李妍琪，沈莉，簡軍全，張劍俠*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西北園藝植物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

葡萄砧木及雜種的抗寒性鑒定

李妍琪，沈莉，簡軍全，張劍俠*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西北園藝植物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

以葡萄砧木4個雜交組合河岸葡萄(♀)（V. riparia）×左山75097（V. amurensis）、泰山-11（V. amurensis）×河岸-2（V. riparia Mcadams）、泰山-11（V. amurensis）×Constantia（V. rupestris）、5BB（V. berlandieri × V. riparia）×黑龍江實(shí)生（V. amurensis）的親本及其81株F1代雜種為試驗(yàn)材料，通過人工低溫脅迫處理一年生休眠枝條，測定相對電導(dǎo)率、可溶性蛋白、脯氨酸及可溶性糖等4項生理指標(biāo)，利用隸屬函數(shù)法綜合評價了各株系的抗寒性。結(jié)果表明：4個雜交組合的后代抗寒性出現(xiàn)了分離，總體上介于雙親之間，但也存在有超高親或超低親現(xiàn)象，表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)，且抗寒性遺傳傾向于抗性弱的方向。本研究并篩選出高抗和抗寒雜種，以期用于抗寒砧木新品種選育。

葡萄；砧木；雜種；抗寒性；鑒定

葡萄（Vitis vinifera L.）為葡萄科葡萄屬藤本植物，在世界果樹生產(chǎn)中占有重要位置。我國廣闊的西北地區(qū)光照充足、晝夜溫差大，非常有利于優(yōu)質(zhì)葡萄生產(chǎn)，但是這些地區(qū)冬季氣候寒冷對葡萄的種植面積、產(chǎn)量、品質(zhì)以及經(jīng)濟(jì)效益造成了負(fù)面的影響[1]。冬季低溫帶來的凍害，輕則造成枝蔓失去活力、減產(chǎn)，重則會導(dǎo)致枝蔓脫水致死、根系變褐失去吸水能力[2]。目前，大多數(shù)葡萄產(chǎn)區(qū)采用傳統(tǒng)的埋土或煙熏等方式進(jìn)行冬季葡萄園防寒，浪費(fèi)了大量的人力、物力[3]。也有研究表明，采用不同覆蓋方式或用噴淋系統(tǒng)對葡萄園霜凍進(jìn)行防御效果較明顯[4-5]，但是大面積推廣應(yīng)用較為困難。利用葡萄抗寒砧木進(jìn)行嫁接栽培，可以提高葡萄冬季抗寒能力，減少埋土、降低生產(chǎn)成本[6]；還可以提高產(chǎn)量、改善果實(shí)品質(zhì)[7]。

我國擁有豐富的野生葡萄資源，其中山葡萄（Vitis amurensis）是葡萄屬中最抗寒的種，可耐-40 ℃的低溫，是寶貴的抗寒種質(zhì)資源[8]。利用我國特有的野生山葡萄與北美洲野生葡萄或砧木品種進(jìn)行雜交，將中國野生山葡萄的抗寒基因與北美洲野生種的抗性基因結(jié)合在一起，以期培育抗寒甚至多抗性砧木新品種。而雜交育種過程中，對雜交后代抗寒性鑒定與篩選是一項非常必要的工作[9]。然而，植物的抗寒性是一個復(fù)雜的生理生化過程，僅靠單一指標(biāo)評價不能夠客觀準(zhǔn)確的反映其抗寒能力，因此許多研究采用隸屬函數(shù)法綜合評價抗寒性[10-13]。

本研究是在本課題組對葡萄種質(zhì)資源以及砧木品種抗寒性綜合評價的基礎(chǔ)上[14-15]，對砧木抗寒育種中獲得的雜種后代一年生枝條采用人工低溫脅迫處理，測定相關(guān)生理指標(biāo)并利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評價，以期篩選抗寒性強(qiáng)的雜種單株，為選育抗寒砧木新品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃中保存的4個砧木育種雜交組合：河岸葡萄（♀）×山葡萄左山75097、山葡萄泰山-11×河岸-2、山葡萄泰山-11×沙地葡萄Constantia、5BB×山葡萄黑龍江實(shí)生，冬季取雜交親本及其雜交后代的一年生枝條。以山葡萄株系“左山75097”為抗寒對照（CK1），歐洲葡萄品種“紅地球”為不抗寒對照（CK2）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料的準(zhǔn)備

2016年11月26日采集粗細(xì)均勻、長勢一致的一年生休眠枝條并進(jìn)行沙藏，2周后取出枝條（每株系取3～4根），用蒸餾水洗凈并擦干，放入密封袋，4 ℃保存。

1.2.2 最佳處理溫度的選擇

參照前期本課題組研究獲得的最佳冷凍處理溫度-24 ℃進(jìn)行溫度處理[10,14-15]。對各雜交組合親本及其后代進(jìn)行抗寒指標(biāo)的測定。溫度處理過程如下：4 ℃冷藏8 h后放入0 ℃下保存8 h，然后放入-12 ℃保持8 h，再放入-18 ℃保持8 h，最后放入-24 ℃進(jìn)行低溫脅迫12 h。之后進(jìn)行升溫處理，即從-24 ℃取出放回-18 ℃下保持8 h，再放入-12 ℃保持8 h，隨后放入0 ℃中8 h，最后置于4 ℃中保存。

1.3 測定指標(biāo)

相對電導(dǎo)率的測定采用DDS-307型電導(dǎo)儀進(jìn)行[16]，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法，脯氨酸含量的測定采用茚三酮比色法，可溶性糖含量的測定采用蒽酮顯色法[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用隸屬函數(shù)法綜合各項指標(biāo)進(jìn)行抗寒性評價[14]。其公式為：

式中：Uij表示i種類j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值；Xij表示i種類j指標(biāo)的測定值；Xjmin表示所有種類j指標(biāo)的最小值；Xjmax表示所有種類j指標(biāo)的最大值；i表示某個品種；j表示某項指標(biāo)。

根據(jù)公式計算出隸屬函數(shù)值，再用每株系的4個指標(biāo)隸屬函數(shù)值的平均數(shù)作為其平均隸屬度。按照平均隸屬度（Subordinate level，SL）將抗寒性分為5級：0.70～1.00為高抗（High resistance，HR），1級；0.60～0.69為抗（Resistance，R），2級；0.40～0.59為中抗（Middle resistance，MR），3級；0.30～0.39為低抗（Lower resistance，LR），4級；0～0.29為不抗（Susceptible，S），5級。

2 結(jié)果與分析

2.1 河岸葡萄（♀）×左山75097雜交后代的抗寒性表現(xiàn)

由表1可以看出，“河岸葡萄（♀）”ד左山75097”組合，親本“河岸葡萄（♀）”表現(xiàn)為抗寒，“左山75097”表現(xiàn)為高抗，13株F1代出現(xiàn)了抗寒性分離，均表現(xiàn)為不同程度的抗寒，未出現(xiàn)不抗寒單株，后代平均隸屬度分布在0.56～0.77，其中高抗寒2株，抗寒8株，中等抗寒3株；超過高值親本“左山75097”（平均隸屬度0.72）的有2株（HZ9、HZ10），低于低值親本“河岸葡萄（♀）”（平均隸屬度0.62）的有5株。

2.2 泰山-11×河岸-2雜交后代的抗寒性表現(xiàn)

抗寒性鑒定結(jié)果（表2）表明，“泰山-11”ד河岸-2”組合的親本均表現(xiàn)為抗寒，13株F1代出現(xiàn)了抗寒性分離，均表現(xiàn)為不同程度的抗寒，未出現(xiàn)不抗寒單株，后代平均隸屬度分布在0.51～0.68，其中抗寒9株，中等抗寒4株；超過高值親本“泰山-11”（平均隸屬度0.66）的有1株（TH6），低于低值親本“河岸-2”（平均隸屬度0.64）的有9株。

表1 河岸葡萄（♀）×左山75097雜交后代的抗寒性鑒定結(jié)果

表2 泰山-11×河岸-2雜交后代的抗寒性鑒定結(jié)果

2.3 泰山-11×Constantia雜交后代的抗寒性表現(xiàn)

對“泰山-11”דConstantia”雜交后代抗寒性鑒定結(jié)果（表3）表明，親本“泰山-11”表現(xiàn)為抗寒、“Constantia”表現(xiàn)為中等抗寒，在38株F1代中出現(xiàn)了抗寒性分離，均表現(xiàn)為不同程度的抗寒，未出現(xiàn)不抗寒單株，后代平均隸屬度分布在0.35～0.63，其中抗寒3株，中等抗寒31株，低抗寒4株；低于低值親本“Constantia”（平均隸屬度0.42）的有9株；大于親中值（平均隸屬度0.54）的有11株，占28.95%；等于親中值的有2株，占5.26%；其余25株小于親中值，占65.79%。

據(jù)此組合推測，葡萄抗寒性遺傳可能為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，總體上偏向于抗寒性弱的方向。

2.4 5BB×黑龍江實(shí)生雜交后代的抗寒性表現(xiàn)

由表4可見，在“5BB”ד黑龍江實(shí)生”組合中，親本“5BB”表現(xiàn)為中等抗寒、“黑龍江實(shí)生”表現(xiàn)為抗寒，在其17株F1代中出現(xiàn)了抗寒性分離，均表現(xiàn)為不同程度的抗寒，未出現(xiàn)不抗寒單株，后代平均隸屬度分布在0.40～0.60，其中抗寒1株，中等抗寒16株；出現(xiàn)了9株雜種低于低值親本“5BB”（平均隸屬度0.52）。

表3 泰山-11×Constantia雜交后代的抗寒性鑒定結(jié)果

3 討論

植物細(xì)胞膜對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著非常重要的作用，植物細(xì)胞膜是一種選擇性透過膜，在低溫逆境條件下隨著細(xì)胞質(zhì)膜透性的增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)及其他內(nèi)含物將有不同程度的外滲，這些滲出物可用電導(dǎo)儀測定[18]，因此電導(dǎo)率可作為抗寒性鑒定的一項重要生理指標(biāo)。植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸，在低溫逆境下，為了維持細(xì)胞壓力勢穩(wěn)定，植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)會大量積累。細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖，可以使細(xì)胞液濃度增加、冰點(diǎn)和滲透勢降低，增強(qiáng)細(xì)胞保水能力，減輕低溫對細(xì)胞的傷害，提高植物抗寒性[19]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)親水性較強(qiáng)，可以增加細(xì)胞持水力，其含量隨溫度下降而增加，可以束縛更多水分，減少原生質(zhì)結(jié)冰而造成傷害，提高植物的抗寒性[20]。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有較強(qiáng)的與水結(jié)合的能力，在低溫逆境條件下，游離脯氨酸在植物體內(nèi)大量積累，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定[21-22]。因此滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量可以作為抗寒性鑒定的生理指標(biāo)。

前人的研究表明，葡萄雜交后代抗寒隸屬度呈連續(xù)分布，為多基因控制的數(shù)量性狀[9-10]。本研究中，不同的雜交組合其后代抗寒性分離比例不同，在雜種株數(shù)較多的組合“泰山-11”דConstantia”中，后代抗寒性表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳的特點(diǎn)，抗寒性遺傳總體上偏向抗寒性弱的方向。在“河岸葡萄（♀）”ד左山75097”組合中，雜種HZ9、HZ10的平均隸屬度分別為0.77、0.74，超過高值親本“左山75097”（平均隸屬度0.72）；在“泰山-11”ד河岸-2”組合中，雜種TH6的抗寒平均隸屬度為0.68，高于高值親本“泰山-11”（平均隸屬度0.66）。“泰山-11”דConstantia”、“5BB”ד黑龍江實(shí)生”，均是抗寒與中等抗寒間的雜交，F(xiàn)1代均出現(xiàn)了抗性分離，多數(shù)雜種單株的抗寒性表現(xiàn)為中等抗寒，也出現(xiàn)有一定數(shù)量的雜種單株低于低值親本，未出現(xiàn)超過高值親本的雜種單株，這說明在今后的抗寒雜交育種組合選配時，應(yīng)選擇抗寒性強(qiáng)的砧木作親本。

表4 5BB×黑龍江實(shí)生雜交后代的抗寒性鑒定結(jié)果

葡萄雜交后代抗寒性的研究已有報道[9-11]，本研究中采用電導(dǎo)法，并測定了可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖的含量，利用隸屬函數(shù)法綜合評價了葡萄砧木雜種的抗寒性，認(rèn)為抗寒表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳的特征且雜交組合后代的抗寒性偏向抗寒性弱的方向，與張文娥等[9]、張劍俠等[10]的結(jié)果相一致。下一步的工作是對篩選出的高抗寒單株進(jìn)行扦插試驗(yàn)和嫁接親和力試驗(yàn)，以期選育出抗寒砧木新品種。

[1] 王依, 靳娟, 羅強(qiáng)勇, 等. 葡萄低溫脅迫與抗寒性相關(guān)因素研究進(jìn)展[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2015(3): 61-66.

[2] 陳文朝, 閆鳳岐, 王偉軍, 等. 張家口地區(qū)葡萄凍害調(diào)查及預(yù)防措施[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2012(5): 42-45.

[3] 王琴, 王建友, 蔣江照, 等. 葡萄抗寒性研究進(jìn)展[J]. 北方園藝, 2015(1): 179-181.

[4] 李鵬程, 郭紹杰, 李銘, 等. 葡萄專用覆蓋材料對紅地球葡萄安全越冬防寒效果綜合評價[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2011(6): 206-210.

[5] 于永明, 楊永平.噴淋防霜系統(tǒng)在葡萄園應(yīng)用效果初報[J].甘肅農(nóng)業(yè), 2010(9): 92-94.

[6] 房玉林, 孫偉, 張振文, 等. 葡萄砧木的研究和利用概況[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2010(7): 74-80.

[7] 鐘海霞, 艾爾買克·才卡斯木, 張付春, 等. 7個葡萄砧木根系的抗寒性研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 53(3): 429-436.

[8] 賀普超. 葡萄學(xué)[M]. 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1994.

[9] 張文娥, 王飛, 潘學(xué)軍. 葡萄種間雜交和自交后代抗寒性分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2009, 18(4): 290-294.

[10] 張劍俠, 吳行昶, 楊亞州. 葡萄種間雜種的抗寒性評價[J]. 北方園藝, 2014(13): 1-6.

[11] 張文娥, 王飛, 潘學(xué)軍. 應(yīng)用隸屬函數(shù)法綜合評價葡萄種間抗寒性[J]. 果樹學(xué)報, 2007, 24(6): 849-853.

[12] 玉蘇甫·阿不力提甫, 阿依古麗·鐵木兒, 帕提曼·阿布都熱合曼, 等. 利用隸屬函數(shù)法綜合評價梨砧木抗寒性[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 19(3): 121-129.

[13] ZHANG B Q, YANG L T, LI Y R. Physiological and biochemical characteristics related to cold resistance in sugarcane [J]. Sugar Tech, 2015, 17(1): 49-58.

[14] ZHANG J X, WU X CH, NIU R X, et al. Cold-resistance evaluation in 25 wild grape species [J]. Vitis, 2012, 51(4): 153-160.

[15] 張劍俠, 吳行昶, 楊亞州, 等. 引進(jìn)美國制汁葡萄品種抗寒性的綜合評價[J]. 北方園藝, 2011(24): 1-4.

[16] 郝再彬, 蒼晶, 徐仲. 植物生理實(shí)驗(yàn)[M]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社, 2004.

[17] 李玲. 植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 科學(xué)出版社, 2009.

[18] 曹建東, 陳佰鴻, 王利軍, 等. 葡萄抗寒性生理指標(biāo)篩選及其評價[J]. 西北植物學(xué)報, 2010, 30(11): 2232-2239.

[19] 盧精林, 李丹, 祁曉婷, 等. 低溫脅迫對葡萄枝條抗寒性的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(4): 36-43.

[20] 蘇李維, 李勝, 馬紹英, 等. 葡萄抗寒性綜合評價方法的建立[J]. 草業(yè)學(xué)報, 2015, 24(3): 70-79.

[21] 張彪, 毛娟, 陳佰鴻, 等. 葡萄抗寒性鑒定及綜合評價方法研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 49(6): 64-69.

[22] ZHANG Z K, ZHU Q G, HU M J, et al. Low-temperature conditioning induces chilling tolerance in stored mango fruit[J]. Food Chemistry, 2017, 219: 76-84.

Identification of cold resistance of grape rootstocks and their hybrids

LI Yanqi, SHEN Li, JIAN Junquan, ZHANG Jianxia*
(College of Horticulture, Northwest A & F University; State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas (Northwest A&F University); Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China, Ministry of Agriculture, Yangling 712100 Shaanxi)

Using the grape rootstock parents and their 81 progenies from four cross combinations including V. Riparia (♀) (V. riparia) ×Zuoshan 75097(V. amurensis) , Taishan 11(V. amurensis) × V. riparia Mcadams (V. riparia) , Taishan-11 (V. amurensis) × Constantia(V. rupestris) and 5BB (V. berlandieri × V. riparia) ×Heilongjiang seedling (V. amurensis) as experimental materials, four physiological indicators including relative conductivity, soluble protein, proline and soluble sugar of annual dormant grapevine branches were measured by artifi cial low temperature stress treatment. Then, comprehensive evaluation of the cold resistance level of rootstock hybrids was carried out by subordinate function method. The results showed that the hybrids of four combinations presented cold resistance separation and the resistance level of hybrids between both parents in general, but there existed the ultrahigh or ultra-low parent phenomenon. The cold resistance of grapevine presented a quantitatively inherited character of polygene controlled and tended to weak resistance direction. The hybrids with high cold resistance selected will be used for further breeding new stock varieties.

grapevine; rootstock; hybridization; cold resistance; identifi cation

S663.1；S603.4

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.03.005

2017-03-11

國家科技支撐計劃子課題（2013BAD02B04-06）

李妍琪（1993-），女，碩士生。E-mail: 876304785@qq.com

*通訊作者：張劍俠，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：葡萄種質(zhì)資源與生物技術(shù)。E-mail: zhangjx666@126.com