呂曉業(yè)，王健，李昕宇，黃芳，王芃，周建光，李山虎，衛(wèi)勃

1.解放軍總醫(yī)院 普外科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；

3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北 十堰 442000；

EphA3促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC823的增殖

呂曉業(yè)1，王健2，李昕宇3，黃芳2，王芃2，周建光2，李山虎2，衛(wèi)勃1

1.解放軍總醫(yī)院 普外科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；

3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北 十堰 442000；

目的：初步探索EphA3與胃癌細(xì)胞BGC823增殖的關(guān)系。方法：用T4DNA連接酶將EphA3的全長cDNA片段連接到酶切后的慢病毒載體pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro中制備慢病毒，感染胃癌BGC823細(xì)胞建立過表達(dá)EphA3細(xì)胞系，Western印跡檢測目的蛋白的表達(dá)，CCK8細(xì)胞生長實驗和裸鼠成瘤實驗檢測EphA3對BGC823細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：雙酶切鑒定與基因測序表明過表達(dá)EphA3慢病毒載體構(gòu)建成功；Western印跡表明建立了過表達(dá)EphA3的BGC823細(xì)胞系，高表達(dá)EphA3對BGC823細(xì)胞的增殖和成瘤后生長有明顯的促進(jìn)作用。結(jié)論：EphA3促進(jìn)BGC823胃癌細(xì)胞增殖，為胃癌的靶向性治療及個性化治療提供了線索。

EphA3；胃癌；BGC823細(xì)胞

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一，其致死率排在各種癌癥的第2位，且5年平均生存率不足30%[1-2]。胃癌目前仍難以治愈，主要原因是大多數(shù)病人確診時已處于晚期或發(fā)生了轉(zhuǎn)移，術(shù)后往往因復(fù)發(fā)而導(dǎo)致死亡，因而需要進(jìn)一步探索更加有效的治療方法[3]。目前分子靶向性治療日益受到研究者的重視，其中受體酪氨酸激酶家族中的Eph分子在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其作為治療靶點的前景逐漸受到關(guān)注。根據(jù)其序列的相似性及結(jié)合特異性，受體Ephs分子與配體Ephrins分子可分為A和B兩類[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)Ephs和Ephrins經(jīng)常在腫瘤細(xì)胞與組織中表達(dá)失調(diào)，且在不同類型腫瘤中Ephs具有促進(jìn)腫瘤形成或抑制腫瘤發(fā)生的功能[6-7]。EphA3最早由Boyd發(fā)現(xiàn)，是首個被克隆的Eph受體家族分子，其鑒定與分離過程提示EphA3可能與其家族中其他受體分子一樣，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮功能[8]。我們探討了過表達(dá)EphA3對胃癌細(xì)胞增殖的影響，期盼為胃癌的靶向性治療提供相關(guān)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c-裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；293T和BGC823細(xì)胞為本實驗室保存；慢病毒載體pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro為金蕊博士惠贈；包裝載體psPAX2和pMD2.G購自Addgene公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司；T4DNA連接酶、BamHⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR回收試劑盒及膠回收試劑盒購自康寧生命科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；γ-Tubulin、p-AKT、AKT、ERK1/2、p-ERK1/2和EphA3抗體購自Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG抗體購自中杉金橋公司；轉(zhuǎn)染試劑PEI為本實驗室保存；Cell Counting Kit 8試劑盒購自東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃、5%的CO2孵箱中，用含10%胎牛血清、1%雙抗（50 U/mL氨芐西林、100 U/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T和BGC823細(xì)胞。

1.3 過表達(dá)EphA3的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)基因序列設(shè)計擴(kuò)增EphA3全長cDNA的上、下游引物EphA3-F（5'-ACGGATCCATGGATT GTCAGCTCTCCATC-3'）和EphA3-R（5'-GCGCGG CCGCCACGGGAACTGGGCCATTC-3'），以本室保存的pCDNA-EphA3為模板，PCR擴(kuò)增得到EphA3的cDNA全長，用BamHⅠ和NotⅠ酶切后連接到慢病毒載體pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中擴(kuò)增，挑取克隆，用含氨芐西林的LB培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，陽性克隆測序。

1.4 慢病毒載體的包裝

轉(zhuǎn)染前1 d將293T細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種量控制在60%～70%，轉(zhuǎn)染前2 h更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液。按轉(zhuǎn)染試劑說明書將慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G和過表達(dá)EphA3慢病毒質(zhì)粒pCDH-EF1-EphA3-T2APuro按3∶1∶2的比例和轉(zhuǎn)染試劑PEI分別用DMEM按1μg∶1μL的比例稀釋，靜置5 min后混合，再次靜置30 min后滴入293T細(xì)胞，用同樣方法轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒，12 h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液，48 h后收取病毒上清過濾，將分裝后的病毒液放置于-80℃保存。

1.5 病毒感染BGC823細(xì)胞

感染前1 d將BGC823細(xì)胞接種到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種量控制在60%～70%，感染時將5 mL病毒上清、5 mL培養(yǎng)液和10μL濃度為10 ng/mL的聚凝胺（polybrene）混勻后滴入BGC823細(xì)胞，12 h后更換培養(yǎng)液，48 h用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)EphA3的細(xì)胞。

1.6 Western印跡檢測

收集蛋白樣品并加入5×SDS緩存液，煮沸10 min后行SDS-PAGE，再濕轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜上，用5%BSA室溫封閉30 min，4℃孵育稀釋的一抗搖床過夜，用TBST洗膜液洗膜3次，每次7 min，室溫孵育稀釋的二抗6 h，之后用TBST洗膜3次，每次7 min，滴加發(fā)光液后在暗室顯影、定影。

1.7 CCK8細(xì)胞增殖實驗

將過表達(dá)EphA3的BGC823和對照細(xì)胞接種至96孔板中，接種密度為1000/孔，重復(fù)3次，在不同時間加入Cell Counting Kit 8試劑，37℃靜置2 h后用酶標(biāo)儀檢測D450nm值，繪制生長曲線。

1.8 裸鼠成瘤實驗

將5×106個處于對數(shù)生長期過表達(dá)EphA3的BGC823細(xì)胞和對照細(xì)胞懸浮于200μL無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，分別接種于6～8周的BALB/ c雌鼠背部皮下，腫瘤形成后每隔1 d測量腫瘤的大小，計算腫瘤體積（長×寬×高×0.526）。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)EphA3慢病毒的構(gòu)建、鑒定

PCR擴(kuò)增得到EphA3全長cDNA序列，將其克隆連接到慢病毒表達(dá)載體pCDH-EF1-MCS-T2APuro上，挑選單克隆提取質(zhì)粒后用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定（圖1），得到約2.9 kb的片段，送公司測序，測序結(jié)果表明EphA3成功插入pCDHEF1-EphA3-T2A-Puro表達(dá)載體的BamHⅠ和NotⅠ酶切位點之間。

2.2 Western印跡檢測感染慢病毒后BGC823細(xì)胞中EphA3蛋白的水平

為了建立過表達(dá)EphA3的BGC823細(xì)胞系，通過慢病毒包裝系統(tǒng)和pCDH-EF1-EphA3-T2A-Puro共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得了含有EphA3表達(dá)載體的慢病毒顆粒，用病毒感染BGC823細(xì)胞并經(jīng)嘌呤霉素篩選后得到穩(wěn)定感染的細(xì)胞系。Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)EphA3蛋白表達(dá)水平顯著升高，說明EphA3慢病毒載體有效促進(jìn)了細(xì)胞中EphA3蛋白的表達(dá)（圖2）。另外還分析了過表達(dá)EphA3后細(xì)胞中2個重要的信號通路的活性，發(fā)現(xiàn)EphA3過表達(dá)沒有影響AKT激酶的活性，但顯著激活了ERK激酶的磷酸化水平，提示我們EphA3可能在促進(jìn)腫瘤的增殖上發(fā)揮重要作用。

圖1 表達(dá)EphA3質(zhì)粒的BamHⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定

2.3 生長曲線檢測過表達(dá)EphA3對BGC823細(xì)胞增殖的影響

為了探索EphA3對BGC823細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，用Cell Counting Kit 8試劑盒檢測過表達(dá)EphA3后對BGC823細(xì)胞生長的影響。與對照組相比，過表達(dá)EphA3的BGC823細(xì)胞生長明顯加快，說明在BGC823細(xì)胞中EphA3蛋白發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的作用（圖3）。

2.4 體內(nèi)試驗檢測過表達(dá)EphA3對腫瘤生長的促進(jìn)作用

為了了解EphA3在體內(nèi)對腫瘤增長的影響，將BGC823細(xì)胞與EphA3過表達(dá)后的BGC823細(xì)胞分別接種至裸鼠皮下，各重復(fù)3只，觀察腫瘤生長狀況。與對照組相比，過表達(dá)EphA3的BGC823細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤明顯大于對照組，說明EphA3能夠促進(jìn)小鼠體內(nèi)腫瘤生長（圖4）。

圖2 Western印跡檢測慢病毒感染后BGC823細(xì)胞EphA3蛋白表達(dá)

圖3 過表達(dá)EphA3對BGC823細(xì)胞增殖的影響

圖4 裸鼠成瘤試驗中，過表達(dá)EphA3能明顯促進(jìn)腫瘤生長

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是在環(huán)境因素與遺傳因子復(fù)雜的相互作用下導(dǎo)致的一個多步驟過程。大量研究證明胃癌與一些重要的癌基因、抑癌基因、DNA修復(fù)基因及細(xì)胞黏附分子的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)，但對這些改變與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系的了解仍然有限[9-10]。深入研究胃癌相關(guān)基因的生物學(xué)功能，將為了解胃癌的發(fā)病機制、診斷和選擇靶向性治療策略提供新的線索。研究發(fā)現(xiàn)EphA3往往在正常組織中限制性表達(dá)或低表達(dá)，在腫瘤組織中高表達(dá)或發(fā)生突變，可能參與腫瘤的增殖、遷移和血管形成等功能[11-12]。EphA3在胃癌發(fā)生發(fā)展中是否具有重要作用，相關(guān)研究并不深入。Xi等報道EphA3在胃癌腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤大小、組織分化、侵襲與轉(zhuǎn)移能力等有關(guān)，還發(fā)現(xiàn)EphA3的表達(dá)和血管內(nèi)皮生長因子及微血管密度的表達(dá)水平正相關(guān)，提示我們EphA3的功能可能和腫瘤中的血管形成有關(guān)[13]。在此基礎(chǔ)上，我們建立了高表達(dá)EphA3的胃癌細(xì)胞系，初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EphA3在BGC823細(xì)胞中的表達(dá)改變能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖能力。我們的研究還表明EphA3參與調(diào)控細(xì)胞中的重要信號通路，如MAPK/ERK信號通路的活性，而該信號途徑往往在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。這一研究結(jié)果為我們了解EphA3在胃癌中發(fā)揮功能的分子機制，以及胃癌病人的分子靶向性治療及個性化治療方案提供了有益的基礎(chǔ)。

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EphA3 Promotes the Proliferation of Gastric Cancer Cell BGC823

LYU Xiao-Ye1,WANG Jian2,LI Xin-Yu3,HUANG Fang2,
WANG Peng2,ZHOU Jian-Guang2,LI Shan-Hu2*,Wei Bo1*

1.General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;
3.School of Biomedical Engineering,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000;China

*Co-corresponding authors,WEI Bo,E-mail:weibo@vip.163.com;LI Shan-Hu,E-mail:lishanhu6@163.com

Objective:To explore the function of EphA3 on cell proliferation in BGC823 cells.Methods:T4DNA ligase was used to ligate exogenous cDNA fragment of EphA3 into the pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro vector. The recombinant plasmid with lentivirus packaging plasmids was transfected into 293T cells lines and lentiviral particles were collected at different time.BGC823 cells were infected with lentiviral particles and expression of EphA3 was verified by Western blotting.Moreover,CCK8 test and xenograft assay in nude mice were used to examine the proliferation of the infected BGC823 cells with EphA3 overexpression.Results:Double enzyme digestion and gene sequencing proved that the construction of plasmid was successful.The lentiviral plasmid can upregulate the EphA3 protein level in BGC823 cells.EphA3 overexpression promotes gastric cancer BGC823 cells proliferationin vitroandin vivo.Conclusion:In BGC823 cells,EphA3 overexpression can promote tumor cell proliferation,and perhaps play an important role in gastric cancer development.

EphA3;gastric cancer;BGC823 cells

Q78;Q25

A

1009-0002（2017）03-0286-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.009

2017-02-17

國家自然科學(xué)基金（81372140，81372770，81470138）

呂曉業(yè)（1987-），男，碩士研究生；王健，（1971-），男，博士。兩者為共同第一作者

衛(wèi)勃，（E-mail）weibo@vip.163.com；李山虎，（E-mail）lishanhu6@163.com