吳 朗, 黃 成, 馮新民, 畢松超, 陳 濤, 王 鵬, 楊建東

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

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膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的效果

吳 朗, 黃 成, 馮新民, 畢松超, 陳 濤, 王 鵬, 楊建東

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

目的 觀察膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( BMSCs)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞對(duì)大鼠脊髓損傷的修復(fù)作用。方法 以載GDNF基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs以誘導(dǎo)其分化。選取36只SD大鼠制成脊髓損傷模型，隨機(jī)分成3組。對(duì)36只大鼠于造模后1、2、3、4周行BBB評(píng)分，并于造模后第4周取材行HE染色及免疫組化染色，觀察脊髓損傷修復(fù)情況。結(jié)果 載GDNF基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染后, BMSCs可持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)較高水平的GDNF, 并能成功誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。術(shù)后1～4周, C組BBB評(píng)分均明顯高于其他2組, A組最低且無(wú)明顯變化; 術(shù)后4周HE染色結(jié)果顯示, A組脊髓空洞面積最大, C組空洞面積最小; 術(shù)后4周, A組脊髓損傷部位出現(xiàn)少量NF200、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞, C組較B組和A組則明顯增多。結(jié)論 GDNF基因修飾的BMSCs能成功分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，移植后對(duì)大鼠脊髓損傷具有一定的修復(fù)作用。

脊髓損傷; 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞; 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

脊髓損傷是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可引起軸突損傷以及大量的神經(jīng)細(xì)胞死亡[1], 造成患者感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能的喪失[2]。傳統(tǒng)的手術(shù)、藥物、物理療法雖然可以在短期內(nèi)提高患者的生活質(zhì)量，但并不能促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)及其功能的恢復(fù)[3]。隨著組織工程的不斷發(fā)展，細(xì)胞移植為治療脊髓損傷提供了一條新的途徑，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是理想的種子細(xì)胞。已有研究[4-5]證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)分化成為神經(jīng)細(xì)胞替代受損組織、分泌神經(jīng)保護(hù)性營(yíng)養(yǎng)因子、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)軸突再生及重建神經(jīng)通路等途徑促進(jìn)脊髓損傷動(dòng)物模型神經(jīng)功能的恢復(fù)。但由于受損傷后炎癥、氧自由基等的影響，移植后的細(xì)胞分化并不理想，直接應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的效果是有限的[6]。因此，體外促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化在脊髓損傷的治療中有重要的研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以GDNF基因修飾BMSCs, 于體外誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞后移植治療脊髓損傷大鼠，對(duì)其療效進(jìn)行觀察并對(duì)比研究局部移植和靜脈移植兩種移植途徑的療效，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 180 g Wister大鼠，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心; 病毒，載膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和綠色熒光蛋白基因重組腺病毒(AD-rGDNF-GF)由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行構(gòu)建和擴(kuò)增; DMEM培養(yǎng)基; 超凈工作臺(tái); CO2培養(yǎng)箱; 石蠟切片機(jī); 熒光顯微鏡。

1.2 BMSCs的分離與培養(yǎng)

收集實(shí)驗(yàn)大鼠股骨骨髓于離心管中，以1 000 r/min離心10 min, 取沉淀，以含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMED重懸后于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h。之后每3～4 d更換1/2體積培養(yǎng)液，顯微鏡觀察當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合后，以胰酶消化貼璧細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞檢測(cè)CD34、CD44、CD45、CD90分子的表達(dá)情況，行BMSCs鑒定。

1.3 體外轉(zhuǎn)染

將BMSCs以5×104/孔的密度種植于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后用胰酶消化細(xì)胞。向各孔中加入無(wú)血清DMEM和重組腺病毒懸液，共2 mL, 使感染復(fù)數(shù)MOI為100。于恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h后更換培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況, Western Blot法檢測(cè)GDNF的表達(dá)，免疫熒光鑒定Neun、Nfl的表達(dá)。

1.4 動(dòng)物分組及大鼠脊髓損傷模型的制備

將48只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)分為3組, A組為模型組, B組為靜脈移植組, C組為局部移植組。采用改良Allen′s打擊法[7]制作動(dòng)物脊髓損傷模型。以0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠。以T12棘突為中心，從背部正中切開(kāi)皮膚，逐層暴露皮下組織，分離椎旁組織、顯露T11～L1棘突和椎板。去除T12椎板和棘突，顯露脊髓。以10 gcf致傷能量打擊脊髓，造成脊髓損傷。以大鼠軀體抖動(dòng)、雙后肢回縮樣撲動(dòng)以及尾巴痙攣性擺動(dòng)為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

參照BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別于術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后1、2、3、4周對(duì)各組大鼠行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。

1.6 免疫熒光

制作細(xì)胞爬片，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定10 min, PBS漂洗5 min; 0.5%Triton穿孔15 min, PBS漂洗2次，每次5 min; 1%胎牛血清封閉30 min; 加入稀釋的一抗，置于4 ℃冰箱過(guò)夜; PBS漂洗2次，每次5 min; 加入稀釋的二抗，置于室溫雜交2 h; PBS漂洗2次，每次5 min; 5 μg/mL DAPI染色2 min; 抗淬滅封片劑封片備用。

1.7 HE染色

取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷區(qū)脊髓制成切片備用。蘇木素染色5 min, 自來(lái)水沖洗去除殘留染色液; 鹽酸酒精分化30 s, 沖洗; 返藍(lán)液返藍(lán)5 min, 沖洗; 伊紅水溶液浸染5 min; 梯度乙醇脫水，每級(jí)1 min。切片入二甲苯2次，每次約1 min; 滴加適量樹(shù)膠封片。

1.8 免疫組化

取實(shí)驗(yàn)大鼠損傷區(qū)脊髓制成冰凍切片固定。PBS清洗3次，每次3 min; 加入3%雙氧水室溫孵育10 min; PBS清洗3次，每次3 min; 加入5%山羊血清，室溫孵育20 min; 加入1∶200稀釋的NSE、NF-200抗體, 4 ℃過(guò)夜; PBS清洗3次，每次1 min; 加入二抗，37 ℃孵育30 min; PBS清洗3次，每次3 min; DBA染色3～10 min; 蒸餾水清洗2次，每次1 min; 封片。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染結(jié)果

載GDNF基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 24 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)熒光蛋白GFP的熒光強(qiáng)度漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染7 d后熒光蛋白GFP的表達(dá)最強(qiáng), 14 d后熒光明顯減弱。見(jiàn)圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察AD-rGDNF-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs后第1、3、7、14天綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況(300倍)

2.2 GDNF蛋白情況

分別于轉(zhuǎn)染后第1、3、7、14天使用Western Blot法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BMSCs可以持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)GDNF蛋白。見(jiàn)圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后應(yīng)用WesternBlot法檢測(cè)GDNF蛋白表達(dá)情況

2.3 神經(jīng)元樣細(xì)胞的免疫熒光鑒定

于熒光顯微鏡下鑒定BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染3 d后免疫熒光顯微鏡下可觀察到神經(jīng)元特異性標(biāo)志物神經(jīng)元蛋白NeuN的表達(dá)，呈紅色。7 d后可觀察到神經(jīng)絲蛋白NF-L的表達(dá)，呈紅色，且細(xì)胞呈現(xiàn)典型的神經(jīng)細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖3。

2.4 BBB評(píng)分結(jié)果

造模后大鼠雙下肢立即癱瘓, BBB評(píng)分為0。術(shù)后1～4周，A、B、C組BBB評(píng)分均有不同程度的提高，但B、C組較A組顯著明顯(P<0.05)。術(shù)后1周，局部移植組C組與靜脈移植組B組BBB評(píng)分比較無(wú)顯著差異(P>0.05); 術(shù)后2～4周, B、C組評(píng)分出現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì), C組評(píng)分增高較B組顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖a、b、c為熒光顯微鏡下NeuN熒光染色結(jié)果;圖d、e、f為熒光顯微鏡下NF-L熒光染色結(jié)果(300倍)圖3 熒光顯微鏡下觀察BMSCs體外誘導(dǎo)后神經(jīng)元標(biāo)志物熒光染色情況

2.5 脊髓HE染色結(jié)果

術(shù)后4周脊髓組織HE染色顯示, A、B、C組均有不同程度的脊髓損傷。A組脊髓空洞面積最大, C組脊髓空洞面積明顯小于B組。見(jiàn)圖4。

圖a為A組脊髓HE染色結(jié)果;圖b為B組脊髓HE染色結(jié)果;圖c為C組脊髓HE染色結(jié)果(60倍)圖4 顯微鏡下觀察移植后4周脊髓HE染色結(jié)果

2.6 脊髓免疫組化結(jié)果

術(shù)后4周免疫組化顯示, 3組脊髓均有不同程度的NF-200、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞形成，其中A組最少，C組脊髓損傷局部NF-200、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于A、B組。見(jiàn)圖5。

圖a、b、c分別為A、B、C組NF-200脊髓免疫組化結(jié)果;圖d、e、f分別為A、B、C組GFAP脊髓免疫組化結(jié)果(600倍)圖5 顯微鏡下觀察移植后4周脊髓GFAP免疫組化結(jié)果

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較

與A、B組比較, *P<0.05; 與A組比較, #P<0.05。

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能和自我更新能力的干細(xì)胞，在特定的條件下，可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞等[8]。其由于具有易于分離、培養(yǎng)且移植不受倫理道德的約束等有點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于脊髓損傷模型的研究。Woodbury等[9]在體外用二甲基亞砜和丁基羥基茴香醚成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，這表明BMSCs可以向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。已有研究[10]證實(shí), BMSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞有利于促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)，而移植神經(jīng)元樣細(xì)胞治療脊髓損傷的關(guān)鍵在于促進(jìn)移植細(xì)胞在受損局部的存活及神經(jīng)通路的重建。

作者的前期研究[11]發(fā)現(xiàn), BMSCs在GDNF的誘導(dǎo)下可以向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，并能穩(wěn)定表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，但依靠外源性GDNF誘導(dǎo)分化的作用不穩(wěn)定，難以持續(xù)且成本較高。本研究通過(guò)載以GDNF基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs, 以期通過(guò)BMSCs自身持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)的GDNF蛋白誘導(dǎo)其分化。于構(gòu)建AD-rGDNF-GFP載體轉(zhuǎn)染BMSCs 3 d后通過(guò)倒置熒光顯微鏡可觀察到BMSCs中綠色熒光蛋白GFP高效表達(dá)，提示有較高的轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的BMSCs可以持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)GDNF蛋白，并能維持其較高的濃度。應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN、NF-L均有表達(dá)，表明BMSCs已成功分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。作者還通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GDNF誘導(dǎo)后BMSCs中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NT-3等表達(dá)顯著增加，而這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在脊髓損傷后的神經(jīng)再生中起著重要的作用[12]。

GDNF屬于TGF-β超家族，是一種生物活性很強(qiáng)的細(xì)胞因子，在體內(nèi)分布廣泛，它能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、神經(jīng)細(xì)胞軸突再生以及突觸形成，并對(duì)神經(jīng)元有著重要的保護(hù)作用[13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn), GDNF可以通過(guò)改善局部缺血以及減少少突細(xì)胞的細(xì)胞凋亡等途徑提升脊髓損傷大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能，對(duì)脊髓損傷的修復(fù)具有一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染的方法將載有GDNF基因的腺病毒載體導(dǎo)入BMSCs中，誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，并將分化后的BMSCs移植入脊髓損傷的大鼠體內(nèi)來(lái)研究其對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用。運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分是評(píng)價(jià)脊髓損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的重要指標(biāo)[15]。本研究分別于造模后1、2、3、4周對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分，結(jié)果顯示術(shù)后1～4周, A、B、C組BBB評(píng)分均有不同程度的提高，但B、C組較A組顯著提高(P<0.05)。術(shù)后1周，局部移植組C組與靜脈移植組B組BBB評(píng)分比較無(wú)顯著差異(P>0.05); 術(shù)后2～4周, B、C組評(píng)分出現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì), C組評(píng)分增高較B組顯著(P<0.05)。NF-200主要存在于軸突中，它的表達(dá)增高表示神經(jīng)元以及軸突的再生和生長(zhǎng)，有利于大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[16]。GFAP被認(rèn)為是膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)量的增加表明膠質(zhì)細(xì)胞的形成。研究[17-18]認(rèn)為，在脊髓損傷前期其表達(dá)量的增加有利于脊髓損傷的修復(fù)，這可能與其分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān); 在脊髓損傷后期其表達(dá)量的增加會(huì)阻礙神經(jīng)軸突形成，不利于脊髓損傷的修復(fù)。術(shù)后4周脊髓組織免疫組化3組脊髓均有不同程度的NF-200、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞形成，其中A組最少, C組脊髓損傷局部NF-200、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于A、B組。本實(shí)驗(yàn)在大鼠脊髓損傷模型的治療上取得了一定的療效，推測(cè)其機(jī)制可能為: ① 分化后的BMSCs細(xì)胞通過(guò)替代已損傷的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)脊髓損傷的作用; ② 6BMSCs細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)了脊髓損傷修復(fù); ③ 持續(xù)表達(dá)的GDNF對(duì)損傷的脊髓具有一定的修復(fù)作用。

目前，研究移植BMSCs治療脊髓損傷常用的方法主要有局部注射移植、經(jīng)靜脈移植、經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植等。本實(shí)驗(yàn)選取局部移植和經(jīng)靜脈移植兩種方法進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)局部移植組的BBB評(píng)分明顯高于靜脈移植組，這可能與到達(dá)損傷部位的細(xì)胞數(shù)量有關(guān)[19]。雖然在脊髓損傷時(shí)BMSCs具有一定的向損傷部位遷移的特性[20], 但是由于脾、肺、肝等器官的“首關(guān)效應(yīng)”，使得通過(guò)靜脈移植的細(xì)胞大量死亡，達(dá)到損傷部位的細(xì)胞很少[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示局部移植組的療效優(yōu)于靜脈移植組，但有學(xué)者[22]認(rèn)為局部移植本身具有一定的創(chuàng)傷性，會(huì)加重局部組織的損傷。比較而言，靜脈移植是一種無(wú)創(chuàng)的治療方法，不會(huì)造成損傷部位的二次損傷，但是由于首關(guān)效應(yīng)造成了大量移植細(xì)胞的死亡，其對(duì)脊髓損傷的修復(fù)效果并不理想。

[1] Wu S, Cui G, Shao H, et al. The Cotransplantation of Olfactory Ensheathing Cells with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells ExertsAntiapoptotic Effects in Adult Rats after Spinal Cord Injury[J]. Stem cells International, 2015: 1201-1205.

[2] Wang L J, Zhang R P, Li J D. Transplantation of neurotrophin-3-expressing bone mesenchymal stem cells improves recovery in a rat model of spinal cord injury[J]. Acta Neurochir, 2014, 156: 1409-1418.

[3] Bryukhovetskiy A S, Bryukhovetskiy I S. Effectiveness of repeated transplantations of hematopoietic stem cells in spinal cord injury[J]. World J Transplantation, 2015, 5(3): 110-128.

[4] Lin W P, Chen X W, Zhang L Q, et al. Effect of Neuroglobin Genetically Modified Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplantation on Spinal Cord Injury in Rabbits[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e63444.

[5] 王酈, 王倩, 張曉明. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)骨傷, 2014, 27(5): 437-440.

[6] Jia Y, Wu D, Zhang R, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells expressing the Shh transgene promotes functional recovery after spinal cord injury in rats[J]. Neurosci Lett, 2014, 573: 46-51.

[7] Allen A R. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture disloeaion of spinal colum[J]. Jama, 1991, 4: 878-880.

[8] Yang Q, Mu J, Li Q, et al. Asimple and efficient method for derving neurospheres from bone marrow stromal cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 372(4): 520-524.

[9] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-370.

[10] 高平, 孫占勝, 王伯珉, 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞移植治療脊髓損傷[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2013, 17(23): 4256-4263.

[11] Jian-Dong Yang, Cheng-Huang, Jing-Cheng Wang, et al. The isolation and cultivation of bone marrow stem cells and evaluation of differences for neural-like cells differentiation under the induction with neurotrophic factors[J]. Cytotechnology, 2014, 66(6): 1007-19.

[12] Zhang R P, Wang L J, He S, et al. Effects of Magnetically Guided, SPIO-Labeled, and Neurotrophin-3 Gene-Modified Bone Mesenchymal Stem Cells in a Rat Model of Spinal Cord Injury[J]. Stem Cells International, 2016: 321-326.

[13] Deng L X, Deng P, R Y W, et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury[J]. J Neurosci, 2013, 33(13): 5655-5667.

[14] CH Kao, SH Chen, CC Chio, et al. Exogenous administration of glial cell line-derived neurotrophic factor improves recovery after spinal cord injury[J]. Resuscitation, 2008(77) 395-400.

[15] Wen Ping Lin, Xuan Wei Chen, Li Quan Zhang, et al. Effect of Neuroglobin Genetically Modified Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplantation on Spinal Cord Injury in Rabbits[J]. Plos One, 2013, 8(5): 127-129.

[16] 趙學(xué)正, 唐開(kāi). 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠脊髓損傷移植途徑的實(shí)驗(yàn)[J]. 中華骨與關(guān)節(jié)外科雜志, 2015, 8(3): 246-252.

[17] Nagamoto-Combs K, Morecraft RJ, Darling WG, et al. Long-term gliosis and molecular changes in the cervical spinal cord of the rhesus monkey after traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma, 2010, 27(3): 565-585.

[18] Li Z W, Tang R H, Zhang J P, et al. Inhibiting epidermal growth factor receptor attenuates reactive astrogliosis and improves functional outcome after spinal cord injury in rats[J]. Neurochem Int, 2011, 58(7): 812-819.

[19] Dong Ah Shin, Jin-Myung Kim, Hyoung-Ihl Kim, et al. Comparison of functional andhistological outcomes after intralesional, intracisternal, and intravenous transplantation of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in a rat model of spinal cord injury[J]. Acta Neurochir, 2013(155): 1943-1950.

[20] Svetlana M S, Parvin S, Richard F K, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2005, 25( 5): 593-606.

[21] Takahashi Y, Tsuji O, Kumagai G, et al. Comparative study of methods for administering neural stem/progenitor cells to treat spinal cord injury in mice[J]. Cell Transplant, 2010, 20(2): 727-739.

[22] Sasaki H, Tanaka N, Nakanishi K, et al. Therapeutic effects with magnetic targeting of bone marrow stromal cells in a rat spinal cord injury model[J]. Spine(Phila Pa 1976)，2011: 36: 933-938.

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells modified by GDNF in transplantation treatment of patients with spinal cord injury

WU Lang, HUANG Cheng, FENG Xinming, BI Songchao, CHEN Tao, WANG Peng, YANG Jiandong

(ClinicalMedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225000)

Objective To observe the effectiveness of transplantation of neuron-like cells induced by GDNF from BMSCs on treatment of spinal cord injury in rats. Methods Transfected BMSCs by recombinant adenovirus containing the gene of rGDNF and GFP. 36 SD rats with spinal cord injury were randomly divided into three groups. All the 36 SD rats with spinal cord injury were scored by the Basso, Beattle, Bresnahan locomotor rating scale at different time points (1、2、3、4 weeks after operation). In the 4thweek after operation, tissue from the injury section was prepared to observe repair of spinal cord injury. Results BMSCs was able to secrete GDNF continuously after transfected by recombinant adenovirus containing the gene of rGDNF and GFP. After operation, BBB scores in intralesional treatment group significantly increased when compared with that of intravenous treatment group and injury control group. In the 4thweek after operation, HEmatoxylin-eosin staing results showed that cavitation in intravenous treatment group was larger than that in intralesional treatment group with the one of injury control group being the biggest. Immunohistochemical method showed that there were more NF200+cells and GFAP+cells in intralesional treatment group than in the other two groups, and injury control group had the least NF200+cells and GFAP+cells. Conclusion After induced into nuron-like cells, BMSCs can treat spinal cord injury effectively.

spinal cord injury; bone marrow mesenchymal stem cells; Gial cell line-derived neurotrophic factor

2016-12-14

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助項(xiàng)目(81071466); 江蘇省六大人才高峰資助項(xiàng)目(2014-WSN-076)

楊建東, E-mail: yangjiandong69@sohu.com

R 744

A

1672-2353(2017)09-094-05

10.7619/jcmp.201709024