余乃通，周啟林，羅志文，胡福初，張治禮，劉志昕

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹(shù)研究所/海南省熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571100）

仙人掌總RNA提取方法的改進(jìn)與分析

余乃通1，周啟林1，羅志文2，胡福初2，張治禮2，劉志昕1

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹(shù)研究所/海南省熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571100）

利用亞硫酸鈉分別與TRIzol試劑、RNA plant plus Reagent試劑、BioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑、艾德萊EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑和OMEGA Plant RNA試劑結(jié)合的方法，均可獲得高質(zhì)量的仙人掌莖總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR結(jié)果顯示，5種方法提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄后均能特異性擴(kuò)增到matK基因。使用TRIzol試劑盒、RNA plant plus Reagent試劑盒和艾德萊EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取RNA質(zhì)量相對(duì)較高，在cDNA以1∶100稀釋時(shí)能檢測(cè)到matK基因；而使用BioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑盒或OMEGA Plant RNA試劑盒時(shí)，靈敏度稍低，在cDNA以1∶10稀釋時(shí)，能檢測(cè)到目的基因。利用亞硫酸鈉結(jié)合不同植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行比較研究，為后續(xù)制備仙人掌莖高質(zhì)量cDNA文庫(kù)及其分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

仙人掌；RNA提?。籖T-PCR；靈敏度檢測(cè)

仙人掌（Opuntia stricta （Haw.） Haw. var. dillenii （Ker-Gawl.） Benson）是仙人掌科仙人掌屬的一種常見(jiàn)觀賞性雙子葉植物，別名有觀音掌、霸王、火掌等。仙人掌屬多年生植物，肉質(zhì)灌木，呈莖柱狀、球狀或扁平狀，肉質(zhì)帶刺，葉退化［1］。仙人掌具有喜光、耐熱、耐旱和耐瘠等特點(diǎn)，其最適生長(zhǎng)溫度為20～30℃，主要生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)主要分布在南方各地區(qū)，如云南、貴州、四川、廣東、海南等省份。

仙人掌可用作園藝觀賞植物［2］、可藥用［3］、可食用［4-5］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的仙人掌提取物被分離出來(lái)，各提取物質(zhì)的藥理作用也被人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。但是，仙人掌病害的發(fā)生及產(chǎn)生的各種黃化、枯死、腐爛、菌斑及其產(chǎn)生的毒害性代謝物是制約仙人掌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的首要因素之一。因此，對(duì)仙人掌及其病原的檢測(cè)提出很高的要求，其中的關(guān)鍵之一是提取高質(zhì)量總RNA，為構(gòu)建cDNA文庫(kù)、RTPCR、分子雜交和基因克隆等分子生物學(xué)研究提供基本保障。

用于植物總RNA提取的方法已有大量研究［6-8］和報(bào)道［9-10］。熱帶、亞熱帶植物組織含有豐富的多糖、多酚等次生物質(zhì)，氧化后能與RNA不可逆的結(jié)合，是較難提取高質(zhì)量RNA的主要限制因素之一。而亞硫酸鈉可作為還原劑，在植物組織中添加微量就能很好的防止植物體內(nèi)多酚與空氣中的氧氣氧化。本試驗(yàn)通過(guò)亞硫酸鈉分別結(jié)合5種不同公司的試劑盒產(chǎn)品，即TRIzol試劑盒、RNA plant plus Reagent試劑盒、BioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、艾德萊EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒和OMEGA Plant RNA試劑盒，對(duì)仙人掌莖組織樣品進(jìn)行總RNA提取，電泳結(jié)果表明，亞硫酸鈉結(jié)合各種試劑盒產(chǎn)品均能很好的從仙人掌莖組織樣品中提取高質(zhì)量總RNA（雖然有差異）；利用仙人掌的matK基因進(jìn)行RT-PCR和靈敏度檢測(cè)也證明這一點(diǎn)。本研究利用亞硫酸鈉結(jié)合不同植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行的比較研究，為后續(xù)制備仙人掌高質(zhì)量cDNA文庫(kù)及其分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

仙人掌倒卵形部位（莖）采自海南省?？谑谐俏麈?zhèn)，于-80℃冰箱保存。

主要試劑：亞硫酸鈉購(gòu)自廣東西隴化工股份有限公司；TRIzol Reagent （Invitrogen），RNA plant Reagent（天根），BioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（百泰克），EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊），Plant RNA Kit （OMEGA）分別購(gòu)自不同生物試劑公司；反轉(zhuǎn)錄酶Easy script RT購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；2×HSTM Mix購(gòu)自艾德萊生物科技有限公司；所用的水為DEPC處理水；所用的離心管、槍頭均為已去RNA酶的Axygen進(jìn)口產(chǎn)品，研缽經(jīng)180℃高溫處理6 h以上。

1.2 仙人掌總RNA提取方法

1.2.1 TRIzol方法 稱取0.5～1.0 g仙人掌莖樣品，加入微量固體亞硫酸鈉，于液氮中研磨成粉末，置于1.5 mL的離心管中；向粉末中加入1 mL TRIzol，搖勻，室溫放置5 min；4℃條件下12000 r/min離心5 min，取上清液到新的1.5 mL離心管中，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min；4℃條件下12000 r/min離心15 min，將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL的離心管中，加入500 μL的異丙醇，搖勻，室溫放置10 min；4℃條件下12000 r/min 離心10 min，棄上清液，加1 mL 70%酒精洗滌沉淀；4℃條件下12000 r/min 離心5 min，棄上清液，干燥后加40 μL DEPC水溶解。

1.2.2 天根RNA plus Reagent法 稱取0.5～1.0 g仙人掌莖樣品，加入微量固體亞硫酸鈉，于液氮中研磨成粉末，提取方法參照其說(shuō)明書，最后用40 μL DEPC水溶解。

1.2.3 BioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑盒 稱取0.5～1.0 g仙人掌莖樣品，加入微量固體亞硫酸鈉，于液氮中研磨成粉末，提取方法參照其說(shuō)明書，最后用40 μL DEPC水溶解。

1.2.4 EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒 稱取0.5～1.0 g仙人掌莖樣品，加入微量固體亞硫酸鈉，于液氮中研磨成粉末，提取方法參照其說(shuō)明書，最后用40 μL DEPC水溶解。

1.2.5 OMEGA Plant RNA試劑盒 稱取0.5～1.0 g仙人掌莖樣品，加入微量固體亞硫酸鈉，于液氮中研磨成粉末，提取方法參照其說(shuō)明書，最后用40 μL DEPC水溶解。

1.3 cDNA的合成

利用5種試劑盒提取的仙人掌總RNA為模板，分別進(jìn)行第一條鏈cDNA的合成：在0.2 mL去RNA酶的離心管中加入Random primer 2 μL、dNTPs 2 μL、Oligo（dT）18primer 2 μL、5 ×Es RT Buffer 4 μL、反轉(zhuǎn)錄酶Easy script RT 0.5 μL、RNase-Free H2O 4.5 μL、總RNA 5 μL，混勻，瞬間離心；42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min反應(yīng)后，冰上放置3 min；然后瞬間離心，cDNA樣品于-20℃冰箱保存。

1.4 RT-PCR及靈敏度檢測(cè)

根據(jù)已報(bào)道的擴(kuò)增仙人掌matK基因引物matK-F和matK-R［11］，對(duì)5種試劑盒（結(jié)合亞硫酸鈉）制備的cDNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)及靈敏度檢測(cè)。取cDNA產(chǎn)物1 μL作為模板，上游和下游引物各0.5 μL （10 μM），2×HSTM Mix 10 μL，加滅菌去離子水至20 μL，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s；72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

對(duì)上述5種試劑盒制備的cDNA分別以10的倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋，包括原液100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。取各稀釋濃度溶液1 μL作為模板，分別以matK-F和matK-R引物對(duì)它們進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行靈敏度分析。擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件均與上面一致，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析5種試劑盒制備的cDNA靈敏度的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙人掌莖總RNA提取及凝膠電泳分析

取5 μL總RNA樣品與1 μL核酸染料混勻，在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，5種試劑盒制備的仙人掌總RNA點(diǎn)樣孔都比較干凈，沒(méi)有亮斑，說(shuō)明這些總RNA都沒(méi)有明顯的蛋白質(zhì)和多糖污染；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這些總RNA也無(wú)明顯的DNA污染。比較圖1的5個(gè)電泳圖，發(fā)現(xiàn)RNA plant Reagent試劑盒（圖1B）和BioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（圖1C）提取的總RNA條帶相對(duì)較亮和清晰，28 S條帶明顯比18 S條帶亮，且條帶之間沒(méi)有彌散現(xiàn)象，說(shuō)明這兩種試劑盒提取的質(zhì)量較好。TRIzol試劑盒（圖1A）、EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒（圖1D）和OMEGA Plant RNA試劑盒（圖1E）提取的仙人掌總RNA條帶亮度相對(duì)較弱，28 S條帶和18 S條帶亮度基本一致，濃度相對(duì)較低，并且圖1E出現(xiàn)輕微彌散的現(xiàn)象。不使用亞硫酸鈉結(jié)合試劑盒的方法提取仙人掌總RNA，結(jié)果見(jiàn)圖2，從圖2看出總RNA提取質(zhì)量較差。

圖1 利用亞硫酸鈉結(jié)合5種植物總RNA提取試劑盒制備仙人掌總RNA

圖2 不使用亞硫酸鈉結(jié)合5種植物總RNA提取試劑盒制備仙人掌總RNA

2.2 RT-PCR檢測(cè)

根據(jù)仙人掌內(nèi)標(biāo)基因matK的保守引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，是驗(yàn)證仙人掌RNA質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一。將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖3）顯示，利用亞硫酸鈉結(jié)合5種植物總RNA提取試劑盒的方法，均能成功擴(kuò)增仙人掌matK基因，條帶特異，與預(yù)期大小一致。

圖3 不同總RNA提取方法的RT-PCR檢測(cè)

2.3 靈敏度檢測(cè)

將5種試劑盒制備的、不同稀釋度的cDNA分別進(jìn)行RT-PCR靈敏度檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。比較發(fā)現(xiàn)，5種試劑盒來(lái)源的cDNA樣品，其PCR的靈敏度是存在差異的。比較圖4A～E，發(fā)現(xiàn)RNA plant Reagent試劑盒來(lái)源的cDNA PCR靈敏度檢測(cè)最高（圖4B），可以達(dá)到10-4；其次為TRIzol試劑盒和艾德萊EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒，其cDNA PCR靈敏度檢測(cè)可以達(dá)到10-3；而B(niǎo)ioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑盒和OMEGA Plant RNA試劑盒來(lái)源的cDNA PCR靈敏度最低，只有10-2（表1）。

表1 仙人掌提取的總RNA質(zhì)量和靈敏度相關(guān)性分析

圖4 不同RNA提取方法的仙人掌cDNA靈敏度檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

植物組織體內(nèi)核酸的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，大多數(shù)的植物特別是熱帶、亞熱帶植物組織中含有豐富的多糖、多酚等次生物質(zhì)，氧化后能與RNA不可逆的結(jié)合，因此很難從其組織中提取高質(zhì)量的RNA［12］。目前，報(bào)道植物總RNA的提取方法有很多，不同公司來(lái)源的試劑盒也多種多樣。但是，多糖多酚氧化后與RNA不可逆結(jié)合仍然制約著植物高質(zhì)量RNA的制備。由于不同植物自身特點(diǎn)的差異，一種RNA提取方法難以適用于多種植物，同種植物不同組織的RNA提取方法也大不相同［13-17］。所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)亞硫酸鈉分別結(jié)合不同公司的試劑盒產(chǎn)品：即TRIzol試劑盒、RNA plant plus Reagent試劑盒、BioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、艾德萊EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒和OMEGA Plant RNA試劑盒等5種方法分別對(duì)仙人掌組織樣品進(jìn)行總RNA提取，結(jié)果表明，亞硫酸鈉結(jié)合各種試劑盒產(chǎn)品均能很好地從仙人掌組織樣品中提取總RNA（雖有差異），利用matK基因進(jìn)行RT-PCR和靈敏度檢測(cè)也證明這一點(diǎn)。

TRIzol法是比較保守和常用的植物總RNA提取方法，該法適合多種植物，應(yīng)用較為廣泛，是此類實(shí)驗(yàn)的首選；而其他4種試劑盒產(chǎn)品也是國(guó)內(nèi)科研工作者比較常規(guī)的方法。前期實(shí)驗(yàn)表明，不添加亞硫酸鈉的情況下，對(duì)仙人掌組織樣品進(jìn)行液氮研磨，RNA沉淀變?yōu)楹稚?，說(shuō)明多糖多酚氧化后與RNA結(jié)合。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在研磨前添加微量的亞硫酸鈉，能預(yù)防植物體內(nèi)代謝物質(zhì)氧化，大量減少多糖多酚、蛋白質(zhì)和DNA等污染，從而保證獲得高質(zhì)量的植物總RNA。

本研究還發(fā)現(xiàn)，提取的仙人掌莖總RNA質(zhì)量與matK基因RT-PCR的靈敏度整體上呈相關(guān)性。雖然BioTeke多糖多酚植物總RNA提取試劑盒制備的總RNA質(zhì)量較高，但是matK基因的靈敏度僅為10-2，可能原因是RNA中含有內(nèi)源或外源RNaseA污染。其他4種試劑盒制備的總RNA質(zhì)量與靈敏度呈相關(guān)性。本研究利用亞硫酸鈉結(jié)合不同植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行比較研究，為后續(xù)制備仙人掌高質(zhì)量cDNA文庫(kù)及其分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

［1］中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書編輯部.中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書—— 生物學(xué)卷［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991.

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Improvement and analysis of cactus total RNA extraction method

YU Nai-tong1，ZHOU Qi-lin1，LUO Zhi-wen2，HU Fu-chu2，ZHANG Zhi-li2，LIU Zhi-xin1
（1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou 571101，China；2 Institute of Tropical Fruit Tree，Hainan Academy of Agricultural Science，Hainan Key Laboratory of Tropical Fruit Biology，Haikou 571100，China）

High-quality total RNAs of cactus stem were obtained by using Na2SO3with each of TRIzol reagent，RNA plant plus reagent，BioTeke total RNA extraction reagent，EASY spin Plus plant RNA extraction reagent（Aidlab） or OMEGA plant RNA reagent. The cDNA RT-PCR and specific detection results showed that matK gene fragments were amplified by five total RNA extraction methods. The cDNAs that reverse transcribed from the TRIzol reagent，RNA Plant Plus Reagent，and EASY spin Plus Plant RNA Extraction reagent （Aidlab） were relatively high，as the sensitivity PCR of cDNA highest dilution to 1∶100. While the cDNAs that reverse transcribed from BioTeke total RNA extraction reagent and OMEGA plant RNA reagent were relatively low，as the sensitivity RTPCR indicated the cDNA highest dilution to 1∶10. In this study，Na2SO3combined with different plant total RNA extraction kits to prepare high quality of RNA is the key of cactus stem cDNA library preparation and molecular biology.

cactus；RNA extraction；RT-PCR；sensitivity detection

S682.33

A

1004-874X（2017）03-0075-05

2017-01-19

海南省熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（KFZX2017002）；海南省自然科學(xué)基金（20153130）

余乃通（1985-），男，在職博士生，助理研究員，E-mail：yunaitong@163.com

劉志昕（1963-），男，博士，研究員，E-mail：liuzhixin@itbb.org.cn

余乃通，周啟林，羅志文，等.仙人掌總RNA提取方法的改進(jìn)與分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（3）：75-79.