曹艷紅， 潘建勛， 梁月琴， 師銳贊△

(1. 大同市第五人民醫(yī)院， 山西 大同 037000； 2. 山西醫(yī)科大學(xué)， 太原 030001)

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缺氧肺動脈平滑肌細(xì)胞中PKCα/c-fos、Bax/Bcl-2表達(dá)變化及其對增殖和凋亡的影響*

曹艷紅1， 潘建勛1， 梁月琴2， 師銳贊2△

(1. 大同市第五人民醫(yī)院， 山西 大同 037000； 2. 山西醫(yī)科大學(xué)， 太原 030001)

目的：研究缺氧大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)PKCα/c-fos、Bax/Bcl-2表達(dá)的變化及對其增殖和凋亡的影響。方法：將原代培養(yǎng)的大鼠PASMCs分為常氧組(5%CO2、21%O2、74%N2)和低氧組(5%CO2，2% O2，93%N2) 24 h，48 h。通過氮藍(lán)四唑鹽(MTT)比色法測定PASMCs的增殖水平，以流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡率，并通過用RT-PCR和Western blot法檢測PKCα/c-fos、Bax/Bcl-2基因和蛋白表達(dá)的變化。實驗至少重復(fù)3次，每組設(shè)置至少3個復(fù)孔。結(jié)果：低氧24 h和48 h組PASMCs增殖明顯，與常氧組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而細(xì)胞凋亡率無顯著變化。相對于常氧組，低氧24 h和48 h組PASMCs PKCα、c-fos表達(dá)增強(qiáng)，Bax表達(dá)變化不明顯，而Bcl-2表達(dá)增加。結(jié)論：低氧培養(yǎng)的PASMCs增殖明顯，凋亡無明顯變化。同時PKCα、c-fos表達(dá)增強(qiáng)，而抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)增加。

PKCα/c-fos；Bax/ Bcl-2；增殖；凋亡；低氧

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是肺心病發(fā)病過程中的中心環(huán)節(jié)，目前研究認(rèn)為，肺血管結(jié)構(gòu)重建(pulmonary vascular structural remodeling，PVSR)是其最主要的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，而肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)的增殖和凋亡失衡是PVSR

的重要機(jī)制之一。因此，以PASMCs增殖和凋亡為切入點，探討HPH的發(fā)病機(jī)制和治療策略具有重要意義。

據(jù)文獻(xiàn)報道，PKCα/AP-1通路參與了小牛主動脈的SMCs增殖[1]。另外，抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2和凋亡促進(jìn)基因Bax的比例上調(diào)是誘發(fā)PASMCs增殖的重要因素[2]。本實驗通過原代培養(yǎng)大鼠PASMCs，觀察低氧條件下PASMCs增殖和凋亡的變化，同時觀察低氧條件下PKCα、c-fos和凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2)表達(dá)的改變。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

膠原酶Ⅰ型(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)，胰酶(Gibco公司)，自動常壓缺氧孵箱(德國賀氏公司)，TRIzol、MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、OIigo(dT)15，RNA 酶抑制劑(Invitrogen公司)，兔抗大鼠PKCα、c-fos一抗、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記物羊抗兔/鼠IgG(sentacruz Biotechnology公司)、小鼠抗大鼠Bcl-2、Bax一抗(Cell Signaling Technology公司)，MTT細(xì)胞增殖、BCA蛋白濃度測定試劑盒 (碧云天公司)，Annexin V/PI凋亡試劑盒(BD公司)。

1.2 大鼠PASMCs培養(yǎng)、純化與分組

健康雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號：醫(yī)動字第070101]提供。大鼠PASMCs的培養(yǎng)和鑒定采用膠原酶Ⅰ消化法[3]。稱量大鼠體重，腹腔注射烏拉坦麻醉后斷頸法處死，無菌條件下分離肺動脈，去除血管內(nèi)膜和外膜，將中膜組織以酶消化法行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)于含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，3～4 d更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長融合鋪滿瓶壁約80%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，接種于新培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，首次傳代時, 采用差別消化法將PASM Cs與上皮細(xì)胞分離。傳代培養(yǎng)后改用含有10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液。兔抗大鼠α-SM-actin單克隆抗體免疫熒光鑒定。倒置相差顯微鏡下觀察，PASMCs呈典型的“峰-谷”長勢，α-SM-actin染色細(xì)胞陽性率98%以上；實驗用第 4～8代細(xì)胞。將PASMCs隨機(jī)分成以下組：常氧組(normoxia group, N)、低氧組(hypoxia group, H)。低氧培養(yǎng)采用37℃、2%O2、93% N2和5% CO2，時間點設(shè)為24 h，48 h。常氧對照組條件為37℃、21% O2、74% N2和5% CO2。

1.3 MTT法測定PASMCs增殖

以2×103cells/well接種PASMCs于96孔板，各組設(shè)6個平行復(fù)孔，在邊緣區(qū)域設(shè)立對照 (只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞 )，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。生長成層后換無血清 DMEM 培養(yǎng)基同步化24 h。將培養(yǎng)板移入不同條件培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)板中每孔終體積200 μl。特定時間點檢測時，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μl DMSO，將培養(yǎng)板平放在平板振蕩器上搖振10 min，使結(jié)晶物完全溶解。在酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長測定各孔吸光度值[D(490)]。

1.4 Annexin V-FITC/PI染色法檢測PASMCs凋亡率

參照Annexin V /PI雙染凋亡試劑盒操作說明書操作。0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，用100 μlBinding buffer將待測細(xì)胞的密度調(diào)整為5×105～1×106個細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC標(biāo)記液和5 μl PI，輕輕混勻。避光室溫染色15 min，400 μl Binding buffer重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(FACS calibur，BD)測定各組細(xì)胞發(fā)生凋亡的百分?jǐn)?shù)。

1.5 RT-PCR法檢測基因表達(dá)

Trizol提取各組單克隆細(xì)胞總RNA，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得的總RNA用20 μl DEPC水溶解。紫外吸收法測定總RNA在吸光度260 nm和280 nm處吸收值，計算其濃度和純度。取總RNA 2 μg，按Invitrogen公司MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列、退火溫度及產(chǎn)物bp數(shù)見表1。以β-actin mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)部標(biāo)定基因?qū)φ?。PCR產(chǎn)物在1.5%～1.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，條帶經(jīng)紫外顯色灰度掃描。實驗重復(fù)3次。

Tab. 1 Primer sequences of PKCα, c-fos, Bax, Bcl-2 and β-actin

Tar-getgenePrimersequence(5'?3')Productsize(bp)Tm(℃)PKCαP1:CCAAACGGGCTTTCAGAT42360P2:TTCACTCGGT-CAAGGTTGTTc-fosP1:GTCTCCAGTGC-CAACTTCAT28954P2:CAGCCATCTTATTC-CTTTCCBcl-2P1:CTGGTGGACAA-CATCGCTCTG22854P2:GGTCTGCTGACCT-CACTTGTGBaxP1:GCGAATTGGAGAT-GAACTGG36655P2:GTGAGCGAGGCGGT-GAGGACβ-ac-tinP1:CTACAATGAGCT-GCGTGTGGC27055P2:CAGGTCCAGACG-CAGGATGGC

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，通聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(NC膜)上，脫脂奶粉封閉后，一抗4℃雜交過夜，并與HRP標(biāo)記的二抗雜交，置搖床室溫孵育1 h。洗膜后暗室加入ECL溶液，進(jìn)一步顯影、定影。以β-actin蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)部標(biāo)定蛋白對照，以消除蛋白上樣量不同帶來的誤差。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧PASMCs增殖的改變

MTT結(jié)果表明，PASMCs細(xì)胞經(jīng)常氧、低氧處理24 h和48 h后，低氧組在490 nm處吸光度值均高于常氧組(圖1)。24 h和48 h常氧組和低氧組在490 nm處吸光度值分別為0.74±0.01和0.81±0.02、0.77±0.01和0.84±0.01。結(jié)果表明：低氧明顯促進(jìn)PASMCs的增殖 (P<0.01)，且低氧處理48 h后PASMCs的增殖明顯高于24 h (P<0.01)。

Fig. 1 The proliferation of rat PASMCs in hypoxia**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vshypoxic group 24 h

2.2 低氧對PASMCs凋亡的影響

FITC-Annexin V/PI染色檢測結(jié)果顯示，常氧組PASMCs的凋亡率為6.68%±0.97%, 低氧24 h和48 h培養(yǎng)的PASMCs的凋亡細(xì)胞數(shù)和常氧組凋亡率分別為7.54%±0.72%和6.58%±1.13 %，各組凋亡率均在10%以內(nèi)(圖2)，各組之間的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示低氧條件下PASMCs的凋亡率相比常氧無明顯增加。

Fig. 2 Apoptosis of rat PASMCs in hypoxia A: Normal group; B: Hypoxic group 24 h; C: Hypoxic group 48 h

2.3 低氧PASMCs PKCα、c-fos表達(dá)的改變

PASMCs細(xì)胞經(jīng)低氧處理特定的時間后，PKCα、c-fos mRNA(圖3A)和蛋白表達(dá)(圖3B)在24 h即有升高，48 h達(dá)高峰。如圖3C和圖3D所示，與β示actin比較，PKCα mRNA在常氧組、低氧24 h 和48 h的灰度值分別為: 0.19±0.01，0.54±0.04，0.71±0.03; c-fos mRNA在各組的灰度值分別為：0.20±0.01, 0.71±0.04, 0.93±0.07；PKCα蛋白在各組的灰度值分別為: 0.61±0.04，1.75±0.07，2.37±0.04; C-FOS蛋白在各組的灰度值分別為：0.69±0.02, 1.72±0.03, 2.54±0.15。這些結(jié)果證實PASMCs PKCα、c-fos在低氧條件下的表達(dá)呈時間依賴增強(qiáng)。

Fig. 3 Effects of hypoxia on the expressions of PKCα and c-fosin PASMCs A, B: The mRNA and protein expression of PKCα and c-fos in different groups; C, D: Relative mRNA and protein expression of PKCα, c-fos to β-actin; N: Normoxia group; H: Hypoxia group; H24: Hypoxia group 24 h; H48: Hypoxia for 48 h**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vshypoxic group 24 h

2.4 低氧PASMCs Bax、Bcl-2表達(dá)的改變

PASMCs細(xì)胞經(jīng)低氧處理24 h和48 h后，Bax mRNA和蛋白表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化，而Bcl-2 mRNA(圖4A)和蛋白表達(dá)增強(qiáng)(圖4B)。如圖4C和圖4D所示，與β-actin比較，bax mRNA在常氧組、低氧24 h 和48 h的灰度值分別為: 0.16±0.008，0.15±0.001，0.15±0.003; Bcl-2 mRNA在各組的灰度值分別為：0.15±0.01, 0.48±0.03, 0.85±0.07；Bax蛋白在各組的灰度值分別為: 0.53±0.05，0.55±0.06，0.52±0.04; Bcl-2蛋白在各組的灰度值分別為：1.73±0.07, 2.56±0.28, 3.65±0.23。這些結(jié)果證實Bcl-2在低氧條件下的表達(dá)呈時間依賴增強(qiáng)。

Fig. 4 Effects of hypoxia on the expressions of Bax and Bcl-2 in PASMCs A, B: The mRNA and protein expression of Bax, Bcl-2 in different groups; C, D: Relative mRNA and protein expression of Bax, Bcl-2 to β-actin; N: Normoxia group; H: Hypoxia group; H24: Hypoxia group 24 h; H48: Hypoxia for 48 h*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vshypoxic group 24 h

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，針對PASMCs增殖和凋亡失衡的分子靶向治療已成為HPH生物治療的最新發(fā)展方向[4]。盡管近十年來HPH的藥物治療取得了較大進(jìn)展，但目前尚缺乏特異性治療措施。因此，研究PASMCs增殖和凋亡失衡的分子基礎(chǔ)，是探討HPH、慢性肺源性心臟病及其他血管疾病發(fā)生機(jī)制的一個重要方向。本研究以低氧條件下PASMCs作為細(xì)胞模型，觀察低氧對PKCα、AP-1、Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響，為探討HPH的發(fā)病機(jī)制和治療策略奠定實驗基礎(chǔ)。

多個因子及信號通路參與HPH中PASMCs增殖和凋亡失衡。PKC屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，PKC亞型的表達(dá)和活性異常在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長、分化、凋亡、運動、腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等過程均起著重要作用[5,6]，研究證實活化的PKC促進(jìn)血管平滑肌的增生，在HPH發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本課題結(jié)果表明，低氧培養(yǎng)24 h和48 h PASMCs的PKCα基因和蛋白表達(dá)呈時間依賴性增強(qiáng)，提示PKCα的激活促進(jìn)低氧條件下PASMCs增殖。有關(guān)PKCα促PASMCs的分子機(jī)制，有研究表明，香煙煙霧提取物促進(jìn)PASMCs增殖，其機(jī)制與PKCα激活并促進(jìn)cyclin D1表達(dá)有關(guān)[7]，另有研究表明，PKC活化后可刺激原癌基因c-fos、sis等表達(dá)，而后者被激活后結(jié)合至cyclin D1啟動子區(qū)，誘導(dǎo)cyclin D1等的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其促增殖作用[8]。因此本課題進(jìn)一步檢測低氧條件下的c-fos表達(dá)變化。結(jié)果表明，低氧培養(yǎng)PASMCs 24 h和48 h后c-fos基因和蛋白表達(dá)呈時間依賴性地增強(qiáng)。以上結(jié)果提示低氧條件下的PASMCs PKCα/c-fos表達(dá)異常，但對于cyclin D1是否是其下游靶點仍需進(jìn)一步的實驗驗證。

PASMCs異常增殖同時是否伴有凋亡水平的改變，尚有很多爭論。Yu等的實驗研究發(fā)現(xiàn)，低氧刺激大鼠PASMCs增殖，同時抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肺血管重塑[9]。Luo等報道，低氧過程中，HIF-1α通過增強(qiáng)glycolysis活性，降低培養(yǎng)液的pH值，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡增加[10]。本研究結(jié)果表明，低氧24 h和48 h對PASMCs的凋亡率影響不明顯。進(jìn)一步對凋亡相關(guān)基因的檢測結(jié)果表明，相對于常氧組，低氧培養(yǎng)PASMCs24 h和48 h后Bax表達(dá)變化不明顯，而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)呈時間依賴性增多。Bcl-2和Bax的比例上調(diào)是誘發(fā)PASMCs增殖的重要因素。綜合以上結(jié)果表明，低氧條件下PASMCs的增殖和凋亡失衡，而PKCα/c-fos及Bcl-2表達(dá)的改變可能是其原因之一。

結(jié)合本研究的實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，低氧條件下增殖凋亡相關(guān)基因的改變可能是造成PASMCs增殖和凋亡的失衡、PVSR的主要原因。因此，以特定的增殖凋亡相關(guān)基因為靶點，抑制PASMCs的異常增殖，誘導(dǎo)其凋亡，無疑是改善PVSR、治療HPH的有效方法。

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Effects of PKCα/c-fos, Bax/Bcl-2 expression on the proliferation and apoptosis of rat pulmonary arterial smooth muscle cells in hypoxia

CAO Yan-hong1, PAN Jian-xun1, LIANG Yue-qin2, SHI Rui-zan2△

(1. Datong the Fifth People's Hospital, Datong 037000; 2. Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective: To explore the effects of PKCα/c-fos, Bax/Bcl-2 on the proliferation and apoptosis of rat pulmonary arterial smooth musclecells(PASMCs) in hypoxia． Methods: The PASMCs of rats had been isolated and cultured, and then were cultured under normoxia(5%CO2、21%O2、74%N2)and hypoxia(5%CO2，2% O2，93%N2)condition for 24 h and 48 h, respectively．The proliferation of PASMCs was tested by methylthiazolyltetrazolium (MTT)． The changes of PASMCs apoptosis were detected by Annexin V-FITC/PI staining combined flow cytometry. RT-PCR and Western blot analysis were performed to detect the gene and protein levels of PKCα/c-fos, Bax/Bcl-2, respectively. All experiments were repeated three times with at least triplicate samples. Results: The proliferation of PASMCs in hypoxia group were stronger than that of normoxia group after 24 h and 48 h (P<0.01), while the apoptosis rate did not change significantly．Meanwhile, the higher levels of PKCα, c-fos, Bcl-2 mRNA and proteins after hypoxia for 24 h and 48 h were detected by RT-PCR and Western blot analysis, while the expression levels of Bax had no significant difference under normoxic and hypoxic conditions. Conclusion: Elevated proliferation and expression of PKCα, c-fos, Bcl-2 was observed in rat PASMCs in hypoxia, and while the apoptosis rate had no significant change.

PKCα/c-fos; Bax/Bcl-2; proliferation; apoptosis; hypoxia

山西省青年科技研究基金資助項目(2014021038-3)；山西醫(yī)科大學(xué)校科技創(chuàng)新基金資助項目(01201308)；山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金資助項目(B032001207)

2016-03-28

2016-12-07

R563. 9

A

1000-6834(2017)03-218-05

10.12047/j.cjap.5442.2017.054

△【通訊作者】Tel: 0351-4135079; E-mail: shiruizan@163.com