鄭偉，郭曉華，董潔，李少華，丁紅梅，李慧，黃皚雪，夏偉，白琛俊，李達(dá)，耿介，李潔，邵寧生

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

miR-216b在體外培養(yǎng)細(xì)胞中加速長(zhǎng)非編碼RNA UCA1的降解

鄭偉，郭曉華，董潔，李少華，丁紅梅，李慧，黃皚雪，夏偉，白琛俊，李達(dá)，耿介，李潔，邵寧生

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

目的：探討長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）UCA1作為miR216b的“分子海綿”結(jié)合miR-216b后的命運(yùn)變化。方法：提取人HEK293T細(xì)胞基因組，以特異性引物PCR擴(kuò)增UCA1基因并克隆至pcDNA6.0b載體，用氨芐西林抗性篩選陽性克隆，重組質(zhì)粒pcDNA6-UCA1轉(zhuǎn)染HEK293T和HeLa細(xì)胞并鑒定其表達(dá)水平。向HEK293T和HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-216b類似物，同時(shí)用放線菌素D抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，收取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA并鑒定其完整性，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)UCA1的水平，測(cè)定其半衰期。pcDNA6-UCA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，轉(zhuǎn)染miR-216b類似物或miR-216b抑制劑，并使用放線菌素D抑制轉(zhuǎn)錄，收取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA，qRTPCR檢測(cè)UCA1半衰期。結(jié)果：構(gòu)建的pcDNA6-UCA1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)UCA1表達(dá)水平顯著提高；miR-216b能夠降低細(xì)胞內(nèi)源或外源過表達(dá)的UCA1穩(wěn)定性，加速UCA1的降解，顯著縮短其半衰期；使用miR-216b的抑制劑，UCA1的半衰期延長(zhǎng)。結(jié)論：miR-216b能夠加速lncRNA-UCA1的降解，為研究miRNA與lncRNA的相互作用提供了新的思路。

UCA1；長(zhǎng)非編碼RNA；miR-216b；降解

microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度為22 nt左右的非編碼小RNA，其可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與 mRNA的3'端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的剪切降解或抑制mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[1-3]。miRNA參與細(xì)胞分裂增殖、分化和機(jī)體發(fā)育及物質(zhì)代謝等多種極其重要的生物學(xué)過程[3]。迄今，已確定了超過3700個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的人成熟miRNA，并獲得了3494個(gè)新的前體，而且新發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量還在不斷上升，相信未來將會(huì)有更多的miRNA及其靶基因被鑒定出來[4]。

長(zhǎng)非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）指的是長(zhǎng)度大于200 nt，不編碼蛋白質(zhì)的一類非編碼RNA[5]。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)lncRNA能夠在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而通過多種機(jī)制發(fā)揮其生物學(xué)功能。已有研究報(bào)道顯示，lncRNA對(duì)細(xì)胞分化、遷移及增殖等過程的調(diào)控起到相當(dāng)重要的作用[6]。自lncRNA被發(fā)現(xiàn)可以作為miRNA的“分子海綿”后，它與miRNA之間的關(guān)系逐漸引起了人們較大的研究興趣。lncRNA能夠通過與互補(bǔ)miRNA結(jié)合，抑制后者對(duì)miRNA靶基因的沉默效應(yīng)，但lncRNA與互補(bǔ)miRNA結(jié)合后的自身命運(yùn)變化鮮有報(bào)道。

有報(bào)道，作為一種腫瘤抑制miRNA，miR-216b在咽喉癌和肝細(xì)胞肝癌中能夠起到抑癌作用。miR-216b能夠通過調(diào)控K-ras基因的表達(dá)，抑制鼻咽癌、肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，及細(xì)胞周期的阻滯[7-8]。

尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma associated 1，UCA1）最早是由Wang等在膀胱癌細(xì)胞中鑒定的高表達(dá)的lncRNA，并命名為UCA1[9]。研究發(fā)現(xiàn)，UAC1在膀胱癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、黑色素瘤和胰腺癌等多種惡性腫瘤中均有異常高表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)量低或不表達(dá)[10-15]，表明UAC1有成為腫瘤標(biāo)志物的可能性。此外，UCA1還被證明具有作為miR-216b的“分子海綿”的功能，通過與miR-216b結(jié)合，減弱miR-216b的功能，從而影響miR-216b的靶基因成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1），進(jìn)而調(diào)控FGFR1所參與的ERK信號(hào)通路[8]。

lncRNA-UCA1能夠通過與miR-216b結(jié)合，抑制miR-216b對(duì)靶基因的沉默效應(yīng)，但UCA1結(jié)合miR-216b之后的自身命運(yùn)變化尚無報(bào)道。我們通過構(gòu)建UCA1的過表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過轉(zhuǎn)染miR-216b mimic和miR-216b inhibitor，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了UCA1的半衰期，為進(jìn)一步研究UCA1與miR-216b相互作用的確切分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T和HeLa細(xì)胞株、pcDNA6.0b載體由本室保存；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；TRIzol試劑購自Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；dNTP、T4DNA連接酶、基因組提取試劑盒購自天根公司；RNA酶抑制劑、Phusion DNA擴(kuò)增酶、限制性內(nèi)切酶、切膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購自Thermo公司；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑SYBR Green mix購自Toyobo公司；瓊脂糖購自Lonza公司；Tris base和甘氨酸購自Novon公司；PCR引物、反轉(zhuǎn)錄引物和qPCR引物由上海生工公司合成；miR-216b mimic及對(duì)照、miR-216b inhibitor及對(duì)照由廣州銳博公司合成。

1.2 pcDNA6-UCA1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

提取HEK293T細(xì)胞的基因組，以其為模板，用上游引物UCA1-F1（5'-CGGAATTCGATCTCTC CTCTTCCTCCTGGAAGC-3'）和下游引物UCA1-R1（5'-CCGCTCGAGAGGAAGATTTCTTTTCTGTCACC T-3'）擴(kuò)增UCA1基因[6]。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性98℃ 30 s；變性98℃ 10 s，退火62℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖電泳后切膠回收，和載體pcDNA6.0b分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接目的基因與載體，16℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，挑選單克隆菌落接種于1 mL含50 mg/L氨芐西林的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6 h，菌液PCR鑒定克隆，將鑒定得到的陽性克隆送奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HEK293T細(xì)胞接種于12孔板中，24 h后取1μg pcDNA6、pcDNA6-UCA1質(zhì)粒稀釋于100 μL無血清 DMEM中，分別與含 3μL LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑的 100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基混合，室溫孵育20 min后加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)5 h后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

將生長(zhǎng)良好的HeLa細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞接種于12孔板中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h；按LipofectAMINE 2000說明書將50 pmol miR-216b mimic及對(duì)照分別稀釋于100μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，與含3μL LipofectAMINE 2000的100μL無血清DMEM培養(yǎng)基混合，室溫孵育20 min后加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)用終濃度為10μg/mL的放線菌素D抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，分別收取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA待檢測(cè)。

接種狀態(tài)良好的HEK293T和HeLa細(xì)胞于12孔板中并培養(yǎng)24 h，將0.5μg pcDNA6-UCA1稀釋于100μL無血清DMEM中，與含3μL LipofectAMINE 2000的100μL無血清DMEM培養(yǎng)基混勻，室溫孵育20 min后加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)5 h后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將50 pmol miR-216b mimic及對(duì)照或100 pmol miR-216b inhibitor及對(duì)照分別稀釋于100μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，與含3μL LipofectAMINE 2000的100μL無血清DMEM培養(yǎng)基混合，室溫孵育20 min，將混合液加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)用終濃度為10μg/mL的放線菌素D抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，收取細(xì)胞總RNA。

1.4 RNA提取及其完整性鑒定

按TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA后稀釋至1/50，在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)RNA的濃度以及D260mm/280mm值。取1μg RNA，用1%瓊脂糖電泳鑒定RNA的完整性。

1.5 細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄

取1μg細(xì)胞總RNA，加入1μL oligo（dT），用DEPC水補(bǔ)至13μL，混勻后70℃熱變性5 min，立即置于冰上退火，加入7μL混合物（5×MMLV緩沖液4μL，dNTP 2μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，RNase抑制劑0.5μL），42℃反應(yīng)90 min，95℃滅活酶5 min，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用Stratagene公司的Mx3000P qPCR儀檢測(cè)UCA1 mRNA水平。反應(yīng)體系包括1μL cDNA、1μL特異引物（表1）、2×qPCR SYBR Green mix 10μL、ddH2O 8μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 3 min，變性95℃ 15 s，退火56℃ 20 s，延伸72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。采集熔解曲線，用Mx3000P軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-UCA1含有miR-216b結(jié)合位點(diǎn)

用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示lncRNAUCA1含有miR-216b的潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖1），同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，螢光素酶實(shí)驗(yàn)顯示共轉(zhuǎn)染miR-216b和UCA1螢光素酶載體后，螢光素酶活性出現(xiàn)顯著抑制[8]。因此，UCA1能夠與miR-216b結(jié)合。

2.2 UCA1基因的PCR擴(kuò)增

以提取的HEK293T細(xì)胞基因組（圖2）為模板，用Phusion酶PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)得到目的片段，1%瓊脂糖電泳分析表明，得到的擴(kuò)增片段與預(yù)期1615 bp大小一致（圖3），用切膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncRNA-UCA1含有miR-216b結(jié)合位點(diǎn)

2.3 pcDNA6-UCA1表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

用EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)純化后的擴(kuò)增片段和pcDNA6.0b雙酶切，將酶切片段與酶切質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜，挑選單克隆，在含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，以菌液為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，電泳結(jié)果顯示2、4、5號(hào)菌液與預(yù)期相符（圖4）。將2、4、5號(hào)菌液送公司測(cè)序，序列與目的基因進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果無誤，表明目的基因已正確插入pcDNA6.0b表達(dá)載體，提取質(zhì)粒，載體可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 HEK293T細(xì)胞基因組電泳鑒定

圖3 UCA1 cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定

圖4 pcDNA6-UCA1克隆的PCR鑒定

2.4 HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA6-UCA1后UCA1水平顯著升高

為了驗(yàn)證pcDNA6-UCA1在細(xì)胞中的表達(dá)水平，分別將構(gòu)建的過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6-UCA1和pcDNA6.0b空載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)顯示細(xì)胞總RNA質(zhì)量良好（圖5）。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，相對(duì)于對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pcDNA6.0b），轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6-UCA1后，HEK293T細(xì)胞內(nèi)UCA1 RNA水平顯著升高（圖6）。

2.5 miR-216b加速細(xì)胞內(nèi)源lncRNA-UCA1的降解

在HEK293T和HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-216b mimic及對(duì)照，同時(shí)用放線菌素D抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，收取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（轉(zhuǎn)染后0、4、8 h）的細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖檢測(cè)顯示RNA完整性良好。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)照組與miR-216b mimic組HEK293T細(xì)胞（圖7）和HeLa細(xì)胞（圖8）各時(shí)間點(diǎn)的UCA1水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2種細(xì)胞中，相較于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-216 mimic組UCA1的半衰期明顯減短，UCA1的降解速率顯著增加，UCA1與miR-216b競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后，miR-216b能夠與UCA1結(jié)合影響其穩(wěn)定性，加速細(xì)胞內(nèi)源lncRNA-UCA1分子的降解。

圖5 轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞總RNA質(zhì)量檢測(cè)

圖6 qPCR檢測(cè)UCA1的表達(dá)

2.6 miR-216b加速外源過表達(dá)的lncRNA-UCA1的降解

將0.5μg pcDNA6-UCA1分別轉(zhuǎn)染HEK293T和HeLa細(xì)胞，24 h后再轉(zhuǎn)染50 pmol miR-216b mimic及對(duì)照，并用放線菌素D抑制轉(zhuǎn)錄，收取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA，電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HEK293T細(xì)胞（圖9）和HeLa細(xì)胞（圖10）中UCA1的半衰期。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-216b mimic組的lncRNA-UCA1的半衰期縮短，lncRNA-UCA1的降解明顯加快，miR-216b能夠加速降解外源表達(dá)的UCA1。

2.7 miR-216 inhibitor抑制miR-216b對(duì)UCA1的加速降解作用

圖7 qRT-PCR檢測(cè)HEK293T細(xì)胞多個(gè)時(shí)間點(diǎn)UCA1水平

圖8 qRT-PCR檢測(cè)HeLa細(xì)胞多個(gè)時(shí)間點(diǎn)UCA1水平

圖9 qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)UCA1并轉(zhuǎn)染miR-216后HEK293T細(xì)胞的UCA1水平

在HEK293T和HeLa細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染0.5μg pcDNA6-UCA1，24 h后轉(zhuǎn)染100 pmol miR-216b inhibitor及對(duì)照，同時(shí)用放線菌素D抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，收取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HEK293T細(xì)胞（圖11）和HeLa細(xì)胞（圖12）的UCA1半衰期。結(jié)果顯示，miR-216b inhibitor實(shí)驗(yàn)組lncRNA-UCA1的半衰期相比于對(duì)照組明顯增長(zhǎng)。

3 討論

圖10 qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)UCA1并轉(zhuǎn)染miR-216后HeLa細(xì)胞的UCA1水平

圖11 qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)UCA1并轉(zhuǎn)染miR-216 inhibitor后HEK293T細(xì)胞的UCA1水平

圖12 qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)UCA1并轉(zhuǎn)染miR-216 inhibitor后HeLa細(xì)胞的UCA1水平

越來越多的研究表明，lncRNA和miRNA皆可廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，它們能夠參與細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的生物學(xué)過程。隨著研究的不斷深入，miRNA對(duì)基因的調(diào)控及受其他分子調(diào)控的機(jī)制也越來越清楚，miRNA結(jié)合靶mRNA后能導(dǎo)致靶mRNA的剪切或翻譯抑制，miRNA本身的產(chǎn)生與代謝也受多種水平的調(diào)控[3]。而lncRNA的功能則較為復(fù)雜多變，可作為信號(hào)分子、誘餌分子、導(dǎo)向分子及分子支架。miRNA的“分子海綿”的功能就是其作為誘餌分子的一種體現(xiàn)形式，而正是這種功能將lncRNA和miRNA這2種對(duì)細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)活動(dòng)有重要影響的分子緊密聯(lián)系到了一起。

miRNA靶向mRNA后，根據(jù)是否完全互補(bǔ)匹配引起靶mRNA的剪切，進(jìn)而加速靶mRNA的降解或?qū)Π衜RNA翻譯進(jìn)行抑制，而lncRNA與mRNA的結(jié)構(gòu)非常類似，其內(nèi)也含有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，所以lncRNA作為miRNA的“分子海綿”，其在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA后，理論上也會(huì)受miRNA的調(diào)控，即lncRNA與miRNA應(yīng)存在相互調(diào)控關(guān)系。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，含有miR-216b結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA-UCA1結(jié)合miR-216b后，自身半衰期顯著縮短，說明miR-216b加速了UCA1分子的降解，而miR-216b的抑制劑能夠延長(zhǎng)UCA1分子的半衰期，加強(qiáng)其穩(wěn)定性。但是，導(dǎo)致UCA1加速降解的確切分子機(jī)制還須探討。本研究為了解lncRNA的“分子海綿”功能提供了新的線索，同時(shí)也加深了我們對(duì)lncRNA-miRNA-mRNA之間相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解。

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m iR-216b Accelerated Decay of lncRNA-UCA1 in Cultured Cells

ZHENG Wei,GUO Xiao-Hua,DONG Jie,LI Shao-Hua,DING Hong-Mei,LI Hui, HUANG Ai-Xue,XIA Wei,BAI Chen-Jun,LI Da,GENG Jie,LI Jie*,SHAO Ning-Sheng*
Beijing Institute of Basic Medical Science,Beijing 100850,China

Objective:To explore the effects of miR-216b on lncRNA-UCA1 after miR-216b binding with UCA1.Methods:Genome was extracted from HEK293T cell,and from which UCA1-coding sequence was amplified by PCR with specific primers,then the gene fragment was cloned into pcDNA 6.0b vector.Cells were transfected with miR-216b mimic and treated with actinomycin D,then total RNA were extracted at three time points and qRT-PCR was performed to detect the half-life of UCA1.The recombinant pcDNA6-UCA1 was transfected into cells for 24 h,then we transfected miR-216b mimic or miR-216b inhibitor into cells and treated cells with actinomycin D,three time points total cell RNA was harvested,and UCA 1 half-life was detected by qRT-PCR.Results:UCA1 RNA level was remarkably increased after transfection of pcDNA6-UCA1.Overexpression of miR-216b significantly reduced the half-life of both endogenous and exogenous UCA 1 compared to the control group. miR-216b inhibitor could prolong UCA1 half-life and enhance UCA1 RNA stability.Conclusion:miR-216b could accelerate decay of UCA1 which provided a new thought for interaction between miRNA with lncRNA.

UCA1;long non-coding RNA;miR-216b;decay

Q78

A

1009-0002（2017）03-0227-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.001

2017-01-18

國家自然科學(xué)基金（31370794，31570817，31200566）

鄭偉（1990-），男，碩士研究生，（E-mail）jaycheng0920@foxmail.com

邵寧生，（E-mail）shaonsh@hotmail.com；李潔，（E-mail）jannbio@163.com

*Co-corresponding authors,SHAO Ning-Sheng,E-mail:shaonsh@hotmail.com;LI Jie,E-mail:jannbio@163.com