)胞24 h后白細(xì)胞介素(IL)-6、巨細(xì)胞趨化因子(MCP)-1和細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1濃度；Western印跡檢測200 ng/ml的LPS干預(yù)細(xì)胞2、4、8、12 h后NICD1蛋白表達(dá)，ELISA檢測Jagged1濃度；60 nmol/L的人Notch1特異性siRNA沉默Notch1及200 ng/ml的LPS刺激細(xì)胞24 h后，Western印跡檢測NICD1及 ICAM-1蛋白表達(dá)；5 μg/ml的Jagged1及200 ng/ml的LPS處理細(xì)胞，ELISA檢測IL-6、MCP-1和 ICAM-1濃度。結(jié)果 正常主動脈瓣組織及主動脈狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后IL-6、MCP-1和VCAM-1的濃度均顯著高于無LPS刺激組，主動脈狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中IL-6、MCP-1和VCAM-1的濃度均顯著高于正常組(P<0.01)；LPS刺激能誘導(dǎo)NICD1的生成及增加，具有時間依賴性，且主動脈狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中NICD1生成量多于正常組；主動脈狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中Jagged1濃度顯著高于正常組，且隨著時間延長增加；沉默Notch1信號通路能減弱NICD1的蛋白表達(dá)，且能減少炎癥因子ICAM-1的蛋白表達(dá)；Jagged1激活Notch信號通路能誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的IL-6、MCP-1、ICAM-1，而能明顯增強(qiáng)TLR2誘導(dǎo)的IL-6、MCP-1、ICAM-1的水平。結(jié)論 TLR2能誘導(dǎo)人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及活化Notch1信號通路，主動脈瓣狹窄的主動脈瓣組織間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)更明顯，沉默Notch1信號通路可減弱TLR2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，激活Notch信號通路則增強(qiáng)TLR2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

Toll樣受體(TLR)2；Notch信號通路；主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞；炎癥反應(yīng)

鈣化性主動脈瓣疾病(CAVD)是老年人群常見的一種心臟瓣膜疾病〔1〕，臨床上藥物治療效果不佳，目前手術(shù)治療是唯一的治療手段，但手術(shù)治療風(fēng)險大且費用高〔2,3〕。流行病學(xué)及組織病理學(xué)研究顯示，CAVD的發(fā)病是一個由多因素參與的復(fù)雜病變，包括糖尿病、脂質(zhì)代謝異常、骨化反應(yīng)及鈣化、炎癥等〔4,5〕。但有研究者認(rèn)為CAVD是一種慢性炎癥疾病，且有大量研究證實CAVD與炎癥有密切的關(guān)系〔6〕。研究指出，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β等炎癥因子能促進(jìn)CAVD的發(fā)生發(fā)展，也有研究提出口腔細(xì)菌感染可引起CAVD〔7〕。Toll樣受體(TLRs)是模式識別受體因子(PRRs)家族中高度保守的跨膜受體，能夠識別各種病原體，TLRs被激活后可參與炎癥反應(yīng)〔8〕。TLR2是重要的TLRs之一，在人CAVD中有功能TLR2的表達(dá)，TLR2受到刺激后可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)〔1〕。Notch信號通路在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、炎癥等生理病理過程中發(fā)揮重要作用，其中Notch1的表達(dá)最廣泛〔9〕。近些年的研究顯示細(xì)菌產(chǎn)物可激活Notch1受體，從而對細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)〔10〕。本研究旨在證實TLR2是否可調(diào)控Notch1信號通路對人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 正常主動脈瓣組織由2015年9～12月蘭州大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行心臟移植術(shù)患者移植出來的心臟中獲得，其中男6例，女4例，平均年齡(61±6.7)歲。主動脈瓣狹窄的主動脈瓣組織由同時期在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行主動脈瓣膜置換術(shù)患者被置換出的主動脈瓣膜中獲得，其中男5例，女3例，平均年齡(64±12.3)歲。所有組織的取得均得到捐獻(xiàn)者同意，并簽訂知情同意書。

M99細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶及胰酶終止液均購自美國Lonza公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；兔抗人細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1抗體、Notch1 siRNA、scrambled siRNA 均購自美國Santa Cruz公司；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、Notch1胞內(nèi)段(NICD1)抗體均購自美國Cell Signaling公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Jagged1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自中國USCN公司；IL-6、巨細(xì)胞趨化因子(MCP)-1、ICAM-1 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱HERAcell型購自美國Thermo公司；垂直電泳槽DYCZ-24EN購自北京六一儀器；倒置熒光顯微鏡CK2-TRC-3型購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng) 去除主動脈瓣組織周圍的肌肉組織，無菌條件下獲取主動脈瓣膜，移至超凈臺上剝離內(nèi)皮層。間質(zhì)層切成0.5～1 mm3的小塊，置于M199培養(yǎng)基(含有1 g/L BSA和2 g/L Ⅳ型膠原酶)中，37℃消化2 h后，200 r/min離心30 s，去掉不能消化的組織，再加入5倍體積的M199培養(yǎng)基，1 500 r/min離心10 min，2次洗滌并離心后，棄掉上清，重懸細(xì)胞。細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察到細(xì)胞生長達(dá)到80%～90%時進(jìn)行傳代。所有試驗細(xì)胞均為第4～6代。

1.2.2 細(xì)胞干預(yù)處理 將消化傳代的人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞覆蓋度達(dá)到80%～90%時換成不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液中加入干預(yù)藥物，干預(yù)到達(dá)預(yù)定時間后收取培養(yǎng)液，并終止反應(yīng)。收取培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液。IL-6、MCP-1和ICAM-1 3個炎癥反應(yīng)因子測定試驗使用200 ng/ml的LPS干預(yù)24 h；Notch1活化及配體Jagged1的測定使用200 ng/ml的LPS干預(yù)2、4、8、12 h；沉默Notch1信號通路試驗先用siRNA處理細(xì)胞48 h，再進(jìn)行其他干預(yù)試驗。Notch1配體Jagged1干預(yù)試驗先用5 μg/ml的Jagged1溶液覆蓋在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后種植上人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，觀察到細(xì)胞貼壁后用200 ng/ml的LPS處理細(xì)胞24 h，收集樣品備用。

1.2.3 ELISA法檢測IL-6、MCP-1、ICAM-1及Jagged1濃度 按照ELASA試劑盒操作說明進(jìn)行試驗。具體步驟：將包被的抗體按說明書稀釋后，每個反應(yīng)孔中加入0.1 ml，常溫過夜培養(yǎng)。第2天棄去反應(yīng)孔中溶液，緩沖液洗滌3次，3 min/次。加入100 μl封閉液封閉2 h，倒出封閉液，緩沖液洗滌3次，3 min/次。將100 μl上清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加到反應(yīng)孔中，室溫孵育2 h，緩沖液洗滌3次，3 min/次。加入100 μl已稀釋液的檢測抗體于各個反應(yīng)孔中，室溫孵育2 h，緩沖液洗滌3次，3 min/次。每個反應(yīng)孔中加入100 μl酶標(biāo)抗體，室溫孵育30 min后，緩沖液洗滌3次，3 min/次。加入100 μl新鮮配置的底物稀釋液，室溫避光孵育30 min，加入50 μl 2N硫酸終止反應(yīng)。光密度儀(Bio-Rad)在450 nm波長讀取光密度值。Jagged1濃度測定根據(jù)Jagged1試劑盒說明進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

1.2.4 Western印跡檢測GAPDH、ICAM-1、NICD1蛋白表達(dá) 細(xì)胞干預(yù)達(dá)到預(yù)定時間后，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，適量的裂解液冰上裂解30 min，收集細(xì)胞，4℃ 14 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA試劑盒測定蛋白濃度，充分混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，4℃轉(zhuǎn)膜過夜。取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜用5%脫脂奶粉封閉后，分別以GAPDH、ICAM-1、NICD1作為一抗(1 000倍稀釋)，4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(2 000倍稀釋)，37℃孵育1 h，TBST洗膜。用ImageJ軟件對掃描結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.2.5 沉默及激活Notch1信號通路對人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 將種植在培養(yǎng)板中生長的人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%以上時，將培養(yǎng)液吸出，換成分別含有60 nmol/L人Notch1的特異性siRNA和5 μg/ml的Jagged1，然后分別加入60 μl/ml轉(zhuǎn)染劑和無血清無抗生素的培養(yǎng)基中，對照組加入相同濃度的Scrambled siRNA及培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染6 h后，將細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，200 ng/ml的LPS刺激24 h，收集樣品備用。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 TLR2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中IL-6、MCP-1和VCAM-1的影響 正常組及主動脈瓣狹窄組經(jīng)LPS刺激24 h后IL-6、MCP-1和VCAM-1的濃度均顯著高于無LPS刺激組，主動脈瓣狹窄組IL-6、MCP-1和VCAM-1的濃度均顯著高于正常組(P<0.01)。說明主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞比正常組織細(xì)胞有更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。見表1。

表1 TLR2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中IL-6、MCP-1和VCAM-1的影響

與無LPS刺激比較：1)P<0.01；與正常組LPS刺激24 h比較：2)P<0.01

2.2 刺激TLR2對主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Notch1信號通路的影響 200 ng/ml的LPS刺激兩種細(xì)胞0、2、4、8、12 h，能誘導(dǎo)NICD1的生成及增加，具有時間依賴性，且主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織的間質(zhì)細(xì)胞中NICD1生成量多于正常組織細(xì)胞。主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織的間質(zhì)細(xì)胞中Jagged1濃度顯著高于正常組織細(xì)胞，并隨著時間延長而增加。見圖1，表2，表3。

圖1 NICD1蛋白在正常組和主動脈瓣狹窄組瓣膜組織間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

組別nLPS0hLPS2hLPS4hLPS8hLPS12h正常組100020±00010060±00050114±00071478±00263112±0369主動脈瓣狹窄組80003±00010154±00071)1326±00231)2524±03321)4678±04111)

與LPS 0 h比較：1)P<0.01，下表同

表3 刺激TLR2對主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Jagged1濃度的影響

2.3 沉默Notch1信號通路對刺激TLR2產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的影響 沉默Notch1信號通路能減弱NICD1的蛋白表達(dá)，且能減少炎癥因子ICAM-1的蛋白表達(dá)。見圖2。

2.4 激活Notch1信號通路對刺激TLR2產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的影響 Jagged1能誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的IL-6、MCP-1、ICAM-1，并能明顯增強(qiáng)TLR2誘導(dǎo)的IL-6、MCP-1、ICAM-1的水平。見表4。

圖2 沉默Notch1信號通路對刺激TLR2產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的影響

組別IL?6MCP?1ICAM?1對照組1623±3782568±543942±287LPS15426±12351)8116±11491)4561±10241)Jagged13278±4321)4138±12261)1423±1971)LPS+Jagged122367±22711)2)12435±20181)2)6988±7451)2)

與對照組比較：1)P<0.01；與LPS和Jagged1組比較：2)P<0.01

3 討 論

CAVD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、炎癥等參與該病的發(fā)生發(fā)展。這些因素均可以對主動脈瓣膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，導(dǎo)致鈣鹽沉積，并使瓣膜鈣化〔11〕。已有研究證實炎癥對CAVD的發(fā)生發(fā)展起到重要作用〔12〕。有研究顯示CAVD中表達(dá)有功能的TLR2受體，用TLR2激活物L(fēng)PS刺激TLR2受體可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔13〕。LPS是一種經(jīng)典的促炎物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)正常瓣膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化〔14〕。本研究中為了證實用LPS刺激TRL4受體后，正常主動脈瓣組織及主動脈瓣狹窄的主動脈組織中主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞對炎癥刺激的反應(yīng)有何不同，結(jié)果顯示，主動脈瓣狹窄的主動脈組織中主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞IL-6、MCP-1和ICAM-1的濃度均顯著高于正常組。IL-6、MCP-1、ICAM-1能夠促進(jìn)白細(xì)胞浸潤，ICAM-1不僅能參與促進(jìn)白細(xì)胞浸潤，還能作為受體，與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子(LFA)-1結(jié)合參與細(xì)胞信號通路傳導(dǎo)，使胞外信號到胞內(nèi)，使機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)〔15〕。這說明主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)參與了CAVD的發(fā)生，主動脈瓣狹窄的主動脈組織中主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞對炎癥刺激更明顯表明主動脈瓣狹窄的主動脈瓣組織中主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞本身有一定的促炎作用。

Notch信號通路是一個高度保守的信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對細(xì)胞的增殖、分化和成熟有重要作用，其受體是單跨膜蛋白，配體包括Jagged-1、Jagged-2、Deltalike-1、Deltalike-2、Deltalike-3、Deltalike-4。Notch1受體與Jagged-1配體結(jié)合后，Notch1蛋白被γ-分泌酶切割，釋放出胞內(nèi)的活性片段NICD，NICD進(jìn)入細(xì)胞核后可與Maml家族的激活因子及DNA結(jié)合蛋白(CSL)結(jié)合從而形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，啟動Hes、Hey基因家族靶基因的轉(zhuǎn)錄，作為下游基因Math-1等的阻遏子發(fā)揮作用〔16～18〕。TLR2及Notch1是與炎癥刺激有密切相關(guān)的兩條通路〔19〕，刺激TLR2對主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Notch1信號通路的產(chǎn)生是否有影響呢？本文結(jié)果顯示，LPS刺激能誘導(dǎo)NICD1的生成及增加，具有時間依賴性，且主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中NICD1生成量多于正常組織細(xì)胞，主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中Jagged1濃度顯著高于正常組織細(xì)胞，且隨著時間延長增加。這說明TRL4受體能引起Notch1信號通路的活化。

研究顯示，TLRs可激活Notch1等轉(zhuǎn)錄因子，引起IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥有關(guān)因子及趨化因子的分泌，也有研究證實LPS刺激TLRs后能引起Notch1的核轉(zhuǎn)位及使免疫細(xì)胞激活而發(fā)生轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致促炎因子釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和凋亡〔20～22〕。沉默及激活主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞Notch1信號通路對刺激TLRs產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)還未可知。本研究通過沉默和激活Notch1信號通路，檢測Notch1信號通路對刺激TLR2產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，沉默Notch1信號通路能減弱NICD1的蛋白表達(dá)，且能減少炎癥因子ICAM-1的蛋白表達(dá)，而激活Notch1信號通路能增強(qiáng)IL-6、MCP-1、ICAM-1的水平。這說明TLR2誘導(dǎo)產(chǎn)生的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與Notch1的調(diào)控有關(guān)。

綜上，TLR2能誘導(dǎo)人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及活化Notch信號通路，主動脈瓣狹窄的主動脈瓣組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)更為明顯，沉默Notch信號通路減弱TLR2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，激活Notch信號通路則增強(qiáng)TLR2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

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〔2016-11-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

白 鋒(1963-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科臨床研究。

李 歡(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科臨床研究。

R541.1

A

1005-9202(2017)10-2392-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.019

1 咸陽市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科