余 意， 黃 楠， 張瑞嶺， 萬為滔， 胡一文△

(1. 武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院精神科， 湖北 武漢 430064； 2. 中國人民解放軍武漢總醫(yī)院， 湖北 武漢 430070；3. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

?

酒精依賴大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白結(jié)合蛋白的表達(dá)變化*

余 意1， 黃 楠2， 張瑞嶺3， 萬為滔1， 胡一文1△

(1. 武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院精神科， 湖北 武漢 430064； 2. 中國人民解放軍武漢總醫(yī)院， 湖北 武漢 430070；3. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的：研究長期酒精暴露對大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白結(jié)合蛋白cofilin表達(dá)的影響。方法：雄性SD大鼠24只，隨機(jī)等分為慢性酒精暴露1月組(E1組)和2月組(E2組)，各飲酒組均設(shè)對照組(C1組、C2組)，每組大鼠6只。參照文獻(xiàn)制作實驗動物模型，給慢性酒精暴露組大鼠自由飲含低濃度乙醇(體積分?jǐn)?shù)為6%)的水溶液，對照組大鼠正常飲自來水。撤除酒精后6 h進(jìn)行戒斷癥狀評分，并分別處死各組大鼠取腦組織。采用免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)cofilin蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：飲酒組大鼠撤除酒精后出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀。在前額皮質(zhì)區(qū)，E1組大鼠cofilin表達(dá)水平較C1組顯著升高(P<0.05)，E2組大鼠cofilin表達(dá)水平較C2組顯著升高(P<0.01)；在大鼠海馬CA1區(qū)，E1組cofilin表達(dá)水平較C1組顯著升高(P<0.05)，E2組cofilin表達(dá)水平較C2組相比無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論：長期酒精暴露可導(dǎo)致大鼠前額皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)肌動蛋白結(jié)合蛋白的表達(dá)變化。

酒精依賴；突觸可塑性；肌動蛋白結(jié)合蛋白

ethanol dependence； synaptic plasticity； cofilin

長期大量飲酒可使部分個體產(chǎn)生酒精依賴，表現(xiàn)為對酒精的耐受，強(qiáng)烈的渴求，以及中斷飲酒后出現(xiàn)戒斷癥狀，并伴有明顯的社會和職業(yè)功能損害。目前研究表明，突觸可塑性在酒精成癮中扮演了重要角色[1-3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)突

觸位于神經(jīng)元的樹突和樹突棘部位，這些結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是大腦突觸可塑性的主要位點[4]。目前已證實樹突棘形態(tài)動力學(xué)是由肌動蛋白動態(tài)調(diào)節(jié)的，肌動蛋白在棘突形態(tài)形成中發(fā)揮重要作用[5，6]。Cofilin是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的肌動蛋白結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)肌動蛋白動力學(xué)[7]。

研究發(fā)現(xiàn)肌動蛋白細(xì)胞骨架的適當(dāng)調(diào)節(jié)是酒精細(xì)胞和行為反應(yīng)的關(guān)鍵因素[8]。Shibasaki等也證實酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化至少部分地通過肌動蛋白的動態(tài)變化所調(diào)節(jié)[9]。細(xì)胞骨架肌動蛋白可能是神經(jīng)元重要的酒精作用靶點，酒精誘導(dǎo)的樹突棘形態(tài)和數(shù)量改變的機(jī)制是細(xì)胞骨架完整性的改變，這些變化背后的機(jī)制仍未闡明[10，11]。

本研究擬從影響神經(jīng)元形態(tài)和功能的細(xì)胞骨架肌動蛋白入手，采用動物行為學(xué)、免疫組織化學(xué)等方法，研究大鼠酒精作用不同時程及不同腦區(qū)肌動蛋白結(jié)合蛋白cofilin的表達(dá)變化，探討肌動蛋白結(jié)合蛋白在酒精誘導(dǎo)的神經(jīng)元突觸可塑中的作用，進(jìn)一步深化酒精成癮的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量120～160 g，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心，SPF級(許可證號：scxk(豫)2010-0002)。

1.2 藥品與試劑

兔抗鼠cofilin多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純試劑。

1.3 大鼠酒精依賴模型的建立及實驗分組

將大鼠飼養(yǎng)在一間安靜房間的籠子里，自然光照，室溫控制在18℃～24℃。參照文獻(xiàn)[12]將實驗組大鼠的飲水換成含6% (v/v)乙醇的水溶液，作為飲水的唯一來源， 24 h自由飲水，自由進(jìn)食，每天9: 00配制酒精水溶液，置換。對照組大鼠正常飲自來水，自由進(jìn)食，每天9: 00更換飲水。實驗分為4組：(1)慢性酒精暴露1月組(E1組)；(2)對照1月組(C1組)；(3)慢性酒精暴露2月組(E2組)；(4)對照2月組(C2組)，每組大鼠6只。分別取材制備相應(yīng)的組織樣品。

1.4 酒精戒斷癥狀的觀察

參照Erden等[13]方法，觀察大鼠撤除酒精后的戒斷癥狀。大鼠飲酒1月和2月，在停飲后6 h對大鼠進(jìn)行行為體征和聽源性癲癇發(fā)作評分。

1.5 免疫組織化學(xué)

在選定的時間用10%水合氯醛麻醉處死大鼠，經(jīng)生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注，取腦，修塊，于固定液后固定6 h。經(jīng)脫水、透明、浸蠟步驟制備石蠟塊，參照腦立體定位圖譜選取前額皮質(zhì)和海馬CA1部位切片，片厚5 μm。采用ABC法進(jìn)行免疫組化染色，cofilin抗體滴度均為1∶100，用PBS 代替一抗作陰性對照。陰性對照組均未染色，說明本實驗所檢測的cofilin免疫反應(yīng)陽性顆粒為特異性染色。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量圖片的平均光密度值，每只大鼠取相關(guān)部位5張切片的平均值為這只大鼠的數(shù)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

大鼠在飲酒期間較為溫順，不易激惹，攻擊性行為較少；酒精撤除后6 h，大鼠出現(xiàn)理毛、打噴嚏、易激惹、尾巴強(qiáng)直、低頭拱背、聽源性癲癇發(fā)作強(qiáng)度增加。其戒斷癥狀評分在酒精暴露1月組和酒精暴露2月組均顯著高于對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01, 表1)。說明長期酒精處理后，大鼠對酒精產(chǎn)生了軀體依賴。

GroupWithdrawalscoreCofilinexpression(prefrontalcortex)Cofilinexpression(hippocampalCA1)C12.83±0.750.3247±0.02100.3855±0.0227E111.83±1.47**0.3540±0.0240*0.4204±0.0248*C22.50±0.840.3268±0.02550.3834±0.0206E213.17±1.33##0.3787±0.0242##0.4016±0.0267

C1: Control group one months; C2: Control group two months; E1: Ethanol exposure one-month group; E2: Ethanol exposure two-month group

*P<0.05,**P<0.01vsC1;#P<0.05,##P<0.01vsC2

2.2 各組大鼠前額葉皮質(zhì)cofilin蛋白表達(dá)的變化

各組大鼠前額葉皮質(zhì)cofilin蛋白表達(dá)的平均光密度值見表1，平均光密度值的大小正比于cofilin表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照1月組相比，酒精暴露1月組cofilin蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。酒精暴露2月組較對照2月組相比，cofilin蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01, 表1，圖1，見彩圖頁Ⅱ)。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)cofilin蛋白表達(dá)的變化

各組大鼠海馬CA1區(qū)cofilin蛋白表達(dá)的平均光密度值見表1，平均光密度值的大小正比于cofilin表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照1月組相比，酒精暴露1月組cofilin蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。酒精暴露2月組較對照2月組相比，cofilin蛋白表達(dá)水平無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖2，見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

長期酒精使用可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的可塑性改變，突觸可塑性包括很多環(huán)節(jié)，其中樹突棘的形態(tài)學(xué)改變被認(rèn)為是促成各種刺激事件誘導(dǎo)的行為適應(yīng)性改變的重要基礎(chǔ)。目前已證實長期酒精暴露對樹突棘數(shù)量以及形態(tài)變化的影響，但具體的作用機(jī)制仍未闡明[14-16]。樹突棘形態(tài)動力學(xué)是由肌動蛋白動態(tài)調(diào)節(jié)的，肌動蛋白在棘突形態(tài)形成中發(fā)揮重要作用。Cofilin是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的肌動蛋白結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)肌動蛋白動力學(xué)。Cofilin的活性依賴于它的磷酸化狀態(tài)，其受各種激酶的調(diào)節(jié)。Ser3位點的磷酸化使cofilin蛋白失活，使其不能與肌動蛋白絲結(jié)合，從而提高肌動蛋白的穩(wěn)定性。因此，cofilin的磷酸化與否是肌動蛋白動態(tài)變化的開關(guān)。除了受磷酸化的調(diào)節(jié)之外，cofilin還與其它肌動蛋白結(jié)合蛋白發(fā)生相互作用，共同調(diào)節(jié)棘突的穩(wěn)定性[17]。因此，cofilin在樹突棘可塑性中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而該蛋白在酒精依賴形成過程中的表達(dá)變化，國內(nèi)外尚無報道。

本研究通過建立大鼠慢性酒精使用模型，選擇與酒精依賴以及學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切的腦區(qū)：前額葉皮質(zhì)與海馬，測定了酒精依賴形成過程中cofilin蛋白在上述腦區(qū)的表達(dá)變化。行為學(xué)結(jié)果顯示，大鼠長期飲酒撤除酒精后，出現(xiàn)嚴(yán)重的軀體戒斷癥狀，這與文獻(xiàn)報道的一致[12-13]，說明酒精依賴大鼠模型建立成功。本研究顯示長期酒精處理改變大鼠大腦神經(jīng)元cofilin蛋白的表達(dá)水平，但在酒精作用的不同時程以及不同腦區(qū)均有所不同。其中慢性酒精處理1月和2月大鼠的前額葉皮質(zhì)cofilin表達(dá)水平較對照組均顯著升高，大鼠慢性酒精處理1月海馬CA1區(qū)cofilin表達(dá)水平較對照組顯著升高，而在慢性酒精處理2月組則無顯著變化。提示慢性酒精處理改變大鼠一些腦區(qū)cofilin蛋白表達(dá)的水平，其變化與酒精作用時間的長短有一定的關(guān)系，同時在不同腦區(qū)也略有不同。本課題前期在成癮相關(guān)其他腦區(qū)的研究與此亦有所差異[18]。目前研究普遍認(rèn)為長期酒精使用對不同腦區(qū)突觸可塑性變化的影響具有明顯特異性，其中具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步實驗研究闡明。

研究證實cofilin與認(rèn)知功能以及學(xué)習(xí)記憶有著密切聯(lián)系[11,19]。也有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)cofilin磷酸化的重要蛋白激酶cdk5在慢性酒精中毒大鼠海馬區(qū)表達(dá)增加并導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶功能的下降[20，21]。前額葉皮質(zhì)是中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的重要組成部分，海馬與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切，同時它又是大腦內(nèi)對酒精敏感性較高的結(jié)構(gòu)之一，可以推測cofilin在前額皮質(zhì)及海馬區(qū)表達(dá)的異常可能與長期酒精暴露導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙有關(guān)。

總之，我們的研究證明長期酒精作用導(dǎo)致大鼠一些腦區(qū)肌動蛋白結(jié)合蛋白cofilin的表達(dá)變化，這種關(guān)鍵分子在調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)變化和突觸可塑性中具有重要作用，并可能參與對酒精依賴導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。我們的結(jié)果對進(jìn)一步闡明酒精依賴的分子生物學(xué)機(jī)制提供實驗依據(jù)。

[1] Bramham CR, Alme MN, Bittins M,etal. The Arc of synaptic memory [J].ExpBrainRes, 2010, 200(2): 125-140.

[2] Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory[J].AnnuRevNeurosci, 2006, 29: 565-598.

[3] Kalivas PW, O’Brien C. Drug addiction as a pathology of staged neuroplasticity[J].Neuropsychopharmacology, 2008, 33(1): 166-180.

[4] Gass JT, Olive MF. Neurochemical and neurostructural plasticity in alcoholism[J].ACSChemNeurosci, 2012, 3(7): 494-504.

[5] Ethell IM, Pasquale EB. Molecular mechanisms of dendritic spine development and remodeling[J].ProgNeurobiol, 2005, 75(3): 161-205．

[6] Robinson TE, Kolb B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse[J].Neuropharmacology, 2004, 47(suppl 1): 33-46．

[7] Des Marais V, Ghosh M, Eddy R,etal. Confilin takes the lead[J].JCellSci, 2005, 118(1): 19-26.

[8] Offenha user N, Castelletti D, Mapelli L,etal. Increased ethanol resistance and consumption in Eps8 knockout mice correlates with altered actin dynamics[J].Cell, 2006, 127(1): 213-226.

[9] Shibasaki M, Kurokawa K, Mizuno K. Actin dynamics in development of behavioral sensitization after withdrawal from long-term ethanol administration to mice[J].AlcoholClinExpRes, 2012, 36(8): 1385-1396.

[10]Pospelova TV, Pospelov VA. Latest progress in tyrosine kinase inhibitors [J].Oncotarget, 2014, 5(5): 1157-1161.

[11]Romero AM, Renau-Piqueras J, Pilar Marin M,etal. Chronic alcohol alters dendritic spine development in neurons in primary culture [J].NeurotoxRes, 2013, 24(4): 532-548.

[12]李 菁, 袁孝如, 李躍華, 等. 酒精依賴大鼠模型建立[J]. 中國藥物依賴性雜志, 2006, 15(6): 433-436.

[13]Erden BF, Ozdemirci S, Yildiran G,etal. Dextromethorphan attenuates ethanol withdrawal syndrome in rats[J].PharmacolBiochemBehav, 1999, 62(3): 537-541.

[14]Carpenter-Hyland EP, Chandler LJ. Homeostatic plasticity during alcohol exposure promotes enlargement of dendritic spines[J].EurJNeurosci, 2006, 24(12): 3496-3506.

[15]Carpenter-Hyland EP, Chandler LJ. Adaptive plasticity of NMDA receptors and dendritic spines: implications for enhanced vulnerability of the adolescent brain to alcohol addiction[J].PharmacolBiochemBehav, 2007, 86(2): 200-208.

[16]Zhou FC, Anthony B, Dunn KW,etal. Chronic alcohol drinking alters neuronal dendritic spines in the brain reward center nucleus accumbens[J].BrainRes, 2007, 1134(1): 148-161.

[17]Kojima N, Shirao T. Synaptic dysfunction and disruption of postsynaptic drebrin-actin complex: a study of neurological disorders accompanied by cognitive deficits[J].NeurosciRes, 2007, 58(1): 1-5．

[18]余 意, 韓金珠, 連陽陽, 等. 長期酒精暴露和戒斷后大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白結(jié)合蛋白、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶5的表達(dá)[J]. 中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志, 2014, 23(7): 587-590.

[19]Rust MB, Gurniak CB, Renner M,etal. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on confllin-mediated actin dynamics [J].EMBOJ, 2010, 29(11): 1889-1900.

[20]李新娟, 張 艷, 徐春陽, 等. 白藜蘆醇甙對慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬Cdk5激酶活性的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2015, 31(2): 117-120.

[21]李 爽, 徐春陽, 姜洪波, 等. 孕期引用酒精對子代大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬Cdk5表達(dá)的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2012, 28(1): 13-14.

武漢科技大學(xué)青年科技骨干培育計劃項目(2015X2024)

2016-01-13

2016-11-21

R749

A

1000-6834(2017)03-197-03

10.12047/j.cjap.5414.2017.050

△【通訊作者】Tel: 027-51228590; E-mail: hyw79818@163.com