王金丹， 黃茜茜， 葉璐璐， 范超凡， 郭剛強(qiáng)， 徐玲娟， 薛向陽， 盛秀勝

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)院, 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,3. 溫州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)教研室，分子病毒與疫苗研究所，熱帶醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325035；4. 金華市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科， 5. 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 金華 321017)

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趨化因子CXCL14在SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化分析*

王金丹1， 黃茜茜2， 葉璐璐3， 范超凡2， 郭剛強(qiáng)3， 徐玲娟4， 薛向陽3， 盛秀勝5△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)院, 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,3. 溫州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)教研室，分子病毒與疫苗研究所，熱帶醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325035；4. 金華市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科， 5. 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 金華 321017)

目的：分析趨化因子CXCL14在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化特征。方法：收集28例SLE患者和20名健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)標(biāo)本，抽提細(xì)胞中RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，以GAPDH為內(nèi)參，通過定量PCR檢測(cè)PBMC中CXCL14的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析CXCL14表達(dá)水平與SLE各種臨床資料的相關(guān)性，探討PBMC中CXCL14表達(dá)與SLE的關(guān)系，通過重亞硫酸鹽修飾的全基因組DNA用以BSP測(cè)序來明確不同標(biāo)本中CXCL14啟動(dòng)子中甲基化位點(diǎn)的甲基化率。結(jié)果：CXCL14在SLE患者和正常人PBMC中的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)。與健康人PBMC中CXCL14的含量相比較，CXCL14在SLE患者PBMC中表達(dá)量顯著降低。與進(jìn)一步CXCL14表達(dá)水平與SLE各種臨床資料的相關(guān)性分析顯示，CXCL14表達(dá)水平與SSB抗體(干燥綜合征B抗體)、蛋白尿及血小板計(jì)數(shù)相關(guān)。與SSB抗體陰性SLE患者比較，SSB抗體陽性患者CXCL14表達(dá)水平更低(P<0.05)；與蛋白尿陰性SLE患者相比，蛋白尿陽性患者CXCL14表達(dá)水平更低(P<0.05)；而血小板升高患者的CXCL14表達(dá)水平更高(P<0.05)。CXCL14表達(dá)水平與SLE活動(dòng)、腎損害指標(biāo)、抗ds-DNA、C反應(yīng)蛋白(CRP)、補(bǔ)體C3水平等指標(biāo)未見顯著相關(guān)性。CXCL14啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析顯示，SLE患者CpG島甲基化明顯高于正常對(duì)照。結(jié)論：PBMC中低表達(dá)的CXCL14與SLE發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其啟動(dòng)子區(qū)CpG島過度甲基化是SLE患者CXCL14低表達(dá)的重要機(jī)制。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；趨化因子；CXCL14；甲基化

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE) 是一種以多系統(tǒng)損害伴多種自身抗體形成為特征的自身免疫性疾病，其共同病理特征為炎癥細(xì)胞(特別是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞) 在受累組織或器官的浸潤。研究表明，趨化因子(chemokine)對(duì)特異白細(xì)胞的趨化和功能活化是啟動(dòng)與自身免疫反應(yīng)有關(guān)病變的關(guān)鍵步驟之一。CXC趨化因子配體14(chemokine CXC ligand 14，CXCL14)是CXC趨化因子家族的一員。作為ELR((Glu-Leu-Argmotifimmediately prior) )趨化因子家族中的一員，CXCL14具有抗血管生成，趨化自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞核和不成熟的樹突狀細(xì)胞等多種功能[1-5]。關(guān)于CXCL14表達(dá)與SLE關(guān)系迄今尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究分析SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CXCL14表達(dá)水平及其意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究共計(jì)收集自2011年3月至2012年5月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確認(rèn)收治確診的SLE患者28例，男4例，女24例，年齡18～45歲，平均(34.46±12.15)歲。其中所有SLE患者均進(jìn)行了常見臨床癥狀調(diào)查、常見檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定，并根據(jù)國際通用的SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)進(jìn)行評(píng)分[6]。另選取同一時(shí)期健康體檢者(均排除SLE及其他自身免疫性疾病)抗凝外周靜脈血標(biāo)本20例，男4例，女16例，年齡20～43歲，平均(33.16±11.22)歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)；抗核抗體譜印跡法檢測(cè)試劑盒(北京歐蒙公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green試劑(Toyobo公司)；DnaseⅠ、熱啟動(dòng)Hot start Taq酶及pMD19-T 載體(Takara公司)；TIANamp Genomic DNA Kit (上海天根)；DNA Methylation-Gold試劑盒(ZYMO公司)；引物、測(cè)序(上海生工公司)。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離

取新鮮靜脈采血的EDTA抗凝血(4 ml)，加等體積的生理鹽水，按淋巴細(xì)胞分離液說明書操作步

驟分離PBMC，PBS洗滌2次后，分成等量的2部分，一部分細(xì)胞加Trizol試劑用于RNA抽提，另一半的細(xì)胞-80℃凍存用于DNA抽提。

1.4 RNA及DNA的分離純化

總RNA的提取參照Trizol試劑說明書進(jìn)行。為去除殘留的DNA污染，抽提的總RNA以DnaseⅠ消化，再以氯仿-異丙醇提取，得到的RNA以DEPC水溶解?；蚪MDNA的抽提采用天根公司DNA抽提試劑盒進(jìn)行。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA和DNA濃度后，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 抗SSB抗體檢測(cè)

取新鮮靜脈血3 ml，取血清-80℃保存，用于自身抗體檢測(cè)。用免疫印跡法檢測(cè)抗SSB抗體，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作。

1.6 CXCL14表達(dá)的檢測(cè)

參照ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μl提取的RNA以O(shè)ligodT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：42℃ 60 min，75℃ 15 min，反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存。以15 μl反應(yīng)體系進(jìn)行real-time PCR。CXCL14特異前向引物為5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3'，特異反向引物為5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3'。內(nèi)參GAPDH特異前向引物為5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3'，特異反向引物為5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3'。反應(yīng)體系包括：1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，1×SYBR Green I MasterMix，0．5 μmol/L特異前向引物，0．5 μmol/L特異反向引物。反應(yīng)條件為：95℃ 2 min后，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。使用Bio-Rod CFX96儀器進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔。根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，采用相對(duì)定量法，以2-△Ct表示標(biāo)本中CXCL14相對(duì)表達(dá)量。

1.7 CXCL-14啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析

[7, 8]分析CxCL-14啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化，0.5 μg DNA通過EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒進(jìn)行亞硫酸鹽修飾后，以5'- GTTGTGGTATGGGTGTGTAAG-3'和5'-CRCCAAAAACCTCATACTAACC-3'為前向和反向引物，擴(kuò)增CxCL-14啟動(dòng)子區(qū)。50 μl反應(yīng)體系包括：0.5 μg DNA為模板，特異前向和反向引物各0．5 μmol/L，其他參考Hot start Taq酶說明書。反應(yīng)條件：94℃ 5 min后，94℃ 30 s，60℃ 1 min， 72℃ 1 min，35循環(huán)；最后72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物連接pMD19-T 載體，每份標(biāo)本挑5個(gè)克隆，進(jìn)行測(cè)序。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件分析。2組獨(dú)立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，3組及以上獨(dú)立樣本間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson 法。

2 結(jié)果

2.1 CXCL14在SLE患者和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平的檢測(cè)

SLE 患者單個(gè)核細(xì)胞中CXCL14 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用real-time PCR檢測(cè)其表達(dá)水平。結(jié)果如圖1A顯示：CXCL14及內(nèi)參GAPDH的定量PCR的溶解曲線為單峰，提示建立的熒光定量PCR方法可有效檢測(cè)標(biāo)本中CXCL14和GAPDH。據(jù)前述建立的方法，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)28例SLE患者、20例正常健康人PBMC中CXCL14表達(dá)水平。如圖1B所示，CXCL14在SLE患者和正常人的PBMC中的相對(duì)表達(dá)量并存在顯著差異(P=0.039)。在SLE患者的PBMC中，其CXCL14表達(dá)水平明顯下調(diào)。

Fig. 1 Down-regulation of CXCL14 in PBMCs from SLE patients A: Melt curve of CXCL14 and GAPDH detected by real-time quantitative PCR; B: Relative CXCL14 expression in PBMCs isolated from SLE patients and healthy controls

2.2 CXCL14表達(dá)水平與在SLE患者臨床特征相關(guān)性分析

如表1所示，分析PBMC中CXCL14的表達(dá)水平與SLE相關(guān)性抗體間關(guān)系發(fā)現(xiàn)，與抗SSB抗體陰性的SLE患者相比，抗SSB抗體陽性的SLE患者其PBMC中CXCL14的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；在對(duì)腎功能指標(biāo)進(jìn)行分析時(shí)，與蛋白尿陰性的SLE患者相比，蛋白尿陽性的患者體內(nèi)CXCL14的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。人PBMC中CXCL14 的表達(dá)水平(2-△C t值)與患者的性別、抗ds-DNA、C 反應(yīng)蛋白(CRP)、補(bǔ)體C3 水平等未見顯著差異。

2.3 CXCL14啟動(dòng)子區(qū)域甲基化分析

CXCL14啟動(dòng)子區(qū)域存在51個(gè)CpG島[7]。亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序結(jié)果顯示(圖2)，SLE患者的PBMC檢測(cè)到所有CpG島(100%)均可檢測(cè)到甲基化現(xiàn)象，CXCL14啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化平均覆蓋率達(dá)32.91%[470/(28×51)]，而正常對(duì)照PBMC檢測(cè)到39個(gè)CpG島(86.27%)存在甲基，甲基化平均覆蓋率為19.41%[198/(20×51)]，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步分析各CpG島甲基化發(fā)現(xiàn)，第2、4、6、8、9、21及23號(hào)CpG島的甲基化僅存在于SLE患者中，第3、7、12、15、16、24、26、27、30、31、32、41、42及43號(hào)CpG島的甲基化概率在SLE患者中也明顯增高(P<0.01)。

Tab. 1 Relationship between clinical indicators of SLE patients and CXCL14 expression in their PBMCs

ClinicalindicatorsGroupNCXCL14(2-△ct×104)PGenderFemale243.0530(1.9476,4.9984)0.115Male41.5980(1.4001,3.5585)Anti-ds-DNAantibodyPositive92.7089(2.5014,3.8576)0.382Negative183.1122(1.7692,4.9984)Anti-SSBantibodyPositive30.7995±0.46160.015Negative243.1122(1.9476,4.9984)ProteinuriaPositive94.9854(2.5339,6.0839)0.036Negative182.5144(1.6970,3.3390)CRP(mg/L)0～8112.9643(2.1034,4.1633)0.895>8142.2116(1.4345,5.1707)Platelets(109/L)100～300202.6182(1.7219,3.7654)0.049>30032.1482±1.2403

#CXCL14 expressions were presented as median (25th-75th percentile)

Fig. 2 Methylation level of 51 CpG islands in PBMCs from SLE patients and healthy controls A: Features of CXCL14 promoter region. : TATA-like sequence； : AP-1 binding sequence；□: CpG island. B： Methylation level of 51 CpG islands in PBMCs from SLE patients and healthy controls

3 討論

趨化因子根據(jù)多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)中N末端CYS(C)殘基和其他氨基酸(X)的排列位置趨化因子超家族可以分為4個(gè)亞類, 即CXC類、CC類、C類、CX3C類。它們能夠精確的調(diào)節(jié)和控制白細(xì)胞向炎癥組織的遷移，還可誘導(dǎo)細(xì)胞分化, 以維持組織細(xì)胞正常免疫功能的平衡。趨化因子高水平的持續(xù)不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá), 會(huì)使募集的白細(xì)胞大量增加形成破壞性的損傷。越來越多研究證實(shí)趨化因子及其受體參與SLE在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究表明,趨化因子CCL2、CCL5、CXCL12是發(fā)病機(jī)制過程中重要的炎性介質(zhì),它們分別通過與其相應(yīng)趨化因子受體CCR2、CCR5及CXCR4結(jié)合發(fā)揮作用[9,10]。在狼瘡腎炎病人的腎小球中浸潤的細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞, T 淋巴細(xì)胞很少, 而在組織間隙主要是T 淋巴細(xì)胞, 其次是巨噬細(xì)胞。Yamada M等[11]和Murata H 等[12]報(bào)道狼瘡性腎炎病人腎組織中主要以CD4+T 細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞為主, 并且這種CD4+T 細(xì)胞表達(dá)高水平的CCR4。王倩[13]的研究中證實(shí)了CXCL9，CXCL10，CXCL11與SLE具有相關(guān)性。

CXCL14(也稱為BRAK，Mip-2c，BMAC)，是一種CXC類趨化因子。它的基因位于5p31.1染色體上，并由77個(gè)氨基酸構(gòu)成。在生理方面，CXCL14扮演著自我平衡的作用，它能在表達(dá)于大腦、小腸、腎臟和上皮細(xì)胞，但是不在淋巴組織中表達(dá)。在炎癥中，CXCL14傾向于減少。然而，在炎細(xì)胞浸潤的腫瘤中它的表達(dá)反而增多。此外，CXCL14還具有抗血管生成，對(duì)自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、未成熟樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞等白細(xì)胞有強(qiáng)烈趨化作用并能增強(qiáng)各類細(xì)胞的生理功能，以致與很多疾病也存在相關(guān)性，如肝損、脂肪肝、免疫系統(tǒng)疾病、脫髓鞘疾病、黃斑退化癥、動(dòng)脈瘤等。研究發(fā)現(xiàn)，CXCL14在自身免疫性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液中過表達(dá)[14]，進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)CXCL14過表達(dá)可促進(jìn)自身免疫性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程，提示CXCL14可參與自身免疫性疾病進(jìn)程[15]。但CXCL14在SLE患者中的表達(dá)及意義目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。

SLE是一種全身性免疫系統(tǒng)紊亂的自身免疫性疾病，其外周血單個(gè)核細(xì)胞功能的變化是其免疫失調(diào)的重要特征。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL14在SLE的PBMC中表達(dá)水平明顯低于健康成人，首次證實(shí)CXCL14表達(dá)與SLE相關(guān)。另外。本研究還發(fā)現(xiàn)，CXCL14表達(dá)水平與SLE患者的SSB抗體及蛋白尿相關(guān)，SSB抗體及蛋白尿陽性SLE患者，CXCL14表達(dá)更低，但與其他多數(shù)SLE指標(biāo)未見顯著相關(guān)性。既往的研究普遍認(rèn)為，CXCL14在維持自我穩(wěn)定中發(fā)揮作用。其在SLE患者PBMC中的失調(diào)表達(dá)，也提示在CXCL14維持外周血免疫細(xì)胞間的平衡及功能中發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞有待于進(jìn)一步確定。

研究證實(shí)，多種免疫相關(guān)基因的DNA異常甲基化是SLE重要特征。CXCL14基因啟動(dòng)子區(qū)含一個(gè)非典型的TATA樣序列(TATTAA)、一個(gè)AP-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列、4個(gè) GC盒及 51個(gè)CpG島。在頭頸鱗癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中已報(bào)道CXCL14啟動(dòng)子區(qū)甲基化是其表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制[7, 8, 16, 17]。我們的研究顯示， SLE患者CXCL14基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化明顯高于正常對(duì)照，提示其啟動(dòng)子區(qū)CpG島過度甲基化是SLE患者PBMC中CXCL14低表達(dá)的重要機(jī)制。

綜上，目前對(duì)CXCL14與SLE 關(guān)系尚不明確，但本試驗(yàn)結(jié)果提示CXCL14在SLE 的發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用，探討CXCL14與SLE的關(guān)系，將有助于進(jìn)一步闡明SLE的發(fā)病機(jī)制。

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Expression and its promoter methylation of chemokine CXC ligand 14 in peripheral blood mononuclear cells from patients with lupus

WANG Jin-dan1, HUANG Qian-qian2, YE Lu-lu3, FAN Chao-fan2, GUO Gang-qiang3,XU Ling-juan4, XUE Xiang-yang3, SHENG Xiu-sheng5△

(1. School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035; 2. The Second Clinical College,Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035; 3. Department of Microbiology and Immunology, Institute of Molecular Virology and Immunology,Institute of Tropical Medicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035; 4. Department of Laboratory, Jinhua Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5. Medical School, Jinhua Polytechnic College, Jinhua 321000， China)

Objective: To analyze the expression and its promoter methylation of chemokine CXC ligand 14 (CXCL14) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods: The RNAs of PBMCs from 28 SLE patients and 20 healthy controls were isolated and reversely transcribed into cDNAs. Using GAPDH as the internal reference, the levels of CXCL14 expression were detected by real-time polymerase chain reaction (PCR). The correlation between CXCL14 expression and the clinic pathological features of SLE were further analyzed. DNA methylation was analyzed by bisulfite sequencing PCR (BSP). Results: Our data indicated that the level of CXCL14 in the PBMC of SLE patients was statistically lower than that in healthy controls (P<0.05). Further analysis showed that CXCL14 expression was negatively correlated with anti-Sj gren syndrome B antibody(anti-SSB antibody,P<0.01)and albuminuria(P<0.05). However, CXCL14 expression was not significantly correlated with the indexes of SLE activity, renal damage, the level of anti-ds-DNA antibodies, complement C3 and C-reactive protein. In addition, we further demonstrated that the CXCL14 promoter hypermethylation expression was significant higher than healthy controls. Conclusion: Down-regulated of CXCL14 expression in PBMC maybe involved in the occurrence or development of SLE disease. The loss of CXCL14 expression was regulated by promoter hypermethylation.

systemic lupus erythematosus(SLE); chemokine; CXCL14； methylation

浙江省科技廳科研基金資助項(xiàng)目(2012C33126)；浙江省大學(xué)生新苗計(jì)劃(2014R413058，2015R413027，2015R413069)；金華市科技局科研基金資助項(xiàng)目(2013-3-014)

2016-01-15

2016-11-29

R392.6

A

1000-6834(2017)03-197-05

10.12047/j.cjap.5415.2017.049

△【通訊作者】Tel： 0579-82232886； E-mail： shengsheng117@sina.com