張美玲

摘要按照《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》GB/T 6432—1994標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定豆粕中粗蛋白的含量，通過計(jì)算測(cè)量過程中的系統(tǒng)因素和隨機(jī)因素導(dǎo)致的不確定度，最終來評(píng)定豆粕中粗蛋白測(cè)定的不確定度。

關(guān)鍵詞豆粕；粗蛋白；不確定度

中圖分類號(hào)S816文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）26-0109-04

Evaluation of Uncertainty in Determination of Crude Protein in Soybean Meal

ZHANG Meiling

（China Certification & Inspection Group Shandong Test Co.，Ltd.， Qingdao，Shandong 266032）

AbstractThe content of crude protein in soybean meal was determined according to Determination Method of Crude Protein in Forage GB/T 6432—1994， and the uncertainty caused by random factors and system factors in the process of measurement was calculated，and the uncertainty of crude protein in soybean meal was finally evaluated.

Key wordsSoybean meal；Protein；Uncertainty

豆粕是食用油生產(chǎn)鏈下游產(chǎn)品，常被用于生產(chǎn)飼料，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值全面的原料。豆粕品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)有很多，其中最重要的就是粗蛋白含量。對(duì)豆粕中所含蛋白含量的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，既可以滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定[1]的能力要求，又可以在不確定度影響到對(duì)限度符合性判斷時(shí)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的不確定度判定。尤其是當(dāng)檢測(cè)值處于標(biāo)準(zhǔn)的臨界值時(shí)，計(jì)算不確定度一方面能檢查檢測(cè)工作是否存在差錯(cuò)，另一方面也能減輕檢測(cè)人員和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)，更利于檢測(cè)結(jié)論的判定。

測(cè)定豆粕中的粗蛋白含量大多采用凱氏定氮法。凱氏定氮法的原理[2]如下：使用強(qiáng)酸硫酸破壞有機(jī)物，加入催化劑，樣品中的含氮物被轉(zhuǎn)化為硫酸銨，使用強(qiáng)堿蒸餾使氨氣逸出，硼酸來吸收氨氣，吸收液被酸滴定，測(cè)出樣品的含氮量，乘以換算系數(shù)6.25，計(jì)算出粗蛋白含量。筆者按照《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》GB/T 6432—1994標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定豆粕中粗蛋白含量，通過計(jì)算測(cè)定過程中的系統(tǒng)因素和隨機(jī)因素導(dǎo)致的不確定度，最終來評(píng)定豆粕中粗蛋白測(cè)定的不確定度。

1試劑與儀器設(shè)備

1.1試劑

硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、40%氫氧化鈉溶液、甲基紅、2%硼酸溶液、溴甲酚綠混合指示劑、鹽酸、蔗糖，均為分析純。

1.2儀器設(shè)備

樣品篩（0.5 mm）；多功能粉碎機(jī)；50 mL酸式滴定管；電子天平（感量0.000 1 g）；250 mL錐形瓶；消煮爐；300mL消化管；自動(dòng)凱氏定氮儀。

2測(cè)定步驟與測(cè)定結(jié)果

2.1測(cè)定步驟

2.1.1消煮樣品。稱取0.5 g豆粕樣品（精確至0.000 2 g）放入消化管中；加入混合催化劑（0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀），加入硫酸12 mL，將消化管放到消化爐上消煮。先慢火，樣品小火焦化后，泡沫開始消失，再調(diào)高爐子溫度，分2個(gè)梯度升高到420 ℃，在420 ℃下消化1 h以上，直到消化液的顏色呈現(xiàn)透明的藍(lán)綠色，取出消化管，放在架子上冷卻，再加入30 mL蒸餾水。

2.1.2蒸餾氨。自動(dòng)定氮儀按照作業(yè)程序操作，將消化好的消化管放到蒸餾裝置上，錐形瓶中加入25 mL硼酸作為吸收液，加入混合指示劑2滴，向消煮管中加入50 mL氫氧化鈉溶液，蒸餾5 min，吸收液體積在120 mL左右，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，收集沖洗液，卸下錐形瓶。

2.1.3滴定。將吸收液用0.1 mol/L的鹽酸溶液滴定，滴定終點(diǎn)是藍(lán)綠色的試液變成灰紅色。

2.1.4測(cè)定空白。不稱量樣品，只稱量蔗糖0.5 g，其他步驟同豆粕樣品的操作步驟一致，消耗約0.2 mL 0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，否則，查找原因，重新補(bǔ)測(cè)。

2.2測(cè)定結(jié)果

取待測(cè)樣品豆粕，分別獨(dú)立操作8次，檢測(cè)結(jié)果見表1。

3數(shù)學(xué)模型建立及不確定度來源分析

3.1數(shù)學(xué)模型建立

w（%）=（V-V0）×C×0.014 0×6.25×100/m（1）

式中，w為測(cè)得的粗蛋白含量（%）；

V為滴定試樣時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積（mL）；

V0為滴定空白時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積（mL）；

C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L）；

m為試樣質(zhì)量（g）；

0.014 0為每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)；

6.25為氮與蛋白質(zhì)換算的平均系數(shù)。

3.2不確定度分析來源

①鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；

②樣品的制備過程；

③樣品中粗蛋白含量的測(cè)定；

④A類不確定度——重復(fù)性測(cè)量帶來的不確定度。

4不確定度分量計(jì)算

4.1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度

4.1.1數(shù)學(xué)模型的建立。

按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)溶液程序配制鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，2個(gè)人對(duì)其濃度進(jìn)行標(biāo)定，列出數(shù)學(xué)公式：

c（HCl）=m×w0×2×1 000/（V1-V2）×M（2）

式中，c（HCl）表示標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的濃度（mol/L）；

m表示基準(zhǔn)物質(zhì)無水碳酸鈉的質(zhì)量（g）；

V1表示鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定量（mL）；

V2表示空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的量（mL）；

w0表示基準(zhǔn)物質(zhì)無水碳酸鈉純度（g/g）；

1 000為換算系數(shù)，由mL轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)；

2為Na+參加反應(yīng)的個(gè)數(shù)；M表示基準(zhǔn)物質(zhì)無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量，為105.988 g/mol。

4.1.2不確定度的來源分析。

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度主要有5個(gè)不確定度來源[3]，包括重復(fù)性測(cè)量、無水碳酸鈉的稱重、碳酸鈉的摩爾質(zhì)量、滴定體積、最終濃度的數(shù)值修約。

4.1.3計(jì)算不確定度。

4.1.3.12人重復(fù)性標(biāo)定鹽酸產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

用精密天平稱量0.2 g無水碳酸鈉，置于270～300 ℃高溫爐中灼燒2 h，加入50 mL水溶解，加入甲基紅-溴甲酚綠指示劑5滴，用配制的鹽酸溶液滴定碳酸鈉，溶液由綠色變?yōu)榘导t色，即為滴定終點(diǎn)，2 min內(nèi)煮沸，用涼水立即冷卻，繼續(xù)滴定至溶液再度呈現(xiàn)暗紅色。同時(shí)，測(cè)定2個(gè)空白。2人標(biāo)定鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的結(jié)果見表2。

表2中的計(jì)算結(jié)果屬于A類重復(fù)性測(cè)量不確定度[4]。計(jì)算單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差采用貝塞爾公式計(jì)算（n=8），

則：u（x）=Sx=sn=9.91×10-5（mol/L），μ（x）=n-1=7。

4.1.3.2基準(zhǔn)物質(zhì)無水碳酸鈉帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

4.1.3.2.1試劑純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（p）。

基準(zhǔn)碳物質(zhì)酸鈉的純度為（100.00±0.05）%，可認(rèn)同為矩形分布（K=3），μ=∞。

u（p）=0.000 5/K=0.000 5/=0.000 288 7（g），μ（p）=∞

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（%）=u（p）p=u（p）100%=0.000 288 7

4.1.3.2.2稱量帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（m）[5]。

干燥器與天平稱量倉(cāng)內(nèi)均放置同質(zhì)硅膠，可認(rèn)為濕度相同，稱量時(shí)不會(huì)吸潮。天平稱量允差為±0.1 mg（查閱電子天平檢定證書）；視為矩形分布（K=3），μ=∞。

u（m）=0.000 1/K=5.77×10-5（g），μ（m）=∞

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（%）=u（m）m=u（m）0.199 8=2.89×10-4

4.1.3.2.3基準(zhǔn)物質(zhì)無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

基準(zhǔn)無水碳酸鈉摩爾質(zhì)量產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度不大，可以忽略。

4.1.3.2.4滴定體積帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（v）。

（1）滴定管校準(zhǔn)帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

50 mL酸式滴定管（A級(jí)），相對(duì)允許誤差為±0.05 mL（查閱校準(zhǔn)證書），按照矩形分布（K=3），μ=∞。

u（V1）= u1（V2）=0.05/K=0.028 9 mL，μ（v）=∞

（2）溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（v1）。

試驗(yàn)在控溫設(shè)備條件下進(jìn)行，設(shè)室溫變化范圍為（20±3）℃。滴定管的體積變化小于液體體積變化，V1=37.64 mL，V2=0.02 mL，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，依照矩形分布（K=3），μ=∞。

u2（V1）=3×2.1×10-4×V/K=3×2.1×10-4×37.64/3=0.013 7（mL），μ（v1）=∞

u2（V2）=3×2.1×10-4×V/K=3×2.1×10-4×0.02/3=7.27×10-5（mL），μ（v2）=∞

（3）滴定體積合成不確定度分量。

u（V1）2=u1（V1）2+u2（V1）2，u（V1）=0.028 92+0.013 72=3.20×10-2（mL）

u（V2）2=u1（V2）2+u2（V2）2，u（V2）=0.028 92+0.000 007 272=2.90×10-2（mL）

u（V1-V2）=0.0322+0.0292=4.32×10-2（mL）

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（%）=u（v1-v2）v1-v2=u（v1-v2）37.64-0.02= 1.15×10-3

4.1.3.3鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的數(shù)值修帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2人進(jìn)行試驗(yàn)，每人做4個(gè)平行，測(cè)定的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度值為0.100 2 mol/L，按照均勻分布處理，K=3，屬于 B類評(píng)定，因此其標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的修約的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 u（r）為：

u（r）=aK=0.000 1/23=2.89×10-5 （mol/L）

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（%）=u（r）c=2.88×10-4

4.1.3.4鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度。

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度分量分析結(jié)果見表3。

4.1.3.5鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值的B類相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算。

標(biāo)定體積、測(cè)量的重復(fù)性、基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉質(zhì)量等不確定度相互獨(dú)立，故應(yīng)將上述數(shù)據(jù)合成，得到鹽酸的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

UB（c）=[u（m）m]2+[u（p）p]2+[u（v1-v2）v1-v2]2+[u（r）r]2=

1.25×10-3

4.1.3.6鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值的不確定度U（c）（A類+B類）。

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值的不確定度U（c）為：

U（c）= uA（c）2+uB（c）2=

0.000 9912×0.100 22+0.001 252×0.100 2=

0.000 159 8（mol/L）

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的相對(duì)不確定度為：

U（c）rep=0.000 159 8/0.100 2=0.001 6

4.2樣品制備不確定度的評(píng)定

試驗(yàn)采用的樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過0.5 mm的篩網(wǎng)，再次混合均勻，取樣。因此，樣品不均勻產(chǎn)生的不確定度，可以忽略。

4.3樣品中粗蛋白含量測(cè)定不確定度的評(píng)定

4.3.1樣品稱量的不確定度。

稱量所用精密天平（萬分之一），型號(hào)為AB-204N；

電子天平檢定證書中天平稱量允許誤差為±0.1 mg；視為矩形分布（k=3），進(jìn)行B類不確定度評(píng)定，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u（mr）=0.000 13=5.774×10-5

則稱量的相對(duì)不確定度為：

ur（mr）= u（mr）/0.503 2=0.000 114 7

4.3.2滴定的不確定度評(píng)定。

4.3.2.1

50 mL酸式滴定管帶入的不確定度。

50 mL酸式滴定管，按照矩形分布（k=3），按照檢定規(guī)程，相對(duì)允許誤差為±0.05 mL，對(duì)其進(jìn)行B類不確定度的評(píng)定，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u（Vr）=0.053=0.028 87

則消耗鹽酸體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

ur（Vr）= u（Vr）/27.22=0.001 061

4.3.2.2溫度對(duì)滴定結(jié)果的不確定度影響。

滴定室實(shí)際測(cè)定溫度為（20±3）℃，滴定管的體積變化小于液體體積變化，Va=27.22 mL，Va0=0.10 mL，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，單位體積產(chǎn)生的變化為±（1×2.1×10-4×3）mL=6.3×10-4 mL。

u（V）=27.22×6.3×10-4 mL/3=0.009 901 mL

u0（V0）=0.10×6.3×10-4mL/3=0.000 036 37 mL

合成滴定體積的不確定度分量：

u（V）2= u（Vr）2+ u（V）2

u（V）=0.030 5（mL）

u（V0）2= u（Vr）2+ u0（V0）2

u（V0）=0.028 9（mL）

溫度對(duì)滴定結(jié)果產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u（V-V0）2=u（V）2+u（V0）2

u（V-V0）= 0.042 0（mL）

則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度=0.042 027.22-0.10=0.001 549

4.3.2.3滴定終點(diǎn)對(duì)滴定結(jié)果的不確定度影響。

該試驗(yàn)中判斷終點(diǎn)的指示劑是甲基紅-溴甲酚綠。在滴定過程中，滴定終點(diǎn)為灰紅色，pH為4.2～6.3。研究表明，實(shí)際滴定時(shí)會(huì)多消耗一定量的標(biāo)準(zhǔn)滴定液，其不確定度為0.004 mL，肉眼判斷終點(diǎn)滯后，不確定度為0.03 mL。此次滴定平均消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液27.22 mL。

合成不確定度為：

u（Dr）=0.0042+0.032=0.030 27（mL）

相對(duì)合成不確定度為：

ur（Dr）= u（Dr）/27.22=0.001 112

4.3.2.4滴定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度[6]。

u=u（Vr）2+u（V-V0）2+u（Dr）2=

0.028 872+0.042 02+0.030 272=0.059 28 mL

4.3.2.5滴定的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

u3=u/27.22=0.002 178

4.4重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果帶來的不確定度評(píng)定

在一致條件下，測(cè)定了8次豆粕中的粗蛋白含量，結(jié)果見表1，粗蛋白含量測(cè)定結(jié)果為47.25%。

測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

s=ni=1（wi-）2n-1=0.183 7

u（xi）=sn=0.064 95

測(cè)定結(jié)果的的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u（x）= u（xi）/47.25=0.001 375

4.5不確定度分量計(jì)算

不確定度分量計(jì)算結(jié)果見表4。

5結(jié)語

建立數(shù)學(xué)等式，計(jì)算系統(tǒng)因素和隨機(jī)因素和帶入的測(cè)量不確定度分量，找出豆粕粗蛋白測(cè)定的不確定度分量主要來源于4個(gè)分量：包括重復(fù)性測(cè)量的A類評(píng)定、天平稱重、消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的B類評(píng)定，通過數(shù)值大小比較得出標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度影響最大，分量滴定標(biāo)準(zhǔn)溶液體積次之。因此，在標(biāo)定鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，稱量基準(zhǔn)工作試劑的質(zhì)量小于等于0.5 g時(shí)，要用十萬分之一分析天平，需2人進(jìn)行試驗(yàn)，每人分別做4個(gè)平行，其標(biāo)定結(jié)果的相對(duì)極差不得大于相對(duì)重復(fù)性臨界極差，8個(gè)平行標(biāo)定結(jié)果的相對(duì)極差不得大于相對(duì)重復(fù)性臨界極差。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的溫度不是20 ℃時(shí)，應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積進(jìn)行補(bǔ)正。在實(shí)際工作中，要注意以上關(guān)鍵操作點(diǎn)，降低檢測(cè)過程中產(chǎn)生的不確定度值。

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