禹 樂,朱啟淦,楊立民,溫路生,魁國菊,潘羨心,孟加榕(解放軍第175醫(yī)院,廈門大學附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;通訊作者,E-mail:mengjiarong@sina.com)

胸水細胞塊EGFR基因突變檢測在非小細胞肺癌中的臨床意義

禹 樂,朱啟淦,楊立民,溫路生,魁國菊,潘羨心,孟加榕*
(解放軍第175醫(yī)院,廈門大學附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;*通訊作者,E-mail:mengjiarong@sina.com)

目的 探討應用實時熒光定量PCR方法檢測非小細胞肺癌陽性胸水細胞塊EGFR突變的臨床意義。 方法 收集具有組織標本作為對照的非小細胞肺癌陽性胸水60例,制作細胞塊,提取DNA,應用實時熒光定量PCR法同時對細胞塊和組織標本的EGFR第19外顯子(19-Del)和21外顯子(L858R)突變進行檢測,分析細胞塊與組織標本的EGFR突變率的差異。 結果 胸水細胞塊中EGFR突變率為35%(21/60),其中19-Del突變11例,L858R突變9例,19-Del和L858R雙突變1例;組織標本中EGFR突變率為36.7%(22/60),其中19-Del突變12例,L858R突變9例,19-Del和L858R雙突變1例。兩種標本的EGFR突變率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);胸水細胞塊EGFR突變類型與其對應的組織標本相一致。 結論 胸水細胞塊與組織樣本在EGFR基因突變上具有較高的一致性。

肺癌; 胸水; 細胞學; EGFR基因

目前,肺癌不僅在歐美等發(fā)達國家居惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率之首[1,2],也已成為我國城市居民死亡率首位的惡性腫瘤,且有逐年上升的趨勢[3]。近年來,隨著分子生物學技術的發(fā)展,對腫瘤發(fā)病機制從細胞、分子水平的進一步認識,小分子基因靶向治療藥物EGFR酪氨酸激酶抑制劑在非小細胞肺癌的治療中取得了顯著效果,有效地延長了患者的生命。但是肺癌缺乏典型的早期癥狀,70%以上的病人在確診時已屬晚期[4,5],失去了手術機會,從而難以獲得用于檢測EGFR基因突變的組織學標本,而胸腔積液是晚期肺癌患者常見的并發(fā)癥之一,標本獲取比較容易,本文探索使用非小細胞肺癌陽性胸水作為檢測EGFR基因突變的一種標本來源的可行性,進而為晚期伴有胸水的肺癌患者個體化靶向治療提供分子病理學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標本收集

收集2012-01～2016-10廈門大學附屬東南醫(yī)院具有組織學標本作為對照的非小細胞肺癌患者陽性胸水60例,其中男37例,女23例。

1.2 主要試劑與儀器

石蠟樣本DNA提取試劑盒、人類EGFR 基因突變熒光PCR檢測試劑盒均來自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司,免疫組化試劑來自福州邁新公司。Amoydx-Giraffe紫外分光光度計SMA4000;美國ABI 7500 Real Time PCR System 實時熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 胸水細胞學診斷 新鮮送檢的胸水充分震蕩后,取10 ml于試管中以2 000 r/min離心4 min,去除上清液,取沉淀均勻涂片,95%乙醇固定后HE染色,鏡檢選取見到腫瘤細胞或可疑腫瘤細胞的標本制作細胞塊。

1.3.2 胸水細胞塊制作 取胸水12 ml入15 ml尖底離心管,離心機2 000 r/min,離心5 min,棄上清,如細胞量過少,可重復上述步驟,加入4%中性甲醛6 ml,震蕩后靜置30 min,離心后棄上清,轉移沉淀至顯微鏡擦鏡紙上,包好后經(jīng)脫水浸蠟制成石蠟細胞塊。

1.3.3 細胞塊的病理診斷 按常規(guī)方法制作HE切片,根據(jù)診斷需要選擇免疫組化染色標記抗體,采用MaxVisionTM兩步法操作,待病理醫(yī)生診斷后,選取診斷為非小細胞肺癌的細胞塊。

1.3.4 石蠟細胞塊與組織標本DNA的提取 以6 μm的厚度分別對細胞塊與組織標本進行切片,并各取10張至1.5 ml離心管中,加入二甲苯1 ml,振蕩混勻10 s,14 000 r/min離心5 min,去上清;加入1 ml無水乙醇,振蕩混勻10 s,14 000 r/min離心5 min,去上清,待乙醇充分揮發(fā)后,按石蠟樣本DNA分離試劑盒(離心柱型)操作步驟進行操作獲取樣品DNA提取液。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測EGFR基因突變 應用紫外分光光度計檢測 DNA樣品濃度與質量,將DNA濃度稀釋至2 ng/μl,取23.5 μl 已稀釋為2 ng/μl待檢DNA樣品,加入1.5 μl Taq酶,將混合好的DNA樣品依次取5 μl加入8連管PCR反應體系中,設立陰性、陽性對照,進入ABI7900實時熒光定量PCR儀中反應。循環(huán)條件為95 ℃ 5 min 1個循環(huán);95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s 15個循環(huán);93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s 31個循環(huán)。依據(jù)操作說明書中提供的兩種突變類型的陽性范圍Ct值進行結果判讀。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 15.0分析軟件進行數(shù)據(jù)分析,應用χ2檢驗,比較實時熒光定量PCR方法檢測胸水細胞塊與組織學標本的EGFR突變率差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DNA含量、質量比較

所有樣本所獲取DNA樣本濃度均大于2 ng/μl,OD260/OD280比值范圍在1.6-2.2之間,OD260/OD230比值大于1.6,均符合實時熒光定量PCR要求,胸水細胞塊與對應的組織標本DNA提取液的質量相近,DNA的濃度普遍低于組織標本(見圖1)。

A．胸水細胞塊DNA的質量和濃度B．組織標本DNA的質量和濃度圖1 胸水細胞塊與其對應的組織標本DNA提取液的質量和濃度對比Figure1 ComparisonofmassandconcentrationofDNAextractfromcellblockandtissuespecimen

2.2 EGFR基因突變結果比較

統(tǒng)計結果顯示:60例胸水細胞塊發(fā)生EGFR基因突變的為21例(35%),其中19外顯子(19-Del)突變11例,21外顯子(L858R)突變9例,19外顯子(19-Del)和2l外顯子(L858R)雙突變1例;60例組織標本中發(fā)生EGFR基因突變的為22例(36.7%),其中19外顯子(19-Del)突變12例,2l外顯子(L858R)突變9例,19外顯子(19-Del)和21外顯子(L858R)雙突變1例。兩種標本中EGFR總突變率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表1)。

表1 胸水細胞塊與組織標本的EGFR突變結果的比較

Table 1 Comparison of EGFR mutation results between pleural cell block and tissue specimens

標本類型n19Del突變(例)L858R突變(例)19Del和L858R雙突變(例)突變率(%) 細胞塊60119135 0 組織標本60129136 7

2.3 EGFR基因突變類型結果

除1例組織標本檢測結果顯示為19Del突變而對應的細胞塊檢測結果為陰性外,其余的21例細胞塊EGFR基因突變類型均與其組織標本完全一致(見圖2)。

A．L858R突變類型(細胞塊) B．L858R突變類型(組織標本) C．19?Del突變類型(細胞塊) D．19?Del突變類型(組織標本) E．19?Del和L858R雙突變類型(細胞塊) F．19?Del和L858R雙突變類型(組織標本)圖2 胸水細胞塊EGFR突變與其對應的組織標本突變類型一致Figure2 TheEGFRmutationtypesinpleuraleffusionwerethesameasthetissuespecimen

3 討論

非小細胞肺癌的表皮生長因子受體(EGFR)基因突變情況是使用酪氨酸激酶抑制劑治療的關鍵指標,然而臨床中大部分肺癌患者就診時已經(jīng)是晚期,失去了手術機會,用于檢測EGFR基因突變腫瘤組織獲得難度較大。晚期肺癌患者常并發(fā)胸腔積液,15%的初診患者及10%-50%的患者病程中均出現(xiàn)這一癥狀,尤其是外周型腺癌患者[6]。近年來,國內孟加榕等[7，8]嘗試使用胸水的上清液、沉淀等不同成分提取DNA,應用高分辨率熔解曲線(HRM)技術檢測EGFR基因突變情況,證實胸水的上清液、沉淀與腫瘤組織的EGFR基因突變情況具有較高一致性。但HRM是一門新興的技術,國內尚未大范圍推廣應用。實時熒光定量PCR技術具有敏感度高、特異性高、技術成熟的特點,現(xiàn)已廣泛應用于各種基因突變的檢測,但目前國內對應用實時熒光定量PCR檢測胸水細胞塊EGFR基因突變的研究卻鮮有報道。

有效地提取腫瘤細胞DNA是進行分子檢測的前提,我們對本組研究所獲取的DNA樣本進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),同一患者的胸水細胞塊提取的DNA液質量與組織標本相近,濃度卻普遍略低。這可能是由于胸水中的腫瘤細胞數(shù)量相較于組織標本中的偏少,在制作細胞塊的過程中又經(jīng)過福爾馬林溶液的固定處理,造成核酸與蛋白質之間發(fā)生交聯(lián)反應,增加了核酸提取的難度,浸蠟和包埋的過程會進一步造成核酸片段化,加劇核酸的甲基化修飾,降低了提取DNA的獲得率。檢測結果顯示血性胸水細胞塊的DNA提取液的濃度相較于其組織標本差距最為明顯。除上述原因以外,還有可能是因為血性胸水中含有大量的紅細胞,在離心后占據(jù)了沉淀絕大部分,切取相同數(shù)量的蠟片時腫瘤細胞含量就會相對偏少,導致在相同條件下提取的DNA濃度偏低。但所有待檢樣本的DNA提取原液均需要稀釋到濃度為2 ng/μl的工作液,這樣可以消除DNA提取原液濃度的差異所帶來的影響?？傮w上所有樣本DNA提取液的質量和濃度均符合實時熒光定量PCR檢測要求,同時也印證了郭以河等[9，10]所介紹的胸水腫瘤細胞DNA提取的方法是切實可行的,實驗的重復性和所獲得的DNA提取液的質量是有保證的,從而為下一步應用實時熒光定量PCR檢測EGFR基因突變提供了必要的前提條件。

目前已發(fā)現(xiàn)不下于30種EGFR基因突變,現(xiàn)有的資料[11-15]表明,EGFR總突變率在20%-45%,其中外顯子19、21突變占到EGFR總突變率的85%-90%。從本次應用實時熒光定量PCR檢測結果顯示,EGFR外顯子19、21發(fā)生突變率為35%,這與上述相關報道較一致。除1例組織標本檢測結果顯示為19-Del突變而對應的細胞塊檢測結果為陰性外,其余的19例胸水細胞塊EGFR基因突變的數(shù)據(jù)和組織學標本完全一致,突變均為21例,其中19外顯子(19-Del)突變11例,2l外顯子(L858R)突變9例,雙突變1例,且其EGFR基因突變類型均與其對應的組織標本一致,經(jīng)統(tǒng)計學分析,胸水細胞塊與組織標本EGFR基因總突變率差異無顯著性意義(P>0.05)。經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn)與組織標本檢測結果不符的為1例血性胸水,原因可能是血性胸水中含有大量的紅細胞、中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、間皮等細胞,那么腫瘤細胞的含量就會相對較少,這樣就會使我們所獲得的DNA提取液中的野生DNA含量過高,腫瘤DNA含量低于總量的1%,超出了檢測試劑盒的最低檢測能力范圍,從而出現(xiàn)DNA提取液的濃度和質量均符合檢測標準,但檢測結果卻可能出現(xiàn)陰性的現(xiàn)象。

近年來,隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展,應用小分子基因靶向治療藥物酪氨酸激酶抑制劑治療NSCLC患者,可以有效地改善患者的生活質量,并延長了患者的生命[16],EGFR基因突變的檢測是指導應用酪氨酸激酶抑制劑治療的必要前提[17]。目前,我國NSCLC患者的EGFR基因突變檢測率不高,難以獲得滿意的檢測標本是其主要原因之一。臨床中推薦使用腫瘤組織標本進行EGFR突變檢測,但是對于心肺功能較差或已經(jīng)失去手術機會的晚期患者組織標本獲取往往比較困難,胸腔積液是晚期NSCLC患者常見的并發(fā)癥,獲取胸水標本比較容易,并且創(chuàng)傷較小,容易被患者接受。本研究結果顯示,應用實時熒光定量PCR檢測胸水EGFR基因突變的結果與組織標本檢測結果具有較高的一致性。然而由于本研究的時間跨度比較長,胸水細胞塊的EGFR基因突變檢測是集中后分批進行的,其間可能存在胸水標本的類型、試劑的批間差異和人為操作等因素的影響,致使此種方法應用于臨床還有待于進一步研究。后期將繼續(xù)完善不同類型胸水細胞塊的制作方法,并擴大檢測樣本量,獲得更多數(shù)據(jù)資料,以拓寬了解非小細胞肺癌患者EGFR基因突變情況的有效途徑,以期為臨床應用EGFR酪氨酸激酶受體抑制劑治療NSCLC提供一定的參考價值。

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Clinical significance of EGFR gene mutation in pleural effusion cell blocks in non-small cell lung cancer

YU Le,ZHU Qigan,YANG Limin,WEN Lusheng,KUI Guoju,PAN Xianxin,MENG Jiarong*
(DepartmentofPathology,175thHospitalofPLA,DongnanAffiliatedHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou363000,China;*Correspondingauthor,E-mail:mengjiarong@sina.com)

ObjectiveTo explore the clinical significance of EGFR mutations in positive pleural effusion cell block of non-small cell lung cancer by RT-PCR.MethodsSixty cases of biopsy tissue specimens and pleural effusion from non-small cell lung cancer patients were collected.Cell blocks of pleural effusion specimens were made.DNA was extracted to detect EGFR mutation in exon 19 (19-Del) and exon 21 (L858R) in biopsy tissue specimens and pleural effusion by RT-PCR.The mutation rate of EGFR was analyzed between pleural effusion and biopsy tissue specimens.ResultsThe mutation rate of EGFR in pleural effusions was 35%(21/60),including 11 cases of 19-Del mutation，9 cases of L858R mutation,and 1 case of 19-Del and L858R double mutations.The mutation rate of EGFR in biopsy tissue specimens was 36.7%(22/60),including 12 cases of 19-Del mutation,9 cases of L858R mutation,and 1 case of 19-Del and L858R double mutations.The rates of EGFR mutation was not significantly different between the two types of specimens(P>0.05).The EGFR mutation types in pleural effusion were the same as that of the tissue specimen.ConclusionPleural effusion cell block and biopsy tissue specimen show high consistency in EGFR mutation.

lung cancer; pleural effusion; cytology; EGFR gene

福建漳州市科技局科研資助項目(z2011066);南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助項目(10MA076);解放軍第175醫(yī)院院內青年苗圃基金資助項目(16Y020)

禹樂,男,1984-07生,學士,主管技師,E-mail:422245066@qq.com

2016-12-24

R734.2

A

1007-6611(2017)05-0462-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.013