黃文武，楊 斌，廖莉萍

（井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 吉安 343000）

--臨床研究--

痛瀉要方聯(lián)合烏梅丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠HSP70和TLRs作用機(jī)制的研究

黃文武，楊 斌，廖莉萍

（井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 吉安 343000）

目的 研究痛瀉要方聯(lián)合烏梅丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠HSP70和TLRs的作用機(jī)制。方法 選取60只SD大鼠并利用TNBS（三硝基苯磺酸）灌腸法制作UC大鼠模型。比較各組大鼠的一般狀態(tài)、腸重系數(shù)、結(jié)腸損傷程度以及HSP70、TLR2和TLR4基因表達(dá)情況。結(jié)果 治療過(guò)程中，痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量組以及美沙拉嗪組的結(jié)腸炎癥狀都有不同程度的改善；痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量組以及美沙拉嗪組的腸重系數(shù)分別為（1.15±0.02）%、（1.01±0.01）%、（1.10±0.01）%和（1.17±0.01）%都顯著高于空白對(duì)照組的（0.85±0.01）%（P＜0.05），都明顯低于模型對(duì)照組的（1.29±0.03）%（P＜0.05）；經(jīng)痛瀉要方合烏梅丸中劑量組相比于其他三組的結(jié)腸損傷程度更?。慌c空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的HSP70、TLR2和TLR4基因表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比，痛瀉要方合烏梅丸中、低劑量組的HSP70、TLR2和TLR4基因表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 痛瀉要方聯(lián)合烏梅丸可能是通過(guò)抑制結(jié)腸粘膜組織的HSP70和TLRs基因表達(dá)來(lái)治療潰瘍性結(jié)腸炎的，其中，中劑量的痛瀉要方合烏梅丸的治療效果較好。

痛瀉要方聯(lián)合烏梅丸；潰瘍性結(jié)腸炎；大鼠HSP70和TLRs；作用機(jī)制

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因不明的慢性炎癥，病情易反復(fù)難以根治、復(fù)發(fā)率極高，故其病程一般都很長(zhǎng)[1-2]。如果其久治不愈不僅給患者的日常生活帶了不便，而且很有可能發(fā)生癌變，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[3-4]。本研究選取60只SD大鼠并采用TNBS灌腸法制作了UC大鼠模型，研究了痛瀉要方聯(lián)合烏梅丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠HSP70和TLRs的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物制備及劑量計(jì)算

（1）痛瀉要方合烏梅丸的制備：組成：烏梅15 g、細(xì)辛3 g、干姜5 g、桂枝5 g、附子5 g、蜀椒10 g、黃連10 g、人參15 g、當(dāng)歸10 g、黃柏15 g、防風(fēng)10 g、白術(shù)10 g、陳皮6 g、白芍10 g。方法：加10倍的水煎煮上述藥材1 h，過(guò)濾，用藥渣5倍的水煎煮藥渣1 h，過(guò)濾，合并濾液，濃縮成生藥2 g/mL的藥液。

（2）劑量計(jì)算：大鼠用量按成人用量的10倍計(jì)算，大鼠低、中、高劑量按照5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg的藥物用蒸餾水配成500 g/L、1 000 g/L、2 000 g/L。

（3）美沙拉嗪腸溶片（葵花藥業(yè)）：每片0.25 g，用量0.5 g/kg，藥物用蒸餾水配成50 g/L，大鼠灌腸給藥體積為10 mL/kg。

1.2 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的建立 采用TNBS灌腸法制作UC大鼠模型。取3個(gè)月齡的SD大鼠，飼養(yǎng)7天后，禁食24 h（不禁水），稱重，然后利用10%的水合氯醛（3.8 mL/kg）進(jìn)行腹腔麻醉，將一橡膠管由大鼠的肛門輕輕插入至約8～10 cm深，再推入0.2 mL/100 g體質(zhì)量的TNBS溶液（含2.5%TNBS和50%乙醇），灌注時(shí)間約5 s，最后為了盡量減少造模試劑的流出，將造模鼠倒置2 min后再放回籠內(nèi)。

1.3 大鼠分組和給藥方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量組、美沙拉嗪組6組，每組10只。造模后第3天，痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量組以及美沙拉嗪組同時(shí)開(kāi)始按照相應(yīng)的劑量給藥，空白對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水，1次/天，持續(xù)10天。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

（1）觀察各組大鼠在治療過(guò)程中精神、飲食、活動(dòng)等變化；完成后，處死大鼠，取結(jié)腸，洗凈糞便，濾紙吸干，稱量，計(jì)算，腸重系數(shù)=結(jié)腸重/體質(zhì)量×100%。

（2）取小段結(jié)腸并用10%的甲醛固定，用酒精脫水、石蠟包埋后切片，HE染色。用透射電鏡觀察各組大鼠的結(jié)腸超微結(jié)構(gòu)改變及結(jié)腸病理變化，評(píng)價(jià)其損傷程度。

（3）取炎癥改變較明顯的結(jié)腸，洗凈后制成勻漿，離心15 min，取上清液分裝，-20℃保存，按照鼠HSP70、TLR2和TLR4試劑說(shuō)明書來(lái)檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織HSP70、TLR2和TLR4的基因表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料的比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)及腸重系數(shù)比較 在模型建立后，所有大鼠出現(xiàn)了不同程度的發(fā)熱、精神不振、食欲銳減、懶動(dòng)、膿血便或粘液便等現(xiàn)象；而空白對(duì)照組的體溫、精神狀態(tài)、食欲、運(yùn)動(dòng)以及大小便等都正常。治療過(guò)程中，痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量組以及美沙拉嗪組的上述癥狀都有不同程度的改善；而模型對(duì)照組的上述癥狀更加嚴(yán)重。痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量組以及美沙拉嗪組的腸重系數(shù)分別為（1.15±0.02）%、（1.01±0.01）%、（1.10±0.01）%和（1.17±0.01）%都顯著高于空白對(duì)照組（0.85±0.01）%（P＜0.05），都明顯低于模型對(duì)照組（1.29±0.03）%（P＜0.05）。2.2各組大鼠的結(jié)腸損傷程度比較 空白對(duì)照組的結(jié)腸表面及腸管內(nèi)壁均光滑、沒(méi)有充血水腫現(xiàn)象、沒(méi)有與周圍組織粘連，易于分開(kāi)，無(wú)損傷。模型對(duì)照組的結(jié)腸管和管壁都有增粗，結(jié)腸有充血水腫癥狀，與胰腺以及周圍暢組織等粘連較嚴(yán)重，產(chǎn)生了大面積的黑色壞死面和黏膜腫脹充血的潰瘍面，并且黏膜皺襞減少。經(jīng)痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量以及美沙拉嗪治療后，模型對(duì)照組的結(jié)腸癥狀有所緩解，其中，經(jīng)痛瀉要方合烏梅丸中劑量組相比于其他三組的結(jié)腸損傷程度更小。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織HSP70、TLR2和TLR4的基因表達(dá)比較 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的HSP70、TLR2和TLR4基因表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比，痛瀉要方合烏梅丸中、低劑量組的HSP70、TLR2和TLR4基因表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；痛瀉要方合烏梅丸高劑量組和美沙拉嗪組的HSP70、TLR2和TLR4基因表達(dá)也有一定程度的降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織HSP70、TLR2和TLR4的基因表達(dá)比較（x±s，n=10）

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎的病因不明，是一種慢性炎癥型病，病情易反復(fù)、極難根治、復(fù)發(fā)率超高，故其病程一般都很長(zhǎng)[5]。久治不愈的潰瘍性結(jié)腸炎不僅給患者的日常生活帶了不便，而且很有可能發(fā)生癌變，徒增了家庭負(fù)擔(dān)[6-7]。烏梅丸在中醫(yī)治療潰瘍性結(jié)腸炎上的研究由來(lái)已久[8]，本文結(jié)合中醫(yī)療法，研究痛瀉要方聯(lián)合烏梅丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠HSP70和TLRs的作用機(jī)制。

本文研究表明，治療過(guò)程中，痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量組以及美沙拉嗪組大鼠的結(jié)腸炎癥狀都有不同程度的改善；痛瀉要方合烏梅丸低、中、高劑量組以及美沙拉嗪組大鼠的腸重系數(shù)分別為（1.15±0.02）%、（1.01±0.01）%、（1.10±0.01）%和（1.17±0.01）%都顯著高于空白對(duì)照組的（0.85±0.01）%，并且都明顯低于模型對(duì)照組的（1.29± 0.03）%（P＜0.05）；經(jīng)痛瀉要方合烏梅丸中劑量組相比于其他三組的結(jié)腸損傷程度更?。≒＜0.05）；與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的HSP70、TLR2和TLR4基因表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比，痛瀉要方合烏梅丸中、低劑量組的HSP70、TLR2和TLR4基因表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

綜上所述，痛瀉要方聯(lián)合烏梅丸可能是通過(guò)抑制結(jié)腸粘膜組織的HSP70和TLRs基因表達(dá)來(lái)治療潰瘍性結(jié)腸炎的，其中，中劑量的痛瀉要方合烏梅丸的治療效果較好。

[1]張倩倩,杜斌.炎癥性腸病的免疫學(xué)機(jī)制及中藥對(duì)其免疫學(xué)影響的綜述[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2015,21(24):91-94.

[2]程雪,董曉琳,嚴(yán)琴,等.中藥治療潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志,2014,30(1):69-71.

[3]汪悅，查安生.中醫(yī)藥對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制的干預(yù)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2015,33(2):394-396.

[4]趙青春,沈洪,程海波,等.清腸化濕方對(duì)HT-29細(xì)胞IL-6/ JAK2/STAT3的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2015,31(6):883-885.

[5]沈洪,劉智群,朱荃,等.清腸化濕方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎NF-κB/ Tolls通路的影響及其機(jī)制[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,33 (9):1216-1220.

[6]李斌,蔣寧,谷松.烏梅丸及其拆方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-6/ JAK/STAT3信號(hào)通路及結(jié)腸粘膜病理變化的影響[J].中藥藥理與臨床,2016,32(1):14-17.

[7]趙青春,沈洪,程海波,等.清腸化濕方對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠IL-6反式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響[J].世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2015,17(6):1249-1253.

[8]周婷婷,仝巧云,袁晉華.潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜SOCS2、SOCS3的表達(dá)及意義[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2015, 44(3):285-288.

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.04.007

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（20142BBG70119）